抗菌促成骨医用纳米多孔钽铜合金及其制备方法

文献发布时间：2023-06-19 18:46:07

技术领域

本发明属于生物医用金属材料领域，特别适用于人体骨组织缺损的填充材料技术领域，具体为抗菌促成骨医用纳米多孔钽铜合金及其制备方法。

背景技术

金属钽以其优良的化学稳定性、优异的生物学特性和独特的结构性质已经引起生物医学界的广泛关注。与现有医用金属材料相比，钽主要具有两方面的明显优势：(1)钽具有更为优异的化学稳定性和耐蚀性能，常温下，钽与盐酸、浓硝酸甚至“王水”都不发生化学反应，一般的无机盐对钽均没有腐蚀作用；(2)钽的生物相容性极佳，植入一段时间后，生物组织易在钽表面上生长，所以钽又有“亲生物金属”之称。

然而，由于钽本身不具备生物活性，植入后容易引发细菌感染，从而诱发植入体炎症和早期松动等一系列并发症，最终导致植入失败。另外，临床使用的实体植入物无论是强度还是弹性模量均远高于人体骨骼，会发生“应力遮挡效应”，导致应力遮挡区内的骨骼发生骨改建现象，进而使骨密度下降及强度下降，摘除骨板后容易发生二次骨折。

现有技术的不足在于：目前还没有自身具有抗细菌感染，并兼具优异生物相容性的低模量医用金属植入材料。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了抗菌促成骨医用纳米多孔钽铜合金及其制备方法，以解决现有金属植入材料自身不具有既能抗菌又能促进骨整合的问题。将一种具有优良化学稳定性、生物学特性和独特结构性质的金属钽与具有优良抗菌性能的金属铜复合加工成为多孔状态，模拟人骨的自然结构将大大提高植入体与骨组织的机械结合，从而增加植入物的长期稳定性。所制备的纳米多孔钽铜合金的弹性模量小于实体，而更加适应人骨环境，减少应力遮挡效应。同时，使金属植入物本身具有抗菌性可以有效地解决金属表面的细菌感染问题，提高植入成功率，有望改善患者生活质量具有重要意义。

为实现上述目的，本发明具体提供如下技术方案：

在医用金属钽(Ta)中添加适量的金属铜元素(Cu)，通过机械合金化、添加造孔剂和放电等离子烧结体快速烧结，制备具有多孔并且铜以纳米颗粒形式存在的多孔钽铜合金。孔径为：400nm-600nm，其化学成分为质量百分比：铜(Cu)含量区间为1-3wt.％，余量为钽(Ta)，该合金中其它杂质元素含量应符合医用钽基合金国家标准中的相应要求，该合金具有显著的抗菌性能，且兼具优异的生物相容性，不仅有望降低钽金属植入器件在临床使用中周围组织的感染发生率，还能显著提高组织与钽金属器件的生物相容性，进而提升了钽金属植入器件的医疗功效与成功率。

在本发明的具有抗菌功能的医用纳米多孔钽铜合金的成分设计中，铜是本发明所述医用纳米多孔钽铜合金中最重要的合金元素，这是保证医用纳米多孔钽铜合金具有抗菌功能并兼具优异生物相容性的必要条件，也是本发明的主要创新点之一。本发明是在医用多孔钽金属中加入适量的铜元素，且铜以纳米形式存在，以保证微量铜离子能够从钽合金表面持久释放，从而赋予钽金属抗菌功能。如果铜含量相对较低，钽铜合金不能释放足量的铜离子，会降低钽合金的抗菌功能。如果铜含量相对过高，则会导致钽铜合金释放过多的铜离子，会产生毒性，进而对其生物安全性产生负面影响。通过机械合金化能够显著降低原始铜粉与钽粉的粒径尺寸，将粉末粒子球磨至纳米量级，研究表明，纳米级的富铜相能够加速其铜离子释放，因此能够在低含量下依旧具备良好的抗菌效果和促成骨效果，只有在本发明提供的Cu含量的范围内，纳米多孔钽铜合金才能同时保证优异的抗菌性能与生物相容性能。

在本发明的具有抗菌功能的医用纳米多孔钽铜合金的多孔结构制备过程中，选择以球型硬脂酸为造孔剂，制备出其医用纳米多孔钽铜合金的孔径为：400nm-600nm，孔隙率为：70％-80％，也是本发明的另一个创新点。所制备的医用纳米钽铜合金的孔径在400nm-600nm，孔隙率在70％-80％能够很好的促进骨细胞粘附生长，为骨细胞生长提供了足够的三维生长空间，最为重要的是能够很好的平衡力学性能与孔隙之间的关系，能更好的模拟人体骨组织。如果孔隙率及孔径相对较低，人体微环境中的营养物质就很难进入材料中，进而不利于骨细胞粘附生长；如果孔隙率及孔径相对过高，则会导致材料力学性能不足，进而不利于骨组织愈合，只有在本发明制备的孔隙率及孔径范围内，医用纳米多孔钽铜合金才能更好的促进骨整合。

在本发明还提供了所述医用纳米多孔钽铜合金的制备方法，制备过程包括机械合金化、添加造孔剂和放电等离子烧结三个步骤：

步骤1，机械合金化：以纯度≥99.95％的钽粉和纯度≥99.90％的铜粉为原料，按照合金的化学成分质量百分比，将原料粉末放入机械合金化机中进行机械混合，球磨时间为18-36h，球磨转数为200-300r/min，将原料粉末粒径控制到纳米级；

步骤2，添加造孔剂：向球磨后的原料粉末中添加球型硬脂酸，机械混匀，其中，球型硬脂酸占原料粉末的质量百分比为10％-50％；

步骤3，放电等离子烧结：将步骤2得到的混合粉末置于模具中，置于放电等离子烧结炉中进行烧结；烧结压力为30-40MPa，烧结温度为800-1000℃，保温时间为3-5min，烧结速度为100℃/min，真空度小于6MPa，得到抗菌促成骨医用纳米多孔钽铜合金。

上述步骤1中优选工艺为：球磨过程中，球料质量比为15：1，控制剂为体积分数为5％的无水乙醇，球磨珠为氧化锆或硬质合金。

上述步骤3中优选工艺为：将步骤2得到的混合粉末置于模具中，先在2-4MPa的压力下压至1min，然后将模具置于放电等离子烧结炉中进行烧结。

在本发明的具有抗菌功能的医用纳米多孔钽铜合金的多孔结构设计中，采用了不同含量的硬脂酸为造孔剂来制备的医用纳米多孔钽铜合金，所制备的多孔结构接近球形、边缘圆整，孔隙率可控，具有优良的力学性能，所选用的球型硬脂酸是本发明所述医用纳米多孔钽铜合金中最重要的造孔剂，这是保证医用纳米钽铜合金具有多孔结构的必要条件，这也是本发明的另一个创新点之一。本发明是通过在医用钽铜金属中加入适量的球型硬脂酸，以保证所制备的医用纳米多孔钽铜合金的孔隙率及孔径更好的模拟人体骨，减少植入所产生的应力屏蔽效应以及更好的与人体骨相结合。如果所添加的硬脂酸含量相对较低，其孔隙率及孔径不能很好的模拟人体骨的孔隙率及孔径，进而会影响所制备材的料的整体性能。如果所添加的硬脂酸含量相对过高，孔径增大，则会导致孔径与力学性能无法达到相对平衡，只有在本发明所提供的硬脂酸含量的范围内，纳米钽铜合金才能同时保证具有与人体骨相匹配的多孔结构。特别指出的是，本发明所添加的造孔剂是与机械合金化后制备的纳米钽铜粉末混合，通过放电等离子烧结来制备。

本发明采用粉末冶金的方法制备具有抗菌功能的医用纳米多孔钽铜合金，放电等离子烧结的方法是一种优选的粉末冶金制备医用纳米多孔钽铜合金的制备方法，而该方法就涉及制备参数如烧结温度，保温时间，烧结压强，真空度，烧结速度等的优化过程。比如，烧结温度过低，则就有可能造成材料致密度降低，进而造成材料力学性能和耐蚀性能不足的问题，烧结温度过高，还会使得钽合金中低熔点富铜相液化流出，严重破坏材料的整体性能。同时，保温时间较少和烧结压强过低，均会使得钽铜合金的孔隙率增加，密度降低，从而影响材料的使用性能，保温时间过长和烧结压强较大，并不会大幅提高材料的相关性能，同时还会增加设备的技术要求和制备成本。因此，只有在本发明提供的合适的制备工艺参数下，医用多孔钽铜合金才能充分发挥其优异的抗菌功能和促成骨性能。

本发明所述具有抗菌和促成骨功能的医用纳米多孔钽铜合金主要用于骨科医学临床领域中使用的各类纳米多孔钽铜合金植入医疗器械。

本发明的有益效果是：

1、本发明通过机械合金化、添加造孔剂、放电等离子烧结工艺参数制备出铜含量低、耐蚀性能、抗菌性能、促成骨性能优良的新型医用纳米多孔钽铜合金。

2、本发明所述的新型医用纳米多孔钽铜合金作为植入物时，可向其附近组织中持续释放微量Cu离子，不仅能够抗细菌感染，还能有效地提高生物相容性能，其多孔结构利于骨细胞粘附生长，为骨细胞生长提供了足够的三维生长空间。可广泛应用于骨科医学临床领域中使用的各类钽金属植入医疗器械。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。

图1为本发明实施例1制备的抗菌促成骨医用纳米多孔钽铜合金的金相显微镜照片；

图2为本发明实施例1制备的抗菌促成骨医用纳米多孔钽铜合金的透射电子显微镜照片；

图3为本发明实施例1制备的抗菌促成骨医用纳米多孔钽铜合金抗金黄色葡萄球菌的实验结果图；(a)为纯钽，(b)为抗菌促成骨医用纳米多孔钽铜合金；

图4为本发明实施例1制备的抗菌促成骨医用纳米多孔钽铜合金抗大肠杆菌的实验结果图；(a)为纯钽，(b)为抗菌促成骨医用纳米多孔钽铜合金；

图5为本发明实施例1制备的抗菌促成骨医用纳米多孔钽铜合金样品上种植MC3T3细胞第一天、第三天和第五天CCK-8的测试结果图，其中，A：纯钽样品；B：实施例1制备的样品；

图6为本发明实施例1制备的抗菌促成骨医用纳米多孔钽铜合金样品上种植MC3T3细胞7天后碱性磷酸酶活性的结果图，其中，A：纯钽样品；B：实施例1制备的样品。

具体实施方式

参选以下本发明的优选实施方法的详述以及包括的实施例可更容易地理解本发明的内容。

以下实例，纯钽粉是指质量含量≥99.95％的钽，纯铜粉是指质量含量≥99.90％。

以下实例，均采用机械合金化、添加造孔剂、放电等离子烧结的方式制备。

机械合金化法制备纳米钽铜合金粉末：相关参数如下：球磨珠与原料的质量比(球料比)为15：1，控制剂为体积分数为5％的无水乙醇，球磨珠大小比例为3：1，球磨时间为18-36h，球磨转数为200-300r/min。

添加造孔剂法：选用标准分子筛分离出的直径为100nm-200nm的球型硬脂酸与上述球磨过的纳米钽铜粉末进行机械混合，设定添加的球型硬脂酸含量为：0-50wt.％以获得不同孔隙的多孔结构纳米钽铜合金。

放电等离子烧结制备纳米多孔钽铜合金试样：相关工艺参数优选为：烧结压力为30-40MPa，烧结温度为800-1000℃，保温时间为3-5min，烧结速度为100℃/min，真空度小于6MPa。

采用线切割技术将样品切成直径为10mm、厚度为1-3mm的圆片。相关参数如下：丝速为4，电流为1，脉宽为14，间隔比为6，速度为3-5。

磨样和抛光：选用#800、#1200、#1500、#2000、#3000、#5000SiC砂纸进行打磨。选用金刚石研磨膏和二氧化硅抛光液进行抛光。

实施例1

抗菌促成骨医用纳米多孔钽铜合金及其制备方法，首先在分析天平上准确称取19.8g钽粉和0.2g铜粉原料装入球磨罐中，将装好原料的球磨罐置于手套箱中进行抽真空，以降低氧含量；将抽完真空的球磨罐置于机械合金化机中以球料比为15：1，控制剂为体积分数为5％的无水乙醇，球磨珠大小比例为3：1，球磨时间为36h，球磨转数为250r/min为具体参数进行机械合金化；球磨完后，将球磨罐置于手套箱中打开，再将球磨罐的球磨珠与原料粉末分开；最后，将粉末置于手套箱中放置20h以上，等待无水乙醇完全或大部分挥发，再取出钽铜粉末。

添加造孔剂法：使用标准分子筛分离出的直径为100nm-200nm的含量为5wt.％的球型硬脂酸与上述球磨过的钽铜混粉进行机械混合，设定添加的球型硬脂酸含量为：0-50wt.％以获得不同孔隙的多孔结构纳米钽铜合金。

放电等离子烧结(SPS)制备多孔钽铜合金材料：首先，将上述机械合金化之后的钽铜粉末装入直径为10mm的模具中在2-4MPa的压力下压至1min。其次，将模具置于放电等离子烧结炉烧结，其中烧结压力为40MPa，烧结温度为1000℃，保温时间为5min，烧结速度为100℃/min，真空度小于6MPa。

将烧结的样品采用线切割技术将样品切成直径为10mm、厚度为1-3mm的圆片后。首先，依次采用#800、#1200、#1500、#2000、#3000、#5000SiC砂纸打磨。其次，再用金刚石研磨膏和二氧化硅抛光液进行抛光处理。最后，分别用无水乙醇和去离子水依次超声清洗15min备用。

以上实验步骤所制得的纳米多孔钽铜合金金相显微镜照片如图1所示，透射电子显微镜照片如图2所示，可以看出铜以约10nm粒径的铜单质弥散分布于钽基体中，该材料孔隙率约为20％。

将该材料加工成生物学性能测试样品，对其进行生物学性能相关测试，其方法和结果如下：

1、纳米多孔钽铜合金抗菌性能测试

(1)配置细菌液浓度为1×106CFU/mL，并将本实施例抗菌促成骨纳米多孔钽铜合金放置于75％酒精中，浸泡40min杀菌；

(2)将浸泡于75％酒精中的纳米多孔钽铜合金分别置于24孔板中；

(3)在浸泡75％酒精中的纳米多孔钽铜合金表面分别加入100μL金黄色葡萄球菌菌液，于37℃的培养箱中培养24h；

(4)24h后，将表面培养细菌的纳米多孔钽铜合金取出，置于50mL离心管中，并加入2mL灭菌PBS，超声振荡，将细菌洗脱；

(5)取100μL上述含菌PBS，进行稀释，稀释至浓度为1×106CFU/mL；

(6)取上述浓度为1×106CFU/mL菌液50μL，进行涂布平板，培养24h，计数。

本实施例制备的纳米多孔钽铜合金的抗金黄色葡萄球菌的实验结果，如图3所示，本实施例制备的纳米多孔钽铜合金的菌落数显著低于纯钽对照组(纯钽对照组的抗菌实验评价方式同本实施例方法，区别在于将本实施例的纳米多孔钽铜合金替换为纯钽材料)，几乎看不到菌落，对金黄色葡萄球菌抗菌率达99％以上。

本实施例制备的纳米多孔钽铜合金的抗大肠杆菌的实验结果(材料对大肠杆菌的抗菌实验评价方式同本实施例方法，区别在于将本实施例的金黄色葡萄球菌替换为大肠杆菌)，如图4所示，本实施例制备的纳米多孔钽铜合金的菌落数显著低于纯钽对照组，只有几个菌落，对大肠杆菌抗菌率达97％以上。

为了评估细胞的成骨情况，分别进行细胞的增殖情况检测(CCK-8试剂盒表征)，以及碱性磷酸酶检测，碱性磷酸酶是早中期向成骨细胞分化的重要标志，两者从不同角度共同阐述细胞的成骨情况。

2、CCK-8检测细胞的增殖情况

为评估该纳米多孔钽铜合金对细胞的毒性以及细胞的增殖能力，将获得的金属材料表面形成的抗菌促成骨掺氟氧化钽涂层进行细胞增殖与毒性(CCK-8)评价通过CCK-8试剂盒表征细胞的增殖情况。其实验过程如下：

(1)将纳米多孔钽铜合金与小鼠前成骨细胞MC3T3共同培养三天后，吸弃完全培养基；

(2)每孔加入浓度为10％的CCK-8溶液与细胞相互作用，于37℃孵育2h；

(3)孵育完毕后，从每孔转移出100μL溶液至96孔板；

(4)通过酶标仪检测溶液的吸光度，检测波长为450nm。

本实施例制备的纳米多孔钽铜合金，其吸光度如图6中C所示，图中显示，接种于抗菌促成骨掺氟氧化钽涂层的金属材料小鼠前成骨细胞MC3T3的细胞活性较强。结果表明，本纳米多孔钽铜合金具有良好的生物相容性，不具有细胞毒性，具有优异的细胞增殖能力。

为评估该纳米多孔钽铜合金对前成骨细胞的诱导成骨分化能力，将获得的抗菌促成骨掺氟氧化钽涂层进行碱性磷酸酶检测，通过碱性磷酸酶试剂盒表征细胞的增殖情况的碱性磷酸酶含量升高是前成骨细胞向骨细胞早期分化的重要标志，其实验过程如下：

(1)配置显色底物溶液和标准品工作液：按照碱性磷酸酶试剂盒说明书上方法；

(2)收集纳米多孔钽铜合金上的细胞，吸弃材料中完全培养基，加300μm胰酶消化，离心，弃上清液；

(3)加入100μL细胞裂解液，反复冻融，混匀离心，取上清液，备用；

(4)96孔板分别设置空白对照组，标准孔组和样品孔组。标准品用量分别是4、8、16、24、、32和40μL；

(5)放入摇床，37℃孵育30min；

(6)每孔加入100μL终止液终止反应；

(7)通过酶标仪检测溶液的吸光度，检测波长为405nm，计算碱性磷酸酶含量。

本实施例制备的纳米多孔钽铜合金细胞相容性结果如图5所示，结果表面材料具有良好的生物相容性，不具有细胞毒性，不影响细胞增殖。

本实施例制备的纳米多孔钽铜合金的碱性磷酸酶含量如图6所示，图中显示，接种于纳米多孔钽铜合金的小鼠前成骨细胞MC3T3分泌的碱性磷酸酶含量高于对照组，表明本实施例所制备的纳米多孔钽铜合金具有良好的诱导前成骨细胞成骨分化的作用，促成骨能力优异。

以上结果表明，本实施例制备的纳米多孔钽铜合金具有良好的抗金黄色葡萄球菌生长功能，具有良好的生物相容性，不具有细胞毒性，不影响细胞增殖，具有良好的诱导前成骨细胞成骨分化的作用。

实施例2

抗菌促成骨医用纳米多孔钽铜合金及其制备方法实施例1的不同之处为球型硬脂酸占原料粉末的质量百分比为20％，单质铜尺寸约为10nm弥散分布于钽基体中，材料孔隙率约为60％。

本实施例制备的新型医用纳米多孔钽铜合金对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抗菌率均大于99％。材料对小鼠前成骨细胞表现出良好的细胞相容性，且促进细胞胞内碱性磷酸酶活性，具有良好的促成骨活性。

本实施例制备的新型医用纳米多孔钽铜合金，在抗菌和细胞实验过程中，纳米多孔钽铜合金通过释放出铜离子和富铜相接触作用，达到杀菌和促成骨效果。

实施例3

抗菌促成骨医用纳米多孔钽铜合金及其制备方法实施例1的不同之处在于机械合金化步骤中球磨时间为18h，单质铜尺寸约为50nm弥散分布于钽基体中，材料孔隙率约为20％。