复合海藻酶解物及其在大黄鱼饲料添加剂中的应用

技术领域

本发明涉及农业技术、饲料添加剂技术领域，尤其涉及复合海藻酶解物及其在大黄鱼饲料添加剂中的应用。

背景技术

大黄鱼(Larimichthys crocea)是原产于西北太平洋的大黄鱼科的一种海洋鱼类，一般生活在中国台湾海峡等温带水域，是我国的重要经济鱼种之一，年产量已超过20万吨。目前，大黄鱼主要是网箱养殖，主要集中在福建、广东、浙江和山东等东部沿海地区，其中福建是核心养殖区，鱼产量占85％以上。随着养殖规模的不断壮大，养殖密度、养殖用水和饲料质量等各种问题不断涌现，导致大黄鱼养殖中弧菌病、细菌性肠炎病、刺激隐核虫病等细菌性疾病、寄生虫病等病害频发，其中细菌性疾病是养殖过程中的主要病害。肠道被认为是细菌侵入的主要途径，并且肠道健康有益于宿主机体整体健康。肠道菌群是肠道健康的基础，同时和宿主健康之间有着密切的关系,与宿主之间存在着复杂的相互作用。

短链脂肪酸(Short-chain fatty acids,SCFAs)是碳原子数小于等于6的饱和脂肪酸，主要包括乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸、戊酸、异戊酸、己酸和异己酸，其中乙酸、丙酸、丁酸含量最高，占所有SCFAs中的80％以上。短链脂肪酸是大肠中微生物群落厌氧发酵膳食纤维和蛋白质产生的代谢物，是肠道菌群调节肠道和宿主健康的重要纽带，尤其是丁酸，在哺乳动物中可诱导CD4+T细胞和先天性淋巴细胞(ILC)产生IL-22以维持肠道稳态，抑制炎症NF-κB信号通路的中枢调节因子，减少氧化应激，从而预防病理与肠道炎症性疾病相关的结肠损伤。

目前的研究证实斑马鱼肠道微生物群落产生的丁酸具有减少中性粒细胞和M1型促炎巨噬细胞向伤口的募集等抗炎作用，并证实丁酸抗炎作用在脊椎动物中具有保守性，在鱼类中存在保守性分子受体。近年来，我国研究人员对大黄鱼胃肠消化道的菌群、菌群与健康的关系及不同养殖模式消化道菌群的差异等方面进行了细致的研究，并研究了添加不同饲料原料、饲喂模式等提高肠道菌群的α多样性以促进肠道健康、提高经济效益。

海藻主要包括褐藻(海带)、绿藻和红藻(紫菜)等，目前已确定具有生物学意义的主要成分包括褐藻酸(胶)(Alginate)、海带多糖(褐藻多糖、褐藻淀粉)(Laminarin)、岩藻聚糖(Fucoidan)、紫菜聚糖(Porphyran)、绿藻多糖(Ulvans)和卡拉胶等硫酸化多糖、多酚(Polyphenols)、海藻蛋白降解生成的寡肽等。

因此，如何对海藻中的有效、有益物质进行提取，将其用于饲料中改善大黄鱼肠道，以促进其健康生长是具有积极现实意义的。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提出一种工艺简单、所制得产物作为饲料添加剂用于大黄鱼饲养时，能够增加大黄鱼肠道微生物群落多样性和丁酸合成的复合海藻酶解物及其在大黄鱼饲料添加剂中的应用。

为了实现上述的技术目的，本发明所采用的技术方案为：

一种复合海藻酶解物的制备方法，其包括将紫菜、石莼和海带进行预处理后，再按预设质量份数比进行混合且加水制成海藻混悬物，然后加入预设终浓度的柠檬酸和盐酸溶液进行搅拌混合并将pH调至预设值后，再加入纤维素酶和果胶酶，使酶与底物质量比值E/S达到预设范围值，且在预设条件下继续搅拌处理预设时长，然后再加入NaOH和Na

作为一种可能的实施方式，进一步，本方案将紫菜、石莼和海带进行预处理的方法包括将紫菜、石莼和海带进行烘干处理，使其水分含量≤11％，再经粉碎处理后，使紫菜、石莼和海带粒度达到≥80目。

作为一种较优的实施选择，优选的，本方案所述海藻混悬物包括经预处理后的10-30份紫菜、20-40份石莼和30-70份海带，所述紫菜、石莼和海带混合均匀后，制得海藻粉，再将海藻粉按照40-120g/L的比例加入饮用水，且以30-1000rpm的速度进行搅拌，搅拌时间≥30min，制得海藻混悬物。

作为一种较优的实施选择，优选的，本方案所述海藻混悬物中加入终浓度分别为0.01M和0.10M的柠檬酸、盐酸溶液制成混合海藻混悬物，且将混合海藻混悬物加热升温至40-50℃后，以≥150rpm的速度进行搅拌处理，搅拌时长≥30min，搅拌期间还使用盐酸调整混合海藻混悬物酸度，使pH值为4.5-5.0。

作为一种较优的实施选择，优选的，本方案在混合海藻混悬物中加入纤维素酶和果胶酶时，使酶与底物质量比值E/S均≥0.50×10

作为一种较优的实施选择，优选的，本方案加入中性蛋白酶、氨肽酶和褐藻胶裂解酶时，使酶与底物质量比值E/S分别为≥3000U/g、≥300U/g和≥1000U/g，pH为7.0-8.0，混合海藻酶解物温度为40-50℃，然后在≥150rpm的速度下搅拌处理，搅拌时长≥2h。

作为一种较优的实施选择，优选的，本方案最后在5-30min内将混合体系温度升温至85-90℃，然后维持15-30min对混合体系进行灭活酶处理，继而经喷雾干燥处理、粉碎处理，使产物水分含量≤10％，粒度≥80目，制得复合海藻酶解物。

作为一种较优的实施选择归纳，本方案包括如下步骤：

(1)将紫菜、石莼和海带烘干，使水分含量≤11％，再粉碎使其粒度达到≥80目；

(2)按照预设质量份数比，将10-30份紫菜、20-40份石莼和30-70份海带混合均匀，制得海藻粉；

(3)将混合好的海藻粉按照40-120g/L的比例加入饮用水，再以30-1000rpm的速度搅拌处理，搅拌时长≥30min，制得海藻混悬物；

(4)向混合海藻混悬物中加入柠檬酸和盐酸，使终浓度分别为0.01M和0.10M，同时对混合海藻混悬物加热升温至40-50℃，再以≥150rpm的速度搅拌处理，搅拌时长≥30min；

(5)在步骤(4)搅拌期间使用盐酸调整酸度，使pH 4.5-5.0；

(6)在混合海藻混悬物中加入纤维素酶和果胶酶，使酶与底物质量比值E/S均≥0.50×10

(7)向混合海藻酶解物中加入NaOH和Na

(8)加入中性蛋白酶、氨肽酶和褐藻胶裂解酶，使酶与底物质量比值E/S分别为≥3000U/g、≥300U/g和≥1000U/g，pH为7.0-8.0，混合海藻酶解物温度为40-50℃，然后在≥150rpm的速度下搅拌处理，搅拌时长≥2h；

(9)在5-30min内将混合体系升温至85-90℃，维持15 -30min进行灭活酶处理；

(10)经喷雾干燥处理、粉碎处理，使产物水分含量≤10％，粒度≥80目，制得复合海藻酶解物。

作为一种较优的实施参数选择，优选的，本方案包括如下步骤：

(1)将紫菜、石莼和海带烘干，使水分含量≤11％，再粉碎使其粒度达到≥80目；

(2)按照预设质量份数比，将29份紫菜、24份石莼和47份海带混合均匀，制得海藻粉；

(3)将混合好的海藻粉按照100g/L的比例加入饮用水，再以400rpm的速度搅拌处理，搅拌时长为3h，制得海藻混悬物；

(4)向混合海藻混悬物中加入柠檬酸和盐酸，使终浓度分别为0.01M和0.10M，同时对混合海藻混悬物加热升温至48±0.5℃，再以300rpm的速度搅拌处理，搅拌时长为30min；

(5)在步骤(4)搅拌期间使用盐酸调整酸度，使pH 4.8±0.2；

(6)在混合海藻混悬物中加入纤维素酶和果胶酶，使酶与底物质量比值E/S分别为0.30×10

(7)向混合海藻酶解物中加入NaOH和Na

(8)加入中性蛋白酶、氨肽酶和褐藻胶裂解酶，使酶与底物质量比值E/S分别为6000U/g、600U/g和3000U/g，pH为7.8±0.2，混合海藻酶解物温度为43±0.5℃，然后在300rpm的速度下搅拌处理，搅拌时长为4h；

(9)在20min内将混合体系升温至85±0.1℃，维持15±2min进行灭活酶处理；

(10)经喷雾干燥处理、粉碎处理，使产物水分含量≤10％，粒度≥80目，制得复合海藻酶解物。

基于上述，本方案所制得的复合海藻酶解物的可溶固形物≥400mg/g，总多糖≥30mg/g，还原糖≥20mg/g，蛋白含量≥1000ug/g，多肽含量≥50ug/g，褐藻酸寡糖≥30mg/g，总抗氧化≥30mM FeSO

基于上述，本发明还提供一种大黄鱼饲料添加剂，其用于增加大黄鱼肠道微生物群落多样性和丁酸合成，其包括上述所述制备方法制得的复合海藻酶解物。

采用上述的技术方案，本发明与现有技术相比，其具有的有益效果为：本方案巧妙性将易于获取的海带、石莼和条斑紫菜按照一定比例混合平衡主要功能成分，通过纤维素酶和果胶酶充分破坏细胞壁释放细胞周质空间和胞内的褐藻酸、硫酸化多糖和蛋白等，再使用褐藻胶裂解酶将机体难以吸收利用的长链糖酶解为还原糖和短链糖，利用蛋白酶将海藻蛋白降解生成具有生物活性的寡肽，制备了复合海藻酶解物，该复合海藻酶解物以0.5％的量添加入厌氧培养基，可以显著提高大黄鱼肠道微生物群落体外培养后的α多样性和丁酸的合成，该复合海藻酶解物可用于饲养大黄鱼的饲料添加剂，提高大黄鱼肠道微生物群落多样性和丁酸合成；除此之外，本方案还具有如下优点：

(1)海藻的种类多，不同海藻中功能成分含量差异较大，本方案选择易于获取的海带、石莼和紫菜按照一定比例混合使褐藻酸、硫酸化多糖、海藻蛋白等功能成分平衡，通过试验论证了效果优于单一组分；

(2)纤维素酶和果胶酶充分破坏细胞壁释放细胞周质空间和胞内的褐藻酸、硫酸化多糖和蛋白；褐藻胶裂解酶将机体难以吸收利用的长链糖酶解为还原糖和短链糖、蛋白酶将海藻蛋白降解生成具有生物活性的寡肽；

(3)添加复合海藻酶解物可显著增加大黄鱼肠道微生物群落多样性和丁酸合成。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是大黄鱼肠道微生物群落体外不同培养条件下合成短链脂肪酸的差异对比图；

图2是大黄鱼肠道微生物群落体外不同培养条件下培养后的PCoA分析对比图；

图3是大黄鱼肠道微生物群落体外不同培养条件下培养后的组间群落结构差异显著性检验对比图；

图4a-图4f是大黄鱼肠道微生物群落体外不同培养条件下培养后的Alpha多样性比较图，其中，图4a是observed_species指数组间差异箱形图，图4b是shannon指数组间差异箱形图，图4c是simpson指数组间差异箱形图，图4d是chao1指数组间差异箱形图，图4e是ace指数组间差异箱形图，图4f是PD whole tree指数组间差异箱形图；

图5是大黄鱼肠道微生物群落体外培养后各组基于OTUs的Venn图；

图6是大黄鱼同一肠道菌群在体外不同条件下培养后Alpha多样性变化对比图；

图7是大黄鱼肠道微生物群落体外培养后在门水平的结构特征对比图；

图8是大黄鱼肠道微生物群落体外培养后主要优势菌门的转换对比图；

图9是大黄鱼肠道微生物群落体外培养后在属水平物种丰度热图对比；

图10是大黄鱼肠道微生物群落体外培养后不同分组间差异菌群的LDA值分布柱状图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例，对本发明作进一步的详细描述。特别指出的是，以下实施例仅用于说明本发明，但不对本发明的范围进行限定。同样的，以下实施例仅为本发明的部分实施例而非全部实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

本实施例方案一种复合海藻酶解物的制备方法，其包括如下步骤：

(1)将紫菜、石莼和海带烘干，使水分含量≤11％，再粉碎使其粒度达到≥80目；

(2)按照预设质量份数比，将10-30份紫菜、20-40份石莼和30-70份海带混合均匀，制得海藻粉；

(3)将混合好的海藻粉按照40-120g/L的比例加入饮用水，再以30-1000rpm的速度搅拌处理，搅拌时长≥30min，制得海藻混悬物；

(4)向混合海藻混悬物中加入柠檬酸和盐酸，使终浓度分别为0.01M和0.10M，同时对混合海藻混悬物加热升温至40-50℃，再以≥150rpm的速度搅拌处理，搅拌时长≥30min；

(5)在步骤(4)搅拌期间使用盐酸调整酸度，使pH 4.5-5.0；

(6)在混合海藻混悬物中加入纤维素酶和果胶酶，使酶与底物质量比值E/S均≥0.50×10

(7)向混合海藻酶解物中加入NaOH和Na

(8)加入中性蛋白酶、氨肽酶和褐藻胶裂解酶，使酶与底物质量比值E/S分别为≥3000U/g、≥300U/g和≥1000U/g，pH为7.0-8.0，混合海藻酶解物温度为40-50℃，然后在≥150rpm的速度下搅拌处理，搅拌时长≥2h；

(9)在5-30min内将混合体系升温至85-90℃，维持15 -30min进行灭活酶处理；

(10)经喷雾干燥处理、粉碎处理，使产物水分含量≤10％，粒度≥80目，制得复合海藻酶解物。

质量指标

上述实施例所制得的复合海藻酶解物的各项指标遵循表1所示，

表1复合海藻酶解物质量标准指标

上述质量标准指标对应的检测方法如下：

1)可溶性固形物含量测定

按照《GBT 12729.11-2008香辛料和调味品冷水可溶性抽提物的测定》测定。

2)可溶性固形物蛋白含量

按照《GB 5009.5-2016食品安全国家标准食品中蛋白质的测定》测定可溶性固形物蛋白含量。

3)可溶物中总多糖含量测定

按照《SNT4260-2015粗多糖-硫酸苯酚法》附录A测定

4)可溶物中还原糖含量测定

按照《GB5009.7-2016食品中还原糖的测定》测定。

5)硫化多糖测定(硫酸根测定)

按照《SCT3404-2012岩藻多糖(总糖、硫酸根)》测定总硫酸根和游离硫酸根。

6)褐藻酸酶解寡糖的含量

按照《DB21T 2598-2016褐藻酸寡糖含量的检测》测定。

7)多肽含量测定

预处理：

1.精确称取1.000g复合海藻酶解产物，加水定容至50mL水中，搅拌4-6h后冷藏18h，恢复至室温，中速滤纸过滤，取滤过液，室温，8,000×g离心5min；

2.取10mL上清液，用终体积乙醇浓度为80％进行醇沉淀(4℃，12h)，4,000×g离心15min，除去多糖及杂质；

3.取上清液烘干，使用5mL PBS重新溶解；

4.溶解液进行超滤浓缩(滤膜3KDa)，收集分子量<3kDa滤过液。

按照《GB 5009.5-2016食品安全国家标准食品中蛋白质的测定》测定多肽含量。

8)总抗氧化活性

按照《GBT39100-2020多肽抗氧化性能测定》测定。

实施实例

基于前述，本实施例列举如下实例和对比例进行阐述本方案：

一种复合海藻酶解物的制备方法，其包括如下步骤：

(1)将紫菜、石莼和海带烘干，使水分含量≤11％，再粉碎使其粒度达到≥80目；

(2)按照预设质量份数比，将29份紫菜、24份石莼和47份海带混合均匀，制得海藻粉；

(3)将混合好的海藻粉按照100g/L的比例加入饮用水，再以400rpm的速度搅拌处理，搅拌时长为3h，制得海藻混悬物；

(4)向混合海藻混悬物中加入柠檬酸和盐酸，使终浓度分别为0.01M和0.10M，同时对混合海藻混悬物加热升温至48±0.5℃，再以300rpm的速度搅拌处理，搅拌时长为30min；

(5)在步骤(4)搅拌期间使用盐酸调整酸度，使pH 4.8±0.2；

(6)在混合海藻混悬物中加入纤维素酶和果胶酶，使酶与底物质量比值E/S分别为0.30×10

(7)向混合海藻酶解物中加入NaOH和Na

(8)加入中性蛋白酶、氨肽酶和褐藻胶裂解酶，使酶与底物质量比值E/S分别为6000U/g、600U/g和3000U/g，pH为7.8±0.2，混合海藻酶解物温度为43±0.5℃，然后在300rpm的速度下搅拌处理，搅拌时长为4h；

(9)在20min内将混合体系升温至85±0.1℃，维持15±2min进行灭活酶处理；

(10)经喷雾干燥处理、粉碎处理，使产物水分含量≤10％，粒度≥80目，制得复合海藻酶解物。

采用前述所提及的方法对本实施实例制得的复合海藻酶解物进行检测，所得检测结果见表2所示，

表2实施实例制备的复合海藻酶解物质量成分检测

对比例

本对比例提供一种海带酶解物的制备方法，其包括如下步骤：

(1)将海带烘干使水分含量≤11％，粉碎达到≥80目；

(2)仅使用海带粉作为原料制备海带酶解物；

(3)将单一海带粉按照100g/L的比例加入饮用水中，以400rpm的速度，搅拌3h；

(4)向混合海藻混悬物中加入柠檬酸和盐酸，使终浓度分别为0.01M和0.10M，同时对混合海藻混悬物加热升温至48±0.5℃，以300rpm的速度，搅拌30min，期间使用盐酸调整pH使稳定在4.8±0.2；

(5)加入纤维素酶和果胶酶，使酶/底物质量(E/S)分别为0.30×10

(6)向混合海藻酶解物中加入NaOH和Na

(5)加入中性蛋白酶、氨肽酶和褐藻胶裂解酶，使酶/底物质量(E/S)分别为6000U/g、600U/g和3000U/g，在pH 7.8±0.2，43±0.5℃，300rpm的速度搅拌4h；

(6)在20min内升温至85±1.0℃，维持15±2.0min灭活；

(7)喷粉干燥使水分含量≤10％，进一步粉碎达到≥80目，制得海带酶解物。

采用前述所提及的方法对本对比例制得的海带酶解物进行检测，所得检测结果见表3所示，

表3制备的复合海藻酶解物质量成分检测

应用对比

大黄鱼肠道菌群的采集与处理

采集网箱养殖、3个月内无使用抗生素的1岁龄健康大黄鱼(体重150-200g、体长20-24cm)4尾。无菌环境下，采用75％酒精擦拭活体大黄鱼体表，解剖，提取消化道，收集每条鱼的小肠和直肠内容物，混匀，使用经灭菌的GAM培养液按1g∶9m L配制成肠道菌液YC1、YC2、YC3、YC4，冷藏备用。

肠道菌群的体外培养

使用GAM厌氧培养基，具体培养方法如下：

(1)首先试验分为三组，其分别为：

BC：GAM培养；

TA：GAM中添加0.5％(W/V)混合海藻酶解物；

TD：GAM中添加0.5％(W/V)海带酶解物；

其中，每组中准备玻璃大试管4支，分装培养液9mL/支，放入硬蜡3-5g/支，同时做污染控制组3支(GAM培养基)，121℃，高压15min灭菌。

(2)冷却至室温后，使用酒精灯将蜡封融掉加入1mL(10％比例添加)已准备好的肠道菌液YC1、YC2、YC3、YC4至各组的试管中，硬蜡热封冷却后，上下颠倒充分混匀，污染控制组使用灭菌的GAM培养液做平行操作。

(3)培养条件为25℃、100rpm下培养24h，污染控制组清亮无浑浊前提下对试验组进行采样，每个试管颠倒混匀后从中取3mL，-80℃保存。

短链脂肪酸与16s测序

短链脂肪酸(SCFAs)的定性定量分析、肠道菌群培养物的16S rDNA扩增子测序、分析及SCFAs与肠道菌群的关联分析均委托武汉迈维代谢有限公司进行。

16S rDNA扩增子测序使用NovaSeq PE250方案，经过Reads拼接过滤，OTUs(Operational Taxonomic Units)聚类，进行物种注释及丰度分析，及α多样性(AlphaDiversity)和β多样性分析(Beta Diversity)等分析。

SCFAs样品制备过程如下：

(1)样本解冻后，涡旋1min混匀，12000r/min、4℃条件下离心10min；

(2)取样本上清50μL加入到对应的1.5mL离心管中，加入100μL 0.5％磷酸溶液，涡旋3min；

(3)加入150μL含内标的MTBE溶剂，涡旋3min，冰浴下超声5min，之后在12000r/min、4℃条件下离心10min；

(4)离心完后吸取上层清液90μL到有玻璃内衬管的进样瓶中，-20℃冰箱保存，待GC-MS/MS分析。

色谱分析条件如下：色谱柱为Agilent DB-FFAP(30m×0.25mm，0.25μm)；设置进样口温度200℃，检测器温度230℃，进样量为2μL；升温程序为1min内升温至90℃，随后25℃/min(90-100℃)，20℃/min(100-150℃)0.6min，25℃/min(150-200℃)，200℃0.5min，运行3min；设定分流比为1：1；注流量为1.2。

短链脂肪酸检测

大黄鱼肠道微生物群落体外厌氧培养下可以产生乙酸为主的SCFAs，乙酸、丙酸和丁酸的比例大约为94:5:1，添加0.5％混合海藻酶解物可以促进丁酸的产生，比例改变为92:4:4，丁酸的合成量由0.04mM增加至0.27mM，戊酸的产由0.0001mM增加至0.0004mM量，丙酸合成量的0.29mM降至0.23mM；加入0.5％海带酶解物(TD组)仅显著增加戊酸的产量，相应对比见图1。

图1所示结果为无菌条件下收集大黄鱼小肠和直肠的微生物菌群，10倍稀释后再以10％的比例接种到添加不同海藻酶解物的GAM培养基中25℃、100rpm下厌氧培养24h后检测。

图1中各代号对应为：AA：乙酸；BA：丁酸；CA：己酸；IBA：异丁酸；IVA：异戊酸；PA：丙酸；VA：戊酸；

误差线显示为平均值±SD；**，p<0.01；

BC，空白组：厌氧培养基(GAM)；

TD，海带酶解物添加组：厌氧培养基(GAM)+0.5％海带酶解物；

TA，混合海藻酶解物添加组：厌氧培养基(GAM)+0.5％混合海藻酶解物。

分组差异性分析

大黄鱼肠道微生物群落体外不同培养条件下产生的丁酸和戊酸有极显著的差异，肠道微生物群落体的改变是造成这种差异的原因，为此使用16S rDNA扩增子测序技术对此进行进一步研究。肠道微生物群落体外培养物经16S rDNA扩增子测序后，首先基于Unweighted Unifrac距离进行PCoA(Principal Co-ordinates Analysis)分析，样本距离越接近，表示物种组成结构越相似，因此群落结构相似度高的样本倾向于聚集在一起，群落差异很大的样本则会远远分开。PCoA分析显示TA组的样本基本聚集在相对独立的群落，与TD组和BC组样本有显著差异；TD组和BC组样本群落间有距离，但距离不明显区，对比见图2。

由图2可知，基于Unweighted Unifrac距离PCoA分析，ANOVA：p＝0.004。其中，横坐标表示一个主成分，纵坐标表示另一个主成分，百分比表示主成分对样本差异的贡献值；图中的每个点表示一个样本，同一个组的样本使用同一种颜色表示，颜色区域代表置信区间。另外，本试验3组分别对应如下：

BC(BC.1，BC.2，BC.3，BC.4)，空白组：厌氧培养基(GAM)；

TD(TD.1，TD.2，TD.3，TD.4)，海带酶解物添加组：厌氧培养基(GAM)+0.5％海带酶解物；

TA(TA.1，TA.2，TA.3，TA.4)，混合海藻酶解物添加组：厌氧培养基(GAM)+0.5％混合海藻酶解物。

使用非参数检验方法Anosim分析检验组间的差异是否显著大于组内差异并基于Bray-Curtis距离值的秩次进行组间差异显著性检验。结果表明，BC组与TD组的组间差异不显著(R＝-0.146)，TA组与BC组(R＝0.240)和TD组的组间差异显著(R＝0.208)，但显示统计分析的可信度不具有显著性，对比见图3。

由图3可知，使用Anosim分析检验组间的差异是否显著大于组内差异。R介于(-1，1)之间，R＞0，说明组间差异显著；R＜0，说明组内差异大于组间差异；p表示统计分析的可信度，p<0.05表示统计具有显著性。

BC_vs_TD，R＝-0.146，p＝0.741；BC_vs_TA，R＝0.240，p＝0.242；TD_vs_TA，R＝0.208，p＝0.128。

其中，BC，空白组：厌氧培养基(GAM)；

TD，海带酶解物添加组：厌氧培养基(GAM)+0.5％海带酶解物；

TA，混合海藻酶解物添加组：厌氧培养基(GAM)+0.5％混合海藻酶解物。

组间样本的差异性分析

使用Alpha多样性指数进行组间样本的差异性分析，使用可以直观反映组内物种多样性中位数、离散程度、最大值、最小值、异常值的箱形图展示。observed_species指数、shannon指数、simpson指数、chao1指数、ace指数和PD whole tree指数均显示三个分组存在差异，除simpson指数的中位数值中BC组指数>TD组指数外，其它各指数的中位数值均表现TA组>TD组>BC组，对比见图4。

图4各子图表示为：a：observed_species指数组间差异箱形图，b：shannon指数组间差异箱形图，c：simpson指数组间差异箱形图，d：chao1指数组间差异箱形图，e：ace指数组间差异箱形图，f：PD whole tree指数组间差异箱形图。

其中，BC，空白组：厌氧培养基(GAM)；

TD，海带酶解物添加组：厌氧培养基(GAM)+0.5％海带酶解物；

TA，混合海藻酶解物添加组：厌氧培养基(GAM)+0.5％混合海藻酶解物。

不同培养条件下微生物群落的特征和变化

同一条大黄鱼的肠道微生物群落同步进行BC组、TD组和TA组三种条件的培养，分类操作单元(OTUs，Operational Taxonomic Units)统计、比较显示，BC组OTUs总计有653个，TD组626个，TA组945个；相较于BC组，TD组和TA组分别独有192个和371个；相较于TD组，TA组独有347个，对比见图5。

图5中，BC，空白组：厌氧培养基(GAM)；

TD，海带酶解物添加组：厌氧培养基(GAM)+0.5％海带酶解物；

TA，混合海藻酶解物添加组：厌氧培养基(GAM)+0.5％混合海藻酶解物。

比较同一大黄鱼肠道微生物群落在各培养条件下的Alpha多样性，observed_species指数、simpson指数、shannon指数、chao1指数、ace指数和PD whole tree指数显示，Fish 1的各指数明显不同于其它三条鱼，其它鱼的各指数均表现TA组大于BC组和TD组，对比见图6。

图6各子图表示为：a：observed_species指数，b：simpson指数，c：shannon指数，d：chao1指数，e：ace指数，f：PD whole tree指数。

其中，BC，空白组：厌氧培养基(GAM)；

TD，海带酶解物添加组：厌氧培养基(GAM)+0.5％海带酶解物；

TA，混合海藻酶解物添加组：厌氧培养基(GAM)+0.5％混合海藻酶解物。

大黄鱼肠道微生物群落经体外培养后，BC组的优势菌门为厚壁菌门(Firmicutes)、变形菌门(Proteobacteria)和梭杆菌门(Fusobacteriota)为主，占所有序列得98％以上；添加海带酶解物后(TD组)，优势菌门转换为厚壁菌门(Firmicutes)、变形菌门(Proteobacteria)占所有序列得90％以上；添加混合海藻酶解物后(TA组)的优势菌门为厚壁菌门(Firmicutes)、变形菌门(Proteobacteria)和拟杆菌门(Bacteroidota)，占所有序列得95％以上，对比见图7。并且，不同添加物中肠道微生物群落优势菌门转换也存在个体差异，对比见图8。

图7中，BC，空白组：厌氧培养基(GAM)；TD，海带酶解物添加组：厌氧培养基(GAM)+0.5％海带酶解物；TA，混合海藻酶解物添加组：厌氧培养基(GAM)+0.5％混合海藻酶解物。Others表示图中这10个门之外的其他所有门的相对丰度之和。

图8中，BC(BC.1，BC.2，BC.3，BC.4)，空白组：厌氧培养基(GAM)；TD(TD.1，TD.2，TD.3，TD.4)，海带酶解物添加组：厌氧培养基(GAM)+0.5％海带酶解物；TA(TA.1，TA.2，TA.3，TA.4)，混合海藻酶解物添加组：厌氧培养基(GAM)+0.5％混合海藻酶解物；同一数字编号表示同一条鱼的肠道微生物群落。Others表示图中这10个门之外的其他所有门的相对丰度之和。

此外，据所有样本微生物群落的定量信息，从物种和样本两个层面对排名前35的微生物进行聚类，绘制热图，发现在属水平上TA组微生物与BC、TD组显著不同，同时，同一组内也有较大差异，对比见图9。

图9中，根据其在每个样本中的定量信息，在属水平上选取排名前35的微生物分类，从物种和样本两个层面进行聚类，绘制成热图。

其中，BC(BC.1，BC.2，BC.3，BC.4)，空白组：厌氧培养基(GAM)；

TD(TD.1，TD.2，TD.3，TD.4)，海带酶解物添加组：厌氧培养基(GAM)+0.5％海带酶解物；

TA(TA.1，TA.2，TA.3，TA.4)，混合海藻酶解物添加组：厌氧培养基(GAM)+0.5％混合海藻酶解物。

生物标志物分析

为了确定组间具有显著性差异的物种，从不同层级的物种丰度表出发，利用Metastats方法对组间的物种丰度数据进行分析筛选具有显著性差异的物种，BC组与TA组间具有显著性差异的微生物有拟杆菌门(Bacteroidota)、分类未定细菌(UnidentifiedBacteria)、脱铁杆菌门(Deferribacteres)、疣微菌门(Verrucomicrobiota)和蓝细菌(Cyanobacteria)，TD组与TA组间具有显著性差异的微生物为拟杆菌门(Bacteroidota)、分类未定细菌(Unidentified Bacteria)和其它细菌(Others)。

通过群落结构差异统计分析对不同分组的大黄鱼肠道微生物群落培养物进行深入研究。拟针对性的找出分组间丰度变化差异显著的物种，明确差异物种在不同分组间的富集情况。使用LEfSe(LDA Effect Size)工具在组与组之间寻找具有统计学差异的生物标志物(Biomarker)，结果显示TD组与BC组间无差异显著的微生物群落，但TA组与TD组和BC组差异显著的微生物群落较多，见图10。

图10中，LDA值分布柱状图中展示了LDA Score大于设定值(默认设置为4)的物种，即组间具有统计学差异的Biomarker。展示了不同组中丰度差异显著的物种，柱状图的长度代表差异物种的影响大小(即为LDA Score)。

其中，TD组缺失：TD组中并无差异显著的物种，故此组缺失。

BC，空白组：厌氧培养基(GAM)；

TD，海带酶解物添加组：厌氧培养基(GAM)+0.5％海带酶解物；

TA，混合海藻酶解物添加组：厌氧培养基(GAM)+0.5％混合海藻酶解物。门(P_)、纲(C_)、目(O_)、科(F_)、属(G_)、种(S_)。

以上所述仅为本发明的部分实施例，并非因此限制本发明的保护范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效装置或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。