靶向E2F8基因的试剂在制备治疗或改善基底细胞样乳腺癌的产品中的应用

技术领域

本发明涉及生物医疗领域，具体而言，涉及靶向E2F8基因的试剂在制备治疗或改善基底细胞样乳腺癌的产品中的应用。

背景技术

三阴性乳腺癌(Triple negative breast cancer，TNBC)是所有乳腺癌最为恶性的一种，占所有乳腺癌亚型的10％～20％。由于其高复发及高转移，并且表面不表达雌激素受体(Estrogen receptor，ER)、孕激素受体(Progesterone receptor，PR)和人类表皮生长因子受体2(Human epidermal growth factor receptor-2，HER-2)，致使其缺乏有效的靶点治疗药物，导致患者预后不良。病理组织分型中，大约75％的TNBC属于基底细胞样(Basal-like)亚型，25％属于其他亚型。目前经典的PAM50方法可将乳腺癌亚型进行分型，如Luminal A型、Lumnal B型、HER2阳性及Basal-like亚型。Basal-like乳腺癌具有较高的转移和早期复发风险。虽然对Basal-like乳腺癌进行了化疗，但大多数患者仍未从化疗中明显获益。缺乏Basal-like亚型有效的生物标志物成为目前治疗的重要挑战。此外，以往的研究也探索了一些Basal-like乳腺癌的靶向治疗方法，但靶点的治疗效果均有限。因此，深入了解Basal-like发生及发展的分子机制，探索及开发行之有效的综合治疗药物，为临床Basal-like乳腺癌治疗提供理论科学基础及意义。

鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供靶向E2F8基因的试剂在制备治疗或改善基底细胞样乳腺癌的产品中的应用。

本发明是这样实现的：

第一方面，本发明实施例提供了抑制E2F8基因表达和/或降低E2F8蛋白活性的试剂在制备治疗或改善基底细胞样乳腺癌的产品中的应用。

第二方面，本发明实施例提供了抑制E2F8基因表达和/或降低E2F8蛋白活性的试剂在制备用于抑制基底细胞样乳腺癌细胞的增殖、转移和侵袭中的至少一种的产品中的应用。

第三方面，本发明实施例提供了抑制E2F8基因表达和/或降低E2F8蛋白活性的试剂在制备提高基底细胞样乳腺癌细胞对多西他赛的药物敏感性的产品中的应用。

第四方面，本发明实施例提供了一种试剂盒，其包括：前述实施例所述的抑制E2F8基因表达和/或降低E2F8蛋白活性的试剂。

本发明具有以下有益效果：

本发明发现，通过靶向基底细胞样乳腺癌细胞的E2F8基因，从而下调该E2F8基因的表达，能有效抑制基底细胞样乳腺癌细胞的增殖、转移与侵袭，最终改善或治疗基底细胞样乳腺癌。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为E2F8是调控Basal-like乳腺癌发生的关键分子；(A)高通量RNA-seq分析Basal-like乳腺癌亚型组织样本中表达上调或下调的转录因子；(b)qRT-PCR方法检测乳腺癌细胞系中E2F8表达水平；

图2为E2F8表达与临床预后分析；(A)通过GEPIA数据集验证Basal-like乳腺癌亚型中的mRNA表达水平；E2F8高表达(High，红色)；E2F8低表达(Low，黑色)(B)通过Kaplan-Meier绘图数据集对Basal-like乳腺癌患者的RFS进行分析；E2F8高表达(High，红色)；E2F8低表达(Low，黑色)；(C)利用经典的PAM50乳腺癌分类的TCGA数据绘制E2F8的说明性ROC曲线；AUC(Area Under Curve)为ROC曲线下面积；

图3为E2F8调控细胞周期蛋白；(A)STRING在线数据分析；(B)MDA-MB-231细胞中采用siRNA敲低E2F8；Western blot方法检测E2F8、细胞周期蛋白表达水平；(C)BT20细胞中采用siRNA敲低E2F8；Western blot方法检测E2F8、细胞周期蛋白表达水平；

图4为Docetaxel药物敏感性检测；Docetaxel IC50为1.404nM，处理72h；siNC或siE2F8处理24h；

图5为E2F8对MDA-MB-231和BT20细胞迁移和侵袭的影响；(A)qRT-PCR方法检测siNC、siE2F8_1和siE2F8_2的MDA-MB-231细胞模型；(B)siRNA处理MDA-MB-231细胞后48hTranswell检测细胞迁移和侵袭情况(右侧为统计图)；(C)qRT-PCR方法检测siNC、siE2F8_1和siE2F8_2的BT20细胞模型；(D)siRNA处理BT20细胞后48h Transwell检测细胞迁移和侵袭情况(右侧为统计图)。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

目前没有在基底细胞样乳腺癌中研究E2F8基因的报道，具体作用机制也尚未清楚。本申请的发明人经一系列创造性劳动后发现，通过靶向基底细胞样乳腺癌细胞的E2F8基因，从而下调该E2F8基因的表达，抑制基底细胞样乳腺癌细胞的增殖、转移与侵袭，最终改善或治疗基底细胞样乳腺癌。

首先，本发明实施例提供了抑制E2F8基因表达和/或降低E2F8蛋白活性的试剂在制备治疗或改善基底细胞样乳腺癌的产品中的应用。

在一些实施例中，所述抑制E2F8基因表达和/或降低E2F8蛋白活性的试剂包括：基于基因编辑技术使得E2F8基因在基底细胞样乳腺癌细胞中不表达或表达受到抑制的试剂。

在一些实施例中，所述基因编辑包括：RNA干扰技术、DNA同源重组技术、CRISPR/Cas9技术、ZFN技术和TALEN技术中的任意一种或多种。

在一些实施例中，所述RNA干扰技术包括：针对E2F8基因的siRNA。

在一些实施例中，所述siRNA包括：序列如SEQ ID NO:1(5’-CGACACCCATCTCTTATCA-3’)所示的siRNA1和核苷酸序列如SEQ ID NO:2(5’-GCTCGCAGCTATTTGTAAA-3’)所示的siRNA2中的至少一种。

在一些实施例中，所述治疗或改善基底细胞样乳腺癌包括：抑制基底细胞样乳腺癌细胞的增殖、转移和侵袭中的任意一种或几种。

在一些实施例中，所述基底细胞样乳腺癌细胞包括：MDA-MB-231和BT20中的任意一种或两种。

在一些实施例中，所述产品包括：试剂、试剂盒、药物中的任意一种。

另一方面，本发明实施例提供了抑制E2F8基因表达和/或降低E2F8蛋白活性的试剂在制备用于抑制基底细胞样乳腺癌细胞的增殖、转移和侵袭中的至少一种的产品中的应用。

在一些实施例中，所述基底细胞样乳腺癌细胞包括：MDA-MB-231和BT20中的任意一种或两种；

在一些实施例中，所述抑制E2F8基因表达和/或降低E2F8蛋白活性的试剂如前述任意实施例所述。

另一方面，本发明实施例提供了抑制E2F8基因表达和/或降低E2F8蛋白活性的试剂在制备提高基底细胞样乳腺癌细胞对多西他赛的药物敏感性的产品中的应用。

此外，本发明实施例提供了一种试剂盒，其包括：前述任意实施例所述的抑制E2F8基因表达和/或降低E2F8蛋白活性的试剂。

在一些实施例中，所述试剂盒应用于治疗或改善基底细胞样乳腺癌。

优选地在一些实施例中，所述试剂盒还包括：多西他赛。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1

材料与方法：

一、细胞培养及组织收集

1.细胞培养：分别选取基底细胞样乳腺癌细胞系：MDA-MB-231和BT20，在37℃、5％CO

2.组织收集：12例深圳市人民医院甲乳外科已确诊的侵袭性导管乳腺癌的患者，其中包括3例Luminal A型，3例Luminal B型，3例HER2阳性，3例TNBC型。手术切除肿瘤组织，癌旁组织为距肿瘤组织约3-5cm处切除。患者年龄在35岁至75岁。

二、组织RNA提取及反转录建库

1.RNA提取

(1)在将组织在液氮中速冻，使用研磨器将组织磨碎，每管组织内加入1ml TRIzol后用振荡器中涡旋，在水平摇床上慢摇10min，充分裂解组织；

(2)将TRIzol-细胞裂解液加入到1.5mL的无酶管中，每个样品中加入200μl氯仿，剧烈震荡15sec后，室温静置2-3min，10000rcf，4℃离心15min；

(3)将上层水相转移至新的1.5mL的无酶管中，加入500μl异丙醇，混合均匀后室温放置40min，10000rcf，4℃离心15min；

(4)小心移除上清液体，管底可见RNA白色沉淀，使用预冷的无酶水配制的75％乙醇清洗一次，10000g，4℃离心1min。

(5)室温干燥RNA白色沉淀，加入30-60μL无酶水水溶解沉淀。-80℃保存备用。

3.反转录建库

(1)首先进行RNA样本质检：琼脂糖凝胶电泳分析样本RNA完整性及是否存在DNA污染；NanoDrop：检测RNA纯度(OD260/280及OD260/230比值)；Agilent 2100bioanalyzer：精确检测RNA完整性。

(2)通过Oligo(dT磁珠)富集带有poly A尾的RNA(包括mRNA和lncRNA)，从总RNA中去除核糖体RNA，在NEB Fragmentation Buffer中用二价阳离子打断RNA，片段化的RNA为模板，引物选择随机寡核苷酸，在M-MuLV逆转录酶体系中合成cDNA第一条链，随后用RNaseH降解RNA链，并在DNApolymerase I体系下，以dNTPs为原料合成cDNA第二条链。纯化后的双链cDNA经过末端修复、加A尾并连接测序接头，用AMPure XP beads筛选250-300bp左右的cDNA，进行PCR扩增并再次使用AMPure XP beads纯化PCR产物，最终获得文库。建库用试剂盒为NEBNext Ultra RNA Library Prep Kit for Illumina。

三、质检及RNA-seq上机测序

1.文库构建完成后，先使用Qubit2.0 Fluorometer进行初步定量，稀释文库至1.5ng/ul，随后使用Agilent 2100bioanalyzer对文库的insert size进行检测，insertsize符合预期后，qRT-PCR对文库有效浓度进行准确定量。

2.把不同文库按照有效浓度及目标下机数据量的需求pooling后进行Illumina测序。测序的基本原理是边合成边测序。在测序的flow cell中加入四种荧光标记的dNTP、DNA聚合酶以及接头引物进行扩增，在每一个测序簇延伸互补链时，每加入一个被荧光标记的dNTP就能释放出相对应的荧光，测序仪通过捕获荧光信号，并通过计算机软件将光信号转化为测序峰，从而获得待测片段的序列信息。使用Illumina公司的novaseq 6000进行测序。

四、RNA-seq数据生物信息学分析

1.数据质控：测序片段被高通量测序仪测得的图像数据经CASAVA碱基识别转化为序列数据(reads)，去除带接头(adapter)的reads；去除含N(N表示无法确定碱基信息)的reads；去除低质量reads(Q

2.数据分析：基因表达水平分析：计算各样本所有基因的表达值(Expectednumber of Fragments Per Kilobase of transcript sequence per Millions basepairs sequenced，FPKM)后，FPKM是指每百万fragments中来自某一基因每千碱基长度的fragments成对的reads数目，然后通过盒形图展示不同样本基因表达水平的分布情况；基因差异表达分析，首先对原始的readcount进行标准化(normalization)，主要是对测序深度的校正。然后统计学模型进行假设检验概率(Pvalue)的计算，最后进行多重假设检验校正，得到FDR值(错误发现率)。对不同组别间的基因做差异分析，|log2(FoldChange)|>1&padj<0.05的候选基因进一步分析；此外，采用GO富集分析和KEGG信号通路富集性分析进行细胞功能及差异基因通路分析。

五、实时荧光定量PCR反应(qRT-PCR)

1.RNA反转录实验：

在RNase-Free microtube管中配制下列混合液，10μl体系：首先使用DNase降解样本中DNA。

PCR反应条件：37℃，30min。

2.25mM EDTA 1μl至混合液，65℃热激反应10min。向混合液中加入50μM 0.5μLRandom primer和4uM 1ul dNTP。

PCR反应条件：72℃，10min，然后置于冰上。

3.RNA反转录合成cDNA

PCR反应条件：37℃，60min；70℃，15min。

3.得到的20μl cDNA用DEPC H

4.qRT-PCR：由Invitrogen公司设计合成引物：

六、E2F8 siRNA干扰模型的建立及鉴定

1.干扰模型建立：当MDA-MB-231和BT20细胞汇合度长至70％时，随机将细胞分别分为3组，siNC组和siE2F8_1和siE2F8_2组。siNC为阴性对照组，序列设计及产品购买自广州锐博生物技术有限公司；siE2F8_1序列为:5’-CGACACCCATCTCTTATCA-3’，siE2F8_2序列为:5’-GCTCGCAGCTATTTGTAAA-3’。细胞用PBS洗两遍，使用15μL lipofectamine 3000脂质体(Thermo公司)包裹50nM15μL的siRNA，无血清无抗生素MEM培养基稀释，总体积为400μl，混合液室温放置15-20min。随后每个10cm培养皿加入体积7ml的含有血清和抗生素的DMEM培养基，将脂质体包裹后的siRNA逐步滴加进每个培养皿，37℃、5％CO

2.鉴定：采用qRT-PCR方法进行鉴定，方法如五所示。采用蛋白免疫印迹分析(Western blot)方法进行鉴定。Western blot检测：每个培养皿加入100μl RIPA蛋白裂解液和蛋白酶抑制剂，-80℃冻存裂解。次日，样品12,000rpm，4℃离心15min后收集上清即蛋白裂解液，测定浓度，进行Western blot蛋白免疫印迹分析。

七、Transwell检测细胞迁移及侵袭检测：

将每孔5×10

八、多西他赛(Docetaxel)药物敏感性测试

Docetaxel为基底细胞样乳腺癌一线化疗药物。实验室已检测过Docetaxel的MDA-MB-231的IC50值为1.404nM。然后采用CCK-8方法检测。CCK-8方法检测细胞增殖：将每孔6000个MDA-MB-231和BT549细胞分别接种于96孔培养板中，总体积为100μl。分别转染siNC、siKTN1_1和siKTN1_2，每组5个复孔。分别在0h、24h、48h和72h后，每孔加入10％体积的CCK-8溶液，避光放置于37℃、5％ CO2培养箱中培养2-4h，用酶标仪测定其在450nm处的吸光度值。

九、统计学分析

使用SPSS 21.0版本软件，执行独立样本单因素方差分析，三组数据比较采用方差分析，同时均进行方差齐性分析，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001具有统计学意义。

实验结果

(1)E2F8是Basal-like乳腺癌亚型中关键的差异基因

为了寻找Basal-like乳腺癌亚型发生过程中的关键转录因子，收集了分别经临床病理诊断为Basal-like亚型的乳腺癌样本3对(包括癌组织及对应的癌旁组织)。通过高通量RNA测序筛选到E2F8，与癌旁比较，其在Basal-like癌组织中表达升高(如图1中A)。在8种人乳腺癌细胞系，包括正常乳腺上皮细胞系(MCF10A)、雌激素受体阳性的细胞系(MCF7、ZR75-1、T47D)和Basal-like细胞系(MDA-MB-231、BT549、BT20、HCC38)，进行验证发现，E2F8在Basal-like细胞系中表达升高(图1中B)，具有显著性统计学意义(*P<0.05)。

(2)E2F8是Basal-like乳腺癌亚型中关键的差异基因

使用GEPIA在线数据集验证了筛选后的乳腺癌大样本中E2F8的mRNA表达水平，结果发现(图2中A)，在Basal-like亚型中(n癌组织＝1085例，n癌旁组织＝291例)，与癌旁组织比较，E2F8在癌组织中表达升高；此外，Kaplan-Meier plotter数据库在线分析显示，在Basal-like亚型中高表达的E2F8基因与侵袭性乳腺癌无复发生存率(RFS)较差相关(图2中B)；为了探索E2F8是否会成为潜在的临床生物标志物，绘制了ROC曲线(图2中C)，以显示每个截点在临床中的敏感性和特异性。基于TCGA数据集，下载了208例Basal-like和115例癌旁组织的RNA测序数据进行ROC分析。结果所示，E2F8基因作为Basal-like乳腺癌标志物的RNA曲线下面积(area under curve,AUC)为0.973(95％ CI:95.25％～99.36％)，这些结果提示这些E2F8作为标志物具有相当的诊断价值。

(3)E2F8通过调控细胞周期促进Basal-like乳腺癌发生

为了进一步研究E2F8对乳腺癌信号通路网络的调控，通过STRING数据库下载E2F8相关蛋白和分子功能的数据。结果表明，大多数癌症相关的通路都被这些E2F8富集和调控。PPI相互作用网络显示与E2F8互作蛋白大多数是癌症相关蛋白，这些共同表达的蛋白包括TP53、MCM10。最重要地是，E2F8能够调控细胞周期蛋白进而促进细胞周期过程，而细胞周期蛋白可能在诱导肿瘤DNA复制、增殖及细胞周期调控中发挥重要作用(图3中A)，如CCND1和CCNB1。设计合成E2F8的小干扰RNA(siRNA)，在Basal-like乳腺癌细胞系MDA-MB-231和BT20中敲低E2F8发现，细胞周期蛋白CCNB1和CCND1表达降低(图3中A，B)。初步结果表明，E2F8可能参与调控Basal-like细胞周期蛋白，从而促进乳腺癌的发生。

(4)敲低E2F8增强Basal-like乳腺癌细胞对多西他赛(Docetaxel)药物敏感性

Docetaxel是Basal-like乳腺癌临床一线治疗用化疗药物。为了进一步探讨E2F8在Docetaxel治疗乳腺癌敏感性中的作用，在MDA-MB-231细胞中采用siRNA敲低E2F8后，使用CCK-8的方法检测药物敏感性。结果所示，Docetaxel药物IC50值为：1.404nM，在siE2F8治疗MDA-MB-231细胞24h后，加入Docetaxel继续培养72h，最后加入CCK-8后进行检测。结果所示，与对照组siNC-Docetaxel治疗组比较，处理组siE2F8-Docetaxel治疗后MDA-MB-231细胞增殖明显降低，说明敲低E2F8后，乳腺癌细胞对Docetaxel治疗更敏感(图4)。

(5)沉默E2F8显著地抑制Basal-like乳腺癌细胞迁移及侵袭

为了进一步探讨E2F8对Basal-like乳腺癌的调控模式，检测了敲低E2F8对细胞的迁移及侵袭的影响。qRT-PCR检测E2F8细胞沉默模型建立成功(图5中A，B)。使用Transwell技术检测了E2F8沉默对细胞的迁移和侵袭的影响。在MD-MB-231细胞中转染siNC、siE2F8_1、siE2F8_2后，将处理后的MD-MB-231细胞分别转种在Transwell小室(迁移小室无基质胶，侵袭小室内含有基质胶)中，12-16h收集细胞，显微镜下观察发现，抑制E2F8后MDA-MB-231细胞迁移减弱，同时侵袭也减弱(图5中B)；BT20细胞中也得到了类似的结果(图5中C，D)。以上结果说明，抑制E2F8表达能够抑制Basal-like乳腺癌细胞的迁移及侵袭。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。