一种牡丹发酵液的制备方法和产品及其应用

技术领域

本发明属于微生物发酵领域，具体涉及到一种牡丹发酵液的制备方法和产品及其应用。

背景技术

牡丹花(Paeonia suffruticosa)是芍药科芍药属植物，为我国特有的木本名贵花卉，素有国花之称。牡丹花不但具有观赏、文化价值，还有很高的食用和药用价值，在我国有悠久的食用和药用历史，其富含蛋白质、花青素、多酚类化合物、黄酮类化合物、糖类、多种氨基酸等物质，还有丰富的萜类和烃类化合物。许多研究表明，牡丹花具有很好的抗氧化效果。

人体的皮肤结构分为三层：表皮、真皮和皮下组织。与皱纹形成的关系密切的是真皮层。真皮层又分为乳头层和网状层，这两者之间没有明显的界限。真皮纤维由结缔组织细胞和基质组成。皮肤的坚实和弹性主要由真皮所决定。真皮最主要的纤维结缔组织包括胶原纤维、弹性纤维、网状纤维三种。在真皮网状层里的胶原纤维通常为一束，相互交错，与皮肤表面平行排列，具有一定的伸缩性。由于这些纤维的排列方向不同，加上其牵引力的影响，就在皮肤表面形成了无数细小的皮沟，这些皮沟与纤维束走向一致，也与皮肤弹性方向一致，就是潜在的皱纹了。

真皮是皮肤的支撑组织，它的细胞也就是成纤细胞，主要负责胶原及弹性蛋白纤维的生成。胶原纤维会形成一个密集的网状结构，以维护皮肤细胞组织及抵抗力，而更细的弹性蛋白纤维使皮肤柔软而具有弹性。胶原纤维与弹性纤维的数量会随着皮肤的老化而减少，并在45岁后完全消失。这些纤维浸在富含透明质酸的凝胶中，可以把水分锁在分子里，使确保皮肤滋润的重要一环。所以减少透明质质酸的流失变成为了抗皱纹的靶点之一。

透明质酸酶抑制剂是对透明质酸酶的激活有抑制作用的物质，是透明质酸的特异性裂解酶。透明质酸在人体许多发育和调控过程如细胞粘附、器官形成、创伤愈合、肿瘤发生和血管形成中起重要作用,抑制透明质酸酶的活性可使透明质酸不被分解,维持正常的生理功能，抑制HAase的活性可保证HA含量和功能正常。透明质酸酶抑制实验是最典型的抗敏活性评价体外方法，以透明质酸酶抑制率为指标评价物质的抗过敏活性，透明质酸酶抑制率越大则抗过敏活性越强。同时，跟皮肤弹性、衰老等相关。

酵母菌是一种单细胞真菌，并非系统演化分类的单元。一种肉眼看不见的微小单细胞微生物，能将糖发酵成酒精和二氧化碳，分布于整个自然界，是一种典型的异养兼性厌氧微生物，在有氧和无氧条件下都能够存活，是一种天然发酵剂。酵母发酵过程中，会表达丰富的生物酶，这些酶在特定适宜的温度条件下，可以催化特定产物发生转变，来达到发酵的目的。发明专利-CN202211009184.9和CN202110776090.3提出采用牡丹花来发酵可以提升多酚含量及抗氧化和美白活性，但对抗衰老的针对性不强。

发明内容

本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本申请的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。

鉴于上述和/或现有技术中存在的问题，提出了本发明。

因此，本发明的目的是，克服现有技术中的不足，提供一种牡丹发酵液的制备方法。

为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：一种牡丹发酵液的制备方法，包括，

将牡丹花粉碎，制得牡丹花粉末；

将牡丹花粉末与水混合均匀，加热至40～60℃充分搅拌1～2h使其溶胀，制得牡丹花悬液；

向牡丹花悬液中加入纤维素酶、果胶酶和木瓜蛋白酶水解，制得牡丹花悬液酶解液；

将牡丹花悬液酶解液配置成发酵培养基，接种微生物发酵，制得牡丹花发酵液；

将牡丹花发酵液进行高压匀浆处理，制得高压匀浆处理的牡丹花发酵液；

将高压匀浆处理的牡丹花发酵液在35～50℃条件下再次发酵6～8h，制得二次变温发酵的牡丹花发酵液；

将二次变温发酵的牡丹花发酵液，采用陶瓷膜过滤澄清，再利用超滤膜浓缩，得到所述牡丹发酵液。

作为本发明所述制备方法的一种优选方案，其中：所述牡丹花粉碎，包括将牡丹花粉碎至120目。

作为本发明所述制备方法的一种优选方案，其中：所述将牡丹花粉末与水混合均匀，其中，牡丹花粉末与水的质量比为1:9。

作为本发明所述制备方法的一种优选方案，其中：所述纤维素酶，其酶活为10000U/g，纤维素酶相对于牡丹花粉末的质量比为2:500；所述果胶酶，其酶活为100000U/g，果胶酶相对于牡丹花粉末的质量比为3.8:500；所述木瓜蛋白酶，其酶活为10000U/g，木瓜蛋白酶相对于牡丹花粉末的质量比为2.9:500。

作为本发明所述制备方法的一种优选方案，其中：所述水解温度为60℃，水解搅拌转速为100rpm/min，水解时间为6～8h。

作为本发明所述制备方法的一种优选方案，其中：所述将牡丹花悬液酶解液配置成发酵培养基，包括，

向牡丹花悬液酶解液中加入葡萄糖，用1M NaOH调节pH至6.8后，倒入10L发酵罐中，于121℃下灭菌20min，制得所述发酵培养基；其中，牡丹花悬液酶解液与葡萄糖的质量比为500:1。

作为本发明所述制备方法的一种优选方案，其中：所述接种微生物发酵，包括，

从-80℃冰箱中取出酵母甘油冻存管，于超净台中，无菌操作划线至固体YPD平板上，放置于28～30℃培养箱中，倒置培养3天，长出菌落后，无菌操作用接种环挑取单菌落，接种入装有100mlYPD液体培养基的500ml摇瓶中，并置于30℃、220rpm摇床中培养24h得到种子液；

向发酵培养基中接种种子液，设置温度为30℃，pH为6.8，转速为180rpm，通气量为0.5vvm，溶解氧大于30％开始发酵；

发酵过程检测pH和溶解氧指标，发酵至40h时，溶氧升高，pH不再降低，发酵结束，测定葡萄糖浓度为0；

其中，酵母包括酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae CICC1210)和红冬孢酵母(Rhodosporidium toruloides CICC31643)的一种或两种；

所述种子液相对于发酵培养基中牡丹花悬液酶解液的体积质量比为300mL：5000g。

作为本发明所述制备方法的一种优选方案，其中：所述高压匀浆处理，包括，用高压匀浆机于20℃条件下，1200Bar均质5遍；

所述采用陶瓷膜过滤澄清，其中，陶瓷膜孔径为200nm；所述利用超滤膜浓缩，分子量孔径为3000～10000Da。

本发明的再一个目的是，克服现有技术中的不足，提供一种牡丹发酵液的制备方法制得的产品，所述产品包括酿酒酵母牡丹发酵液和红冬孢酵母牡丹发酵液按照质量比1～2:1制得的混合物。

本发明的另一个目的是，克服现有技术中的不足，提供一种牡丹发酵液的制备方法制得的产品在制备抗皱化妆品中的应用。

本发明有益效果：

(1)本发明采用酵母菌发酵牡丹花，经过筛选获得最佳的两种酵母发酵液，赋予了牡丹花发酵液透明质酸钠酶抑制率活性，大大提升了牡丹花在抗皱化妆品中的应用和开发价值。

(2)本发明采用二次变温发酵和超滤膜浓缩后，逐步增加了牡丹花发酵液的透明质酸酶抑制率，并同时验证了其透明质酸酶抑制和抗糖基化作用的协同效果。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。其中：

图1为本发明不同酵母菌牡丹花发酵滤液在10％浓度下对透明质酸酶抑制效果图；

图2为本发明两种酵母在不同温度下二次变温发酵后对透明质酸抑制效果图；

图3为本发明两种酵母菌不同超滤膜浓缩后对透明质酸酶抑制效果图；

图4为本发明牡丹花酿酒酵母和红冬孢酵母发酵液在不同复配比例下的透明质酸酶抑制效果图；

图5为本发明牡丹花酿酒酵母和红冬孢酵母发酵液在不同复配比例下的抗糖化效果图。

具体实施方式

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合说明书实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。

在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。

其次，此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。

本发明牡丹花发酵滤液功效测评：

(1)透明质酸酶抑制率：

实验方法：

醋酸缓冲溶液(pH＝5.6)：

取1155μL冰乙酸于容量瓶中稀释至100mL，混匀后取4.8mL为A溶液；

取2.72g乙酸钠结晶，溶解并定容至100mL，混匀后量取45.2mL为B溶液；

混合A、B溶液，去离子水定容至100mL混匀。

精密测定其pH值，用溶液A或B调pH值至5.6。

透明质酸酶溶液：浓度50U/mL(注意标准品标注的酶活值)，配制完后根据每次使用量，用不同规格的离心管分装，以醋酸缓冲液为溶剂。

透明质酸钠溶液：称取10mg透明质酸钠(分子量10WDa)，加入到20mL醋酸缓冲溶液中，配制成0.5mg/mL的溶液，充分溶解后备用。

4℃冷藏可保存1周。

十六烷基三甲基溴化铵溶液：称取十六烷基三甲基溴化铵1g，加水至100g，45℃下搅拌溶解至澄清透明即可。用100mL样品瓶室温保存。气温低有晶体析出时，将整瓶放在45℃水浴中加热溶解即可。

实验反应体：

计算方法：

在紫外600nm处分别测定其吸光值。

抑制率按照以下公式计算：

抑制率(％)＝[1-(A2-A1)/(A阴-A阳)]×100％

(2)抗糖基化效果测试

试剂的配置：

50mM磷酸缓冲液(PB)，pH 7.4：称取二水合磷酸二氢钠1.56g，加水至200g，搅拌溶解完全，为A液；称取十二水合磷酸氢二钠3.58g，加水至200g，搅拌溶解完全，为B液；取适量B液加入A液中调节pH 7.4；

50mM PB，pH 10：与上述相同，最后pH调节至10；

1g/mLTCA溶液：TCA溶解于水；

600mM葡萄糖溶液：葡萄糖溶解于pH 7.4的PB；

3mg/mLBSA溶液：BSA溶解于pH 7.4的PB。

实验步骤：

分别取200μL样品、200μL葡萄糖溶液和200μLBSA溶液均匀混合，于100℃下反应1h。加入100μLTCA溶液，15000r/min离心4min，保留沉淀。沉淀溶解于600μL pH 10的PB，于激发波长370nm，发射波长450nm下检测荧光强度。

计算公式如下：

抑制率(％)＝[1-(As-Asb)/(Ac-Acb)]×100％

实施例1

不同酵母菌发酵发酵牡丹花：

分别对采用下列酵母菌发酵牡丹花：

粉状毕赤酵母(Pichia farinose CICC 1688)、扣囊复膜孢酵母(Saccharomycopsis fibuligera CICC1717)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae CICC1210)、红冬孢酵母(Rhodosporidium toruloides CICC 31643)。

具体步骤如下：

(1)牡丹花粉碎：取干燥牡丹花700g，用粉碎机完全打碎呈100目粉末；

(2)牡丹花悬液制备：将步骤1中500g牡丹花粉末，与4500g纯化水混合均匀，加热至55℃，搅拌2h使其充分溶胀；

(3)牡丹花悬液酶解：向步骤2中所得的牡丹花悬液中，加入2g纤维素酶(10000U/g)、3.8g果胶酶(100000U/g)、2.9g木瓜蛋白酶(10000U/g)，在60℃、100rpm/min条件下，搅拌水解6h；

(4)牡丹花发酵培养基配制：向步骤3中所得5000g牡丹花酶解液中，加入100g葡萄糖，用1M NaOH调节pH至6.8后，分别分装到500ml三角瓶中，装液量为100ml，于121℃下灭菌20min；

(5)酵母种子液培养:从-80℃冰箱中取出甘油冻存管，于超净台中，无菌操作划线至固体YPD平板上，放置于30℃培养箱中，倒置培养2天，长出菌落后，无菌操作用接种环挑取单菌落，接种入装有100mlYPD液体培养基的500ml摇瓶中，并置于30℃、220rpm摇床中培养16h得到种子液；

(6)牡丹花发酵培养基接种不同酵母菌发酵：向步骤(4)灭菌后冷却至28～30℃的装有牡丹花发酵培养基的三角瓶中分别接种步骤(5)培养好的酵母种子液，每个菌发酵体系接种5ml，置于恒温摇床中，设置温度为30℃，转速为220rpm，发酵40h。

(7)不同酵母菌牡丹花发酵液后处理：步骤(6)获得的不同菌种牡丹花发酵液，采用10000rpm离心10min，分别收集上清液，测试不同菌种发酵牡丹花前后功效；

结果，牡丹花分别通过酿酒酵母和红冬孢酵母发酵液对透明质酸抑制活性最强。

在同样酵母属菌中，粉状毕赤酵母和扣囊复膜孢酵母的透明质酸抑制活性相比前两种酵母弱。未发酵的样品，其透明质酸的抑制率最差(图1)。

所以，本发明选取酿酒酵母和红冬孢酵母发酵作为研究对象。

实施例2

不同温度下的二次变温发酵对透明质酸酶抑制作用的影响：

(1)牡丹花粉碎：取干燥牡丹花1000g，用粉碎机完全打碎呈100目粉末；

(2)牡丹花悬液制备：将步骤1中500g牡丹花粉末，与4500g纯化水混合均匀，加热至58℃，搅拌2h使其充分溶胀；

(3)牡丹花悬液酶解：向步骤2中所得的牡丹花悬液中，加入2g纤维素酶(10000U/g)、3.8g果胶酶(100000U/g)、2.9g木瓜蛋白酶(10000U/g)，在60℃、100rpm/min条件下，搅拌水解6h；

(4)牡丹花发酵培养基配制：向步骤3中所得5000g牡丹花酶解液中，加入100g葡萄糖，用1M NaOH调节pH至6.8后，倒入10L发酵罐中，于121℃下灭菌20min；

(5)酵母种子液培养:从-80℃冰箱中取出酵母甘油冻存管，于超净台中，无菌操作划线至固体YPD平板上，放置于30℃培养箱中，倒置培养3天，长出菌落后，无菌操作用接种环挑取单菌落，接种入装有100mlYPD液体培养基的500ml摇瓶中，并置于30℃、220rpm摇床中培养24h得到种子液；

(6)牡丹花发酵培养基接种微生物发酵：向步骤(4)灭菌后冷却至30℃的10L发酵罐中接种步骤(5)培养好的酵母种子液300ml，设置温度为30℃，pH为6.8，转速为180rpm，通气量为0.5vvm，溶解氧大于30％开始发酵。发酵过程检测pH和溶解氧指标，发酵至40h时，溶氧升高，pH不再降低，发酵结束，测定葡萄糖浓度为0；

(7)牡丹花发酵液预处理：步骤(6)获得的牡丹花发酵液，用高压匀浆机于20℃条件下，1200Bar均质5遍；

(8)牡丹花二次变温发酵：将经过高压匀浆处理的牡丹花发酵液，加入到发酵罐中，分别维持温度在35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃下发酵8h；

牡丹花发酵液后处理：获得的牡丹花发酵液，采用孔径为200nm陶瓷膜过滤澄清，收集滤液；

结果表明(图2)，测定浓度为10％的发酵液下，酿酒酵母在45℃时，抑制率为46.33±4.72％，50℃时抑制率为39.35±4.04％；红冬孢酵母在在45℃时，抑制率为41.32±2.08％，50℃时抑制率为54.37±1.52％。

酿酒酵母和红冬孢酵母的二次变温发酵的温度分别在为45-50℃时，其对透明质酸酶抑制效果最强。

但是，在35-40℃和55-60℃区间，透明质酸酶抑制率表现出显著降低。

实施例3

不同大小超滤膜过滤对透明质酸抑制效果的影响：

(1)牡丹花粉碎：取干燥牡丹花700g，用粉碎机完全打碎呈120目粉末；

(2)牡丹花悬液制备：将步骤1中500g牡丹花粉末，与4500g纯化水混合均匀，加热至55℃，搅拌2h使其充分溶胀；

(3)牡丹花悬液酶解：向步骤2中所得的牡丹花悬液中，加入2g纤维素酶(10000U/g)、3.8g果胶酶(100000U/g)、2.9g木瓜蛋白酶(10000U/g)，在60℃、100rpm/min条件下，搅拌水解6h；

(4)牡丹花发酵培养基配制：向步骤3中所得5000g牡丹花酶解液中，加入100g葡萄糖，用1M NaOH调节pH至6.8后，倒入10L发酵罐中，于121℃下灭菌20min；

(5)酵母菌种子液培养:从-80℃冰箱中取出酵母菌甘油冻存管，于超净台中，无菌操作划线至固体YPD平板上，放置于28～30℃培养箱中，倒置培养2天，长出菌落后，无菌操作用接种环挑取单菌落，接种入装有100mlYPD液体培养基的500ml摇瓶中，并置于28℃～30℃、220rpm摇床中培养20h得到酵母菌种子液；

(6)牡丹花发酵培养基接种微生物发酵：向步骤(4)灭菌后冷却至30℃的10L发酵罐中接种步骤(5)培养好的酵母种子液300ml，设置温度为30℃，pH为6.8，转速为180rpm，通气量为0.5vvm，溶解氧大于30％开始发酵。发酵过程检测pH和溶解氧指标，发酵至40h时，溶氧升高，pH不再降低，发酵结束，测定葡萄糖浓度为0；

(7)牡丹花发酵液预处理：步骤(6)获得的牡丹花发酵液，用高压匀浆机于20℃条件下，1200Bar均质5遍；

(8)牡丹花二次发酵：将经过高压匀浆处理的酿酒酵母和红冬孢酵母牡丹花发酵液，加入到发酵罐中，分别维持温度在酿酒酵母45℃、红冬孢酵母50℃下发酵8h；

牡丹花发酵液后处理：获得的牡丹花发酵液，采用孔径为200nm陶瓷膜过滤澄清，收集滤液；分别采用3000、5000、10000Da超滤膜过滤，收集透过液，为酿酒酵母和红冬孢酵母牡丹花发酵滤液；

结果表明(见图3)，在测定浓度为10％的发酵液下，酿酒酵母与红冬孢酵母都在5000Da过滤后，透明质酸酶抑制效果是最佳的。

其抑制率分别为，酿酒酵母发酵液为92.14％±5.29％，红冬孢酵母为66.33％±6.028％。

实施例4

对实施列3中，所提及到的酿酒酵母和红冬孢酵母5000Da膜处理后的样品，进一步讨论了其配比比列对透明质酸酶的抑制效果(图4)和抗糖基化效果(图5)的协同作用的影响。

在此实验中，发现透明质酸酶的抑制效果和抗糖基化效果在10％的样品浓度下，均超过>90％,难以形成对比。

所以测定浓度调整为5％的浓度为测试样品浓度。

酿酒酵母和红冬孢酵母的牡丹花发酵的复配比列在1.5:1.5(w/w％)时，对透明质酸酶抑制活性最高，为61.25±6.11％；

其次为2:1(w/w％)时，其透明质酸酶抑制为45.32±2.08％；

抗糖基化作用的研究中，酿酒酵母和红冬孢酵母的牡丹花发酵的复配比列在2:1(w/w％)时，其抗糖基化能力达到75.32±2.51％为最高。同时，酿酒酵母和红冬孢酵母的牡丹花发酵的复配比列在1.5:1.5(w/w％)时，抗糖基化能力为63.01±1.84％次之。可以看出，酿酒酵母和红冬孢酵母的牡丹花发酵物复配时，对透明质酸酶活性的抑制和抗糖基化存在协同作用。

应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。