谷氨酸脱氢酶启动子突变体及其应用

技术领域

本发明属于分子生物学领域，具体涉及谷氨酸脱氢酶基因启动子的突变体，包含启动子突变体的表达盒、重组载体、重组宿主细胞，以及增强目标基因表达的方法、制备蛋白的方法和生产氨基酸例如谷氨酸的方法。

背景技术

谷氨酸作为重要的氨基酸之一，是构成动物营养所需蛋白质的基本物质，被广泛应用于医药、健康、食品、动物饲料和化妆品等行业中，主要采用微生物发酵法来生产。目前，由于棒杆菌的生理优越性，棒杆菌已成为工业中最重要的谷氨酸生产菌株。随着生物技术的不断发展，对棒杆菌进行代谢工程改造提高其谷氨酸产量的报道逐渐增多，这些改造包括加强谷氨酸合成途径相关酶的表达，减弱竞争性途径相关酶的表达等等。

谷氨酸脱氢酶（glutamate dehydrogenase，由

发明内容

本发明基于谷氨酸棒杆菌的

第一方面，本发明提供具有增强活性的谷氨酸脱氢酶基因启动子的突变体，特征在于，所述突变体的多核苷酸选自如下任一项：

（i）如SEQ ID NO：2所示的核苷酸；

（ii）包含与（i）所示的核苷酸序列的反向互补序列的多核苷酸；

（iii）包含在高严格性杂交条件或非常高严格性杂交条件下，能够与（i）或（ii）所示的核苷酸序列杂交的序列的反向互补序列的多核苷酸。

进一步地，所述突变体的核苷酸序列还包括在对应于SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列的第789至第799位存在突变的核苷酸。优选地，所述突变体的核苷酸序列如SEQ IDNO：3-5所示。

其中，所述“多核苷酸”指由核苷酸组成的聚合物。多核苷酸可以是单独片段的形式，也可以是更大的核苷酸序列结构的一个组成部分，其是从至少在数量或浓度上分离一次的核苷酸序列衍生而来的，能够通过标准分子生物学方法（例如，使用克隆载体）识别、操纵以及恢复序列及其组分核苷酸序列。当一个核苷酸序列通过一个DNA序列（即A、T、G、C）表示时，这也包括一个RNA序列（即A、U、G、C），其中“U”取代“T”。换句话说，“多核苷酸”指从其他核苷酸（单独的片段或整个片段）中去除的核苷酸聚合物，或者可以是一个较大核苷酸结构的组成部分或成分，如表达载体或多顺反子序列。多核苷酸包括DNA、RNA和cDNA序列。

所述“野生型的”指在自然界中可以找到的对象。例如，一种存在于生物体中，可以从自然界的一个来源中分离出来并且在实验室中没有被人类有意修改的多肽或多核苷酸序列是天然存在的。如本公开所用的，“天然存在的”和“野生型的”是同义词。在一些实施方式中，本公开中野生型的启动子是指野生型gdh基因的启动子，也即如SEQ ID NO：1所示序列的多核苷酸。

所述“突变体”是指相对于“野生型”，或者“相比较的”多核苷酸或多肽，在一个或多个（例如，若干个）位置处包含改变（即，取代、插入和/或缺的多核苷酸，其中，取代是指用不同的核苷酸置换占用一个位置的核苷酸。缺失是指去除占据某一位置的核苷酸。插入是指在邻接并且紧随占据位置的核苷酸之后添加核苷酸。在具体的实施方式中，所述“突变”为“取代”，是由一个或多个核苷酸中的碱基被另一个不同的碱基取代所引起的突变，也称为碱基置换突变（subsititution）或点突变（point mutation）。

所述“启动子”是指一种核酸分子，通常位于目的基因编码序列的上游，为RNA聚合酶提供识别位点，并位于mRNA转录起始位点的5’方向的上游。它是不被翻译的核酸序列，RNA聚合酶与这一核酸序列结合后启动目的基因的转录。所述“RBS”是指核糖体结合位点（ribosomebinding site），是指mRNA的起始AUG上游的一段非翻译区，可被16SrRNA识别，起始翻译。

本发明的启动子的突变体是改进的谷氨酸棒杆菌的

所述“互补的”是指在核苷酸或核苷酸之间的杂交或碱基配对，例如双链DNA分子的两条链之间或者寡核苷酸引物与被测序或扩增的单链核苷酸上的引物结合位点之间等。

所述“高严格条件”是指，对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃处在5X SSPE（saline sodium phosphate EDTA）、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑精DNA和50％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。最后在65℃处使用2XSSC、0.2％SDS将载体材料洗涤三次，每次15分钟。

所述“非常高严格条件”是指，对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃处在5X SSPE（saline sodium phosphate EDTA）、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑精DNA和50％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。最后在70℃处使用2XSSC、0.2％SDS将载体材料洗涤三次，每次15分钟。

本发明的启动子核酸分子可以使用标准的分子生物学技术分离或制备。例如，可以使用合适的引物序列通过PCR来分离本发明的启动子核酸分子。此外，也可以使用自动DNA合成仪通过标准合成技术来制备本发明的启动子核酸分子。

第二方面，本发明提供包含第一方面所述启动子的表达盒、重组载体。

所述“表达盒”具有本领域技术人员普遍理解的意思，即含有启动子、目的基因并且能够将目的基因进行表达的元件。

所述“载体”指的是DNA构建体，其含有与合适的控制序列可操作地连接的DNA序列，从而在合适的宿主中表达目的基因。本发明所使用的载体并没有特别的限制，可为本领域中已知的任何载体，只要它能够在宿主中进行复制即可。即所述载体包括但不限于质粒，噬菌体，例如本发明具体实施例中使用的pEC-XK99E质粒。一旦转化入合适的宿主之后，所述载体可以复制并独立于宿主基因组发挥功能，或者在某些情况下整合入基因组本身。

第三方面，本发明提供了含有第一方面所述启动子、或第二方面所述表达盒、重组载体的重组微生物宿主细胞。

重组微生物宿主细胞具体通过转化来实现。此处“转化”具有本领域技术人员普遍理解的意思，即将外源性的DNA导入宿主的过程。所述转化的方法包括任何将核酸导入细胞的方法，这些方法包括但不限于电穿孔法、磷酸钙(CaPO

所述“宿主细胞”是具有本领域普通技术人员通常理解的含义，即，能够导入本发明的具有启动子活性的核酸的细胞，导入之后称为重组宿主细胞。换言之，本发明可以利用任何宿主细胞，只要其细胞中含有本发明的具有启动子活性的核酸，并且与某一基因可操作性地连接介导该基因的转录。本发明的宿主细胞可以是原核细胞或真核细胞，优选肠杆菌或棒杆菌，更优选谷氨酸棒杆菌，包括但不限于谷氨酸棒杆菌ATCC 13869、谷氨酸棒杆菌ATCC 13032、谷氨酸棒杆菌B253、谷氨酸棒杆菌ATCC 14067，以及由上述菌株制备的产生L-氨基酸的突变体或菌株。示例地，所述宿主细胞可以是任何菌株，只要该菌株具有生产L-氨基酸的能力，其包括野生型菌株和重组菌株。

示例地，所述生产谷氨酸的宿主细胞可以是在谷氨酸棒杆菌ATCC 13869基础上，选自以下的一个或多个基因被弱化或表达降低：

a.编码α-酮戊二酸脱氢酶的

b.编码琥珀酸脱氢酶的

在一些实施方式中，示例地，所述宿主细胞中选自以下的一个或多个基因被增强或过表达：

a. 编码丙酮酸羧化酶的

b. 编码谷氨酸脱氢酶的

c. 编码柠檬酸合酶的

d.编码天磷酸转酮酶的

e.编码磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的

f. 编码磷酸盐转运蛋白的

g.编码机械敏感通道蛋白的

在本发明中，所述宿主细胞的培养可以根据本领域的常规方法进行，包括但不限于孔板培养、摇瓶培养、批次培养、连续培养和分批补料培养等，并可以根据实际情况适当地调整各种培养条件如温度、时间和培养基的pH值等。

第四方面，本发明提供一种增强目的基因表达的方法，所述方法包括将第一方面所述的启动子与目的基因可操作地连接。

其中，所述目的基因是指编码微生物中目标蛋白质的基因。示例性的，目的基因是编码与目标化合物的生物合成相关的酶的基因、编码与还原力相关的酶的基因，编码与糖酵解或TCA循环相关的酶的基因，或编码与目标化合物的释放相关的酶的基因等等。

所述“可操作地连接”是指本发明的谷氨酸脱氢酶基因启动子的突变体与编码基因功能性连接，以启动和介导所述基因的转录，表明本发明的谷氨酸脱氢酶基因启动子的突变体与编码基因可操作地连接以控制操纵子基因的转录活性。所述可操作地连接的方式可以采用本领域技术人员所述的任何方式。本发明所述的增强目的基因表达的方法中，利用本发明的所述谷氨酸脱氢酶基因启动子的突变体的基础上，采用包括本领域技术人员通常使用的方法实现。

在一个具体实施方式中，所述编码基因是谷氨酸脱氢酶的基因，其可催化α-酮戊二酸生成谷氨酸，是谷氨酸生物合成的关键酶，同时由于谷氨酸是脯氨酸、赖氨酸等的合成前体，已有大量文献报道增强谷氨酸脱氢酶的表达，可以提高菌株的谷氨酸、脯氨酸和赖氨酸等的产量(WO0053726A1，JP61268185A，CN1262640C，Keleshyan, SK et al., Influenceof Glutamate Dehydrogenase Activity on L-Proline Synthesis, APPLIEDBIOCHEMISTRY AND MICROBIOLOGY, 2017,53(5):518-523)。本发明的所述的系列强度启动子元件，可用于适度调控目标基因的表达，实现目标产物的高效生产。

本发明的谷氨酸脱氢酶基因启动子突变体可以被用作棒杆菌或肠杆菌中其他基因的表达，包括但不限于氨基酸合成相关的基因，如天冬氨酸激酶LysC、苏氨酸操纵子ThrABC、天冬氨酸半醛脱氢酶Asd、天冬氨酸氨裂合酶AspB、高丝氨酸脱氢酶Hom、高丝氨酸O-乙酰基转移酶MetX、二氢吡啶二羧酸合成酶DapA、二氢吡啶甲酸还原酶DapB、内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶Ddh、谷氨酸激酶ProB、谷氨酸-5-半醛脱氢酶ProA、吡咯-5-羧酸脱氢酶ProC、脯氨酸脱氢酶/吡咯-5-羧酸脱氢酶PutA等等。

第五方面，本发明提供一种生产氨基酸的方法，所述方法包括培养第四方面所述的宿主细胞，收集产生的氨基酸。其中，所述氨基酸包括脯氨酸、赖氨酸、谷氨酸、羟脯氨酸、精氨酸、鸟氨酸、谷氨酰胺等。更优选地，所述氨基酸生产相关的基因包括但不限于

本发明所述的生产氨基酸的方法中，利用本发明的所述谷氨酸脱氢酶基因启动子突变体基础上，采用包括本领域技术人员通常使用的方法，同时也包括从细胞或培养液中回收氨基酸的步骤。从细胞或培养基中回收氨基酸的方法是本领域公知的，包括但不限于：过滤、阴离子交换色谱、结晶和HPLC。

在本发明的一个具体实施方式中，所述宿主细胞是谷氨酸棒杆菌，进一步地是经过改良是谷氨酸棒杆菌，具体地是在所述菌中的

本发明的有益效果：本发明提供的具有启动子活性的多核苷酸表现出比野生型更高的启动子活性，可用于增强目的基因的表达，例如与

具体实施方式

除非另有定义，本文所用的所有技术和科学术语与本发明所属领域普通技术人员通常理解的意义相同。虽然可利用与本文所述相似或等价的任何方法和材料来实施或检验本发明，但优选此处提供的方法和材料。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中所用到的实验技术与实验方法，如无特殊说明均为常规技术方法，例如下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册 (New York: Cold Spring Harbor LaboratoryPress, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可通过正规商业渠道获得。

实施例中所用的培养基如下：

TSB平板培养基成份为（g/L）：葡萄糖，5 g/L；酵母粉，5 g/L；大豆蛋白胨，9 g/L；尿素，3 g/L；丁二酸，0.5 g/L；K

TSB液体培养基成份为（g/L）：葡萄糖，5 g/L；酵母粉，5 g/L；大豆蛋白胨，9 g/L；尿素，3 g/L；丁二酸，0.5 g/L；K

谷氨酸发酵实验使用的种子培养基成份为：葡萄糖，25 g/L；KH

谷氨酸发酵实验使用的发酵培养基成份为：葡萄糖，80 g/L；KH

实施例1谷氨酸棒杆菌

（1）谷氨酸棒杆菌

根据已公开的谷氨酸棒杆菌ATCC 13869基因组（GenBank: CP016335.1）序列，设计扩增引物gdh-1/2，以ATCC 13869基因组为模板，扩增包含

（2）谷氨酸棒杆菌

设计引物Pgdh-Ts24-F/R，以上述pEC-XK99E-P

表1 构建表征载体引物

（3）谷氨酸棒杆菌

将上述表征载体分别转化至谷氨酸棒杆菌ATCC 13869，涂布于含有25 μg/mL卡那霉素的TSB固体平板，获得重组菌株。接种转化子至每孔含有800 μL TSB液体培养基的24孔板中，每个菌株3个平行，孔板摇床转速为800 rpm，30℃培养16 h后利用酶标仪检测菌株的荧光强度。荧光测定激发波长为560 nm，发射波长为607 nm；同时测定菌液OD

表2

实施例2谷氨酸棒杆菌

（1）启动子突变体文库的构建及初步筛选

本实施例对实施例1中获得

以实施例1构建的pEC-XK99E-P

将以上质粒文库，转化至谷氨酸棒杆菌ATCC13869，涂布于含有25 μg/mL卡那霉素的TSB固体平板，通过荧光成像系统对长有数百个克隆的平板进行荧光拍照，根据克隆的荧光亮度初步筛选表达强度提高的突变体。同时将实施例1中获得的pEC-XK99E-P

表3文库建库引物

（2）启动子突变体文库的表征及序列分析

对以上平板中荧光成像显示荧光亮度增强的突变体进行96孔板培养表征启动子的强度。将平板获得的荧光亮度增强的克隆和野生型及突变型启动子的对照菌株，分别用枪头接种至每孔含有200 μL TSB液体培养基的96孔板中，培养基中添加25 μg/mL卡那霉素，每个菌株各3个平行，孔板摇床转速为800 rpm，30℃培养16 h后采用酶标仪检测菌株的荧光强度。荧光测定激发波长为560 nm，发射波长为607 nm；同时测定菌液OD

表4

实施例3谷氨酸棒杆菌

（1）谷氨酸棒杆菌

根据已公开的谷氨酸棒杆菌ATCC 13869基因组（GenBank: CP016335.1）和质粒pEC-XK99E序列，设计扩增引物。以PEC-1和P-gdh-2为引物，分别以pEC-XK99E-P

（2）L-谷氨酸生产菌株构建

已有文献报道了在谷氨酸棒杆菌ATCC 13869基因组

根据已公开的谷氨酸棒杆菌ATCC 13869基因组（GenBank: CP016335.1）序列，设计引物A111V-UH-F/R和A111V-DH-F/R。以ATCC13869基因组为模板，分别利用上述引物通过PCR扩增获得带有YggB

采用文献报道的方法制备

表5本实施例所用引物

（3）基因启动子突变体应用于L-谷氨酸生产的菌株构建

为了验证

首先将菌株接种到种子培养基中培养8 h，培养物作为种子接种到每孔含有800 μL添加25 μg/mL卡那霉素的发酵培养基的24孔板中，初始OD

表6L-谷氨酸生产

从表中可知，P