circPOK在治疗转移性乳腺癌中的应用

技术领域

本发明属于医药领域，具体涉及circPOK在治疗转移性乳腺癌中的应用。

背景技术

全球乳腺癌发病率约占女性恶性肿瘤的30%，世界范围内发病率从27/10万 (非洲和东亚)到97/10万 (北美)不等，死亡率与发病率之比为15%，严重威胁女性的健康

目前能有效治愈转移性乳腺癌尚未见报道，大多数转移性乳腺癌患者在余生的大部分时间里都要接受治疗

环状RNA(CircRNAs)首次在植物病毒中被发现

CircPOK在间质瘤中作为一个非编码的原癌基因RNA独立地发挥作用，CircPOK通过共激活ILF2/3复合体进一步调节促增殖和促血管生成因子，从而促进间质瘤的发生发展

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发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的至少一个不足，提供circPOK在治疗转移性乳腺癌中的应用。

本发明所采取的技术方案是：

本发明的第一个方面，提供：

定量样本中circPOK表达量的试剂在制备乳腺癌预后检测试剂中的应用。

在一些应用的实例中，所述定量样本中circPOK表达量的试剂选自circRNA组织芯片，免疫荧光原位杂交试剂或PCR试剂。

在一些应用的实例中，所述样本为患者血清和/或组织。

本发明的第二个方面，提供：

一种乳腺癌预后分析系统，包括：

circRNA表达量检测装置，用于检测样本中circPOK的表达量；

预后分析装置，基于circPOK的表达量，确定乳腺癌预后；

结果输出装置，用于输出预后分析装置分析得到的结果。

在一些乳腺癌预后分析系统的实例中，所述circRNA表达量检测装置选自circRNA组织芯片、免疫荧光原位杂交分析装置和PCR检测装置中的至少一种。

在一些乳腺癌预后分析系统的实例中，所述样本为患者血清和/或组织。

在一些乳腺癌预后分析系统的实例中，circPOK表达量显著增加时，判定为乳腺癌转移低风险，乳腺癌患者预后较好。

本发明的第三个方面，提供：

circPOK表达量促进剂在制备治疗或辅助治疗转移性乳腺癌制剂中的应用。

在一些应用的实例中，所述促进剂选自circPOK启动子激动剂、表达circPOKmRNA的质粒、负载有circPOKmRNA的载体。

本发明的有益效果是：

发明人通过qRT-PCR技术检测了15对乳腺癌临床组织样本及相应的正常乳腺组织中circRNAcircPOK的表达情况，结果显示circPOK在乳腺癌组织中的表达水平低于正常组织。通过人乳腺癌组织芯片对circPOK表达进行验证，证实circRNAcircPOK不仅在乳腺癌组织中低表达，且circPOK低表达与乳腺癌患者预后差密切相关，提示circRNAcircPOK可能是抑制乳腺癌发生发展中的重要调控因子。接着，发明人对circRNAcircPOK进行了体外细胞功能学的研究，进一步的实验研究表明，与对照组细胞株相比，高表达circPOK能抑制乳腺癌细胞株的迁移能力。过表达circPOK表达后，MDA-MB-231和HCC1806乳腺癌细胞株迁移能力减弱，体内实验证实，circPOK能有效抑制裸鼠乳腺癌肺转移瘤形成。由此可见circPOK在乳腺癌中起着抑制肿瘤发生发展的作用。

附图说明

图1是circPOK在乳腺癌细胞、乳腺癌组织中的表达量及与预后相关的结果。

图2是circPOK在体内和体外对乳腺癌细胞侵袭、迁移影响的结果。

图3和图4是circPOK外泌体在体内和体外抑制乳腺癌侵袭迁移的实验结果。

具体实施方式

本发明的第一个方面，提供：

定量样本中circPOK表达量的试剂在制备乳腺癌预后检测试剂中的应用。

定量样本中circPOK表达量的试剂可以是各种已知的试剂，在一些应用的实例中，所述定量样本中circPOK表达量的试剂选自circRNA组织芯片，免疫荧光原位杂交试剂或PCR试剂。

在一些应用的实例中，所述样本为患者血清和/或组织。

本发明的第二个方面，提供：

一种乳腺癌预后分析系统，包括：

circRNA表达量检测装置，用于检测样本中circPOK的表达量；

预后分析装置，基于circPOK的表达量，确定乳腺癌预后；

结果输出装置，用于输出预后分析装置分析得到的结果。

在一些乳腺癌预后分析系统的实例中，所述circRNA表达量检测装置选自circRNA组织芯片、免疫荧光原位杂交分析装置和PCR检测装置中的至少一种。

在一些乳腺癌预后分析系统的实例中，所述样本为患者血清和/或组织。

在一些乳腺癌预后分析系统的实例中，circPOK表达量显著增加时，判定为乳腺癌转移低风险，乳腺癌患者预后较好。

本发明的第三个方面，提供：

circPOK表达量促进剂在制备治疗或辅助治疗转移性乳腺癌制剂中的应用。

在一些应用的实例中，所述促进剂选自circPOK启动子激动剂、表达circPOKmRNA的质粒、负载有circPOKmRNA的载体。

下面结合实验数据，进一步说明本发明的技术方案。

研究表明circPOK在乳腺癌组织和大部分乳腺癌细胞系中低表达：

首先，采用qRT-PCR检测2 株乳腺癌细胞和1株正常乳腺细胞系表达，发现circPOK在乳腺癌细胞中低表达（图1 B）。发明人从南华大学附属第一医院乳甲外科收集乳腺癌新鲜样本，并通过qRT-PCR检测了15对乳腺癌临床组织样本和相应的正常乳腺组织中circPOK的表达情况，结果显示乳腺癌组织中circPOK的表达水平低于正常组织（图1C），发明人从中山大学附属肿瘤医院的收集的乳腺癌样本qRT-PCR检测也得到了同样的结果（图1D）。

研究表明circPOK抑制乳腺癌的转移相关：

为了探讨circPOK在乳腺癌中的临床意义，发明人从南华大学附属第一医院病理科收集乳腺癌样本，在赛维尔生物技术公司制作人乳腺癌组织芯片。对上述获得的人乳腺癌组织芯片进行荧光原位杂交，结果显示circPOK在乳腺癌组织与癌旁组织的表达存在显著差异（图1 E）。接下来发明人分析了circPOK表达水平与乳腺癌患者临床病理特征的相关性，结果显示circPOK表达水平与乳腺癌的肿瘤大小及远处转移呈显著负相关性（P＜0.05）（表1）。

表1

**在0.01的水平上具有显著性(双侧检验)

*在0.05的水平上具有显著性(双侧检验)。

研究表明circPOK在乳腺癌中抑制乳腺癌细胞侵袭迁移：

鉴于circPOK在乳腺癌组织中低表达，并与乳腺癌患者预后密切相关。为研究circPOK在乳腺癌发生发展中的作用，发明人在发明人构建了circPOK稳定过表达细胞株。在MCF-7、MDA-MB-231和HCC1806乳腺癌细胞株中稳定过表达circPOK，通过划痕及Transwell小室侵袭迁移实验检测过表达circPOK对2株乳腺癌癌细胞的侵袭、迁移能力的影响，发现过表达circPOK能显著抑制乳腺癌细胞的侵袭迁移（图2 A-B）。上述实验结果表明，过表达circPOK可抑制乳腺癌细胞的侵袭、迁移能力。

为进一步确定circPOK在体内是否也具有抑制乳腺癌细胞侵袭迁移的作用，发明人将circPOK高表达的MDA-MB-231细胞通及其对照细胞过尾静脉注射构建了裸鼠转移瘤模型，并设置对照组。与对照组相比，circPOK过表达组可以显著抑制裸鼠肺部转移结节的形成（图2C-D），我们并通过对肺结节HE染色证实肺结节为乳腺癌转移灶。上述实验结果说明，circPOK过表达能有效抑制乳腺癌细胞的肺转移。

发明人发现MCF-7、MDA-MB-231和HCC1806 circPOK稳定过表达细胞的条件培养基中的circPOK发生了显著上调（图3A-B），且MDA-MB-231和HCC1806细胞与circPOK过表达的条件培养基共培养后细胞的侵袭迁移能力较对照组明显减弱（图3C）。发明人提取条件培养基的外泌体，并通过电镜及Western Blotting检测（CD9,TSG101,CD63为外泌体标志物）证实外泌体提取成功（图3D-E），发明人通过免疫荧光检测发现circPOK及对照组的外泌体摄取率并无显著差异（DIO为外泌体标志物，DAPI为细胞核特异性着色）（图3F），circPOK过表达外泌体较对照组外泌体更能显著抑制MDA-MB-231细胞的Transwell小室侵袭，迁移能力（图4 G）。为探究外泌体装载的circPOK在体内对乳腺癌转移的影响，发明人通过用荧光素酶(Luciferase )基因标记的MDA-MB-231细胞构建了裸鼠乳腺癌肺转移模型，通过尾静脉注射外泌体装载的circPOK/对照外泌体，通过小动物活体成像发现外泌体装载的circPOK能显著抑制乳腺癌的肺转移（图4 H）。

综上所述，发明人的研究发现circPOK，在乳腺癌组织和乳腺癌细胞系中低表达，circPOK高表达与转移性乳腺癌患者预后较好密切相关。功能实验显示circPOK在体内外均能抑制乳腺癌细胞的侵袭迁移。因此circPOK可作为治疗转移性乳腺癌的一个新的治疗靶点。

以上是对本发明所作的进一步详细说明，不可视为对本发明的具体实施的局限。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的简单推演或替换，都在本发明的保护范围之内。