SARS-CoV-2蛋白与宿主细胞的分子和细胞机制的相互作用以及治疗COVID-19的制剂

技术领域

本发明提供治疗新冠肺炎传染病的药物组合物和方法。本发明还提供预防或预防性治疗新冠肺炎传染病的药物组合物和方法。

发明内容

新冠肺炎传染病的治疗或预防极具挑战性。

这是因为SARS-CoV-2有许多变种，其中一些变种具有

i)传播力增加，

ii)毒力增加，以及

iii)疫苗效力降低。

在第一方面，本发明提供用于治疗新冠肺炎传染病的药物组合物和方法，包括向患者施用包含治疗有效量的大麻二酚的药物组合物，其中向患有新冠肺炎的所述患者施用所述药物组合物可由于以下至少一种作用而增强患者的先天免疫，

i)使患者受感染的细胞在感染后早期发生凋亡；

ii)诱导患者体内的干扰素转录；

iii)在患者体内诱导干扰素诱导的抗病毒效应物。

在第二方面，本发明还提供了用于预防或预防治疗新冠肺炎传染病的药物组合物和方法，包括向哺乳动物/人施用此类药物组合物，所述药物组合物包含治疗有效量的大麻二酚，其中向患有新冠肺炎的所述患者施用所述药物组合物可由于以下至少一种作用而增强患者的先天免疫，

i)诱导患者体内的干扰素转录；

ii)在患者体内诱导干扰素诱导的抗病毒效应剂。

在第三方面，本发明提供了一种药物组合物和施用药物组合物的方法，所述药物组合物包含治疗有效量的大麻二酚，用于预防或减少Sars-Cov-2突变。

通过将所述药物组合物施用到所述感染新冠肺炎的患者，在感染后早期使患者受感染的细胞发生凋亡，使其无法让病毒突变。

在第四方面，本发明提供了药物组合物和用于施用药物组合物的方法，所述药物组合物包括有效量的大麻二酚，用于预防或更好地为即将感染哺乳动物/人类的新冠肺炎传染病做准备，其中向患有新冠肺炎的所述患者施用所述药物组合物可由于以下至少一种作用而增强患者的先天免疫，

i)在哺乳动物/人中诱导干扰素转录；

iii)在哺乳动物/人中诱导干扰素诱导的抗病毒效应物；

其中这种诱导在开始时不与细胞凋亡相关，使细胞能够为病毒威胁做好准备。并且其中所述细胞在感染后早期发生凋亡，这使得所述细胞不能用于病毒的复制和/或突变。

附图说明

图1-5描述了通过将溴脱氧尿苷(BrdU)掺入并定量到活跃增殖细胞的DNA中来测量的细胞增殖率。吸光度值用ELISA测定，通过使用BioTek Synergy H1混合多模微孔板阅读器在370nm(参考波长：约492nm)测量。

将HEK293(人胚胎肾)细胞接种在96孔板中，然后用表达空对照的载体(pCMV-3Tag-3a)或表达病毒Orf8、Orf10或M蛋白的载体转染。未转染对照细胞也被测试，但与pCMV对照没有显著差异。

几小时后，用1μM大麻二酚处理细胞，然后生长24小时，并使用比色ELISA检测BrdU的掺入。

发明人进行了双向方差分析。这已经在多个不同的天/周进行多次单独的测定，其中n＝5至6个生物重复品(其中细胞的单独传代被视为不同的生物重复品)。每个生物复制品在每个平板上接种2至6个技术复制品，并在每个试验中对其进行平均，得出本试验中该生物复制品的n＝1。

图1提供了一个“未经处理”条件下的实验数据，该实验中，HEK293(人类胚胎肾)细胞用表达空对照载体的质粒转染(pCMV-3Tag-3a)或表达病毒Orf8、Orf10或M蛋白的载体的质粒转染。

实验还对未转染的对照细胞(图中未显示)进行了测试，但结果与pCMV对照没有显著差异。

病毒质粒似乎只引起细胞增殖的轻微减少(或者，可能增加细胞死亡或两者都有)。如果考虑误差条，这种微小的减少甚至更少，它对于病毒质粒对细胞增殖的影响的结论来说并不显著。这些数据没有被归一化以解释每孔细胞数量的差异，因此在从这些数据得出任何结论之前，必须进行归一化。

图2提供了一个对照条件下的实验数据，该实验中用表达空对照载体(pCMV3Tag-3a)的质粒转染HEK293(人类胚胎肾)细胞并进一步用大麻二酚处理。

大麻二酚对BrdU掺入经对照质粒转染的细胞没有显著影响。

它们也不影响未转染对照细胞或用另一对照载体pEGFP-N1(该图中未显示数据)转染细胞的生长。

图3提供了一个条件下的实验数据，该实验中用表达病毒Orf8蛋白的质粒转染HEK293(人胚胎肾)细胞并进一步用大麻二酚进行处理。

令人惊讶的是，观察到了平均细胞增殖的显著降低，尽管由于该数据未归一化为孔中存在的细胞数量，因此无法得出结论。这一减少可能是由于细胞增殖减少，或细胞数量减少，或两者兼而有之。

在表达Orf8的细胞中，与未处理的细胞相比，通过任何大麻二酚处理，BrdU掺入显著减少。这可能反映了平均细胞增殖的显著降低，或细胞增殖的速率相同，但细胞数量减少。使用Tukey多重比较检验进行单因素方差分析，其中不同上标的列显著不同，***P<0.001，****P<0.0001。

在表达Orf8并用大麻二酚处理的细胞中，平均BrdU掺入量比表达Orf8但未经大麻二酚处理的细胞低43.52％。

图4提供了一个条件下的实验数据，在该实验中，用表达病毒Orf10蛋白载体的质粒转染HEK293(人胚胎肾)细胞并进一步用大麻二酚处理。

令人惊讶的是，观察到平均BrdU掺入显著减少。

在表达Orf10的细胞中，与未处理的细胞相比，通过任何大麻二酚处理，BrdU掺入显著减少，除了δ8-四氢大麻二酚，表现出较少的减少。这可能反映了平均细胞增殖的显著减少，或者可能表明细胞数量减少，或者这些结果的组合。使用Tukey多重比较检验进行单因素方差分析，其中带有不同上标的列差异显著，**P<0.01，***P<0.001，***P<0.001，***P<0.0001。

在表达Orf10并用大麻二酚处理的细胞中，平均BrdU掺入量比表达Orf10但未经大麻二酚处理的细胞低30.44％。

图5提供了一个条件下的实验数据，在该实验中，用表达病毒M蛋白载体的质粒转染HEK293(人胚胎肾)细胞并用大麻二酚进一步处理。

令人惊讶的是，观察到平均BrdU掺入显著减少。

在表达M蛋白的细胞中，与未处理的细胞相比，通过任何大麻二酚处理，BrdU掺入显著减少。

这可能反映了平均细胞增殖的显著下降，也可能反映了以相同速率增殖的每个孔中细胞数量的减少或两者的组合。使用Bonferonni多重比较检验进行单因素方差分析，其中不同上标的列存在显著差异，**P<0.01。

在表达M蛋白并用大麻二酚处理的细胞中，平均BrdU掺入量比表达M蛋白但未经大麻二酚处理的细胞低37.28％。

图6结合了所有图中的数据，以便进行比较。

图7A、7B和7C显示了BrdU掺入/细胞增殖，因此表明分别用ORF8、ORF10和M蛋白转染的细胞中，无论用或不用大麻二酚处理，BrdU掺入核DNA的水平归一化为相对细胞数。这些图表明，无论用CBD处理还是不用CBD处理(载体对照)，用对照质粒转染或用表达ORF8或ORF10或M蛋白的质粒转染的细胞之间，每个细胞的BrdU掺入水平没有显著差异。这表明，病毒蛋白或CBD或两者的组合不会显著改变HEK293细胞的增殖速率。它还表明，在图1至6中，BrdU掺入的减少很可能是由于每个孔中的细胞数量减少，而不是细胞增殖减少。

图7D、7E和7F分别提供了一种测定，其中粘附细胞被结晶紫染色，从而提供了每个孔的相对细胞数的测量。这些数字表明，当细胞仅表达对照质粒时，大麻二酚不会显著影响每孔细胞的相对数量。图7D提供了用对照质粒或用ORF8转染的质粒转染细胞并用或不用大麻二酚处理时的相对细胞数。

该图显示，与表达ORF8但仅用载体处理的细胞相比，或与用对照质粒转染并用大麻二酚处理的细胞相比较，未经大麻二酚处理的ORF8表达不会减少相对细胞数，但当表达ORF8并用大麻二酚处理的细胞时，相对细胞数减少。这表明，大麻二酚与SARS-CoV-2基因结合，导致相对细胞数减少，这只有在病毒蛋白与大麻二酚结合时才能看到。

图7E提供了用对照质粒或用ORF10转染的质粒转染细胞并用大麻二酚处理时的相对细胞数。该图显示，与表达ORF10但仅用载体处理的细胞相比，或与用对照质粒转染并用大麻二酚处理的细胞相比较，未经大麻二酚处理时ORF10的表达不会减少相对细胞数，但当细胞表达ORF10并用大麻二酚处理时，相对细胞数减少。这表明，大麻二酚与SARS-CoV-2基因结合，导致相对细胞数减少，这只有在病毒蛋白与大麻二酚结合时才能看到。

图7F提供了用对照质粒或用M蛋白转染的质粒转染细胞并用大麻二酚处理时的相对细胞数。该图显示，与单独用对照质粒转染并分别用或不用大麻二酚处理的细胞相比，用或不用大麻二酚的M蛋白的表达将降低每孔的相对细胞数。

然而，在表达M蛋白的细胞中，大麻二酚处理进一步增强了相对细胞数的减少。

图8A和8B分别提供了一组HEK293(人胚胎肾)细胞的早期和晚期凋亡数据，他们分别用以下两种方式转染。i)表达对照载体的对照质粒和ii)表达病毒蛋白ORF8的质粒，并随后用大麻二酚处理。用对照质粒转染的经大麻二酚处理的细胞在早期和晚期凋亡中均未表现出任何显著增加，但是用表达病毒蛋白ORF8的质粒转染的经大麻二酚处理的细胞显示出早期凋亡和晚期凋亡的显著增加，表明大麻二酚增强了对ORF8的细胞促凋亡抗病毒反应，这对表达ORF8细胞是特异性的。

图9A提供了表达ORF8或对照载体的细胞与载体对照相比用大麻二酚处理时产生的干扰素Lambda 1mRNA水平。

在表达ORF8但未用大麻二酚处理的细胞中，与仅表达空载体对照质粒的细胞相比，干扰素Lambda 1水平没有显著升高。这突出了细胞对SARS-CoV-2的先天抗病毒反应不足的问题。

在表达ORF8的细胞中，与单独用载体处理相比，大麻二酚在24小时时显著增加了干扰素Lambda 1的表达，这表明大麻二酚增强了对ORF8的这种抗病毒反应。

图9B显示，大麻二酚增加了对照和ORF8表达细胞中INF-gamma的表达，但对ORF8细胞中的表达有更大的影响。

图10提供了与所有其他组和处理相比，用ORF8蛋白转染并用大麻二酚处理的细胞中OAS1(寡腺苷酸合成酶1)基因表达的显著增加。

图11提供了Mx1(动力蛋白样GTPase粘病毒抗性蛋白1)的另一种干扰素刺激的基因的表达，当用大麻二酚处理用ORF8蛋白转染的细胞时，表达更高，突显了大麻二酚与这种SARS-CoV-2蛋白的结合增强了这种抗病毒反应。

图12A和12B分别提供了用表达ORF10的对照质粒或病毒质粒转染并用大麻二酚处理的细胞中的早期凋亡和晚期凋亡数据。与用大麻二酚处理但仅表达对照质粒的细胞相比，大麻二酚在用ORF10转染并用大麻二酚处理的细胞中诱导凋亡的程度明显更大，这表明大麻二酚与SARS-CoV-2ORF10蛋白联合存在时增强凋亡的特异性能力，但当存在非病毒质粒时则不增强。

图13显示，在表达ORF10的细胞中，CBD显著增加了干扰素γ的表达，这表明细胞的先天性抗病毒反应增强。干扰素γ的表达也见于用对照质粒转染的大麻二酚处理的细胞中，但其程度低于用SARS-CoV-2基因ORF10转染的Cannabidiol处理的细胞。图14提供了用表达ORF10的对照质粒或质粒转染并用大麻二酚治疗的细胞中OAS1的表达。与单独用载体(即不含大麻二酚)处理相比，用大麻二酚处理显著增加了用ORF10或对照质粒转染的细胞中OAS1的诱导。

图15A和15B分别提供了用表达M蛋白的对照质粒或病毒质粒转染并用大麻二酚处理的细胞中的早期凋亡和晚期凋亡数据。与在相同条件下处理但仅用对照质粒转染的细胞相比，用M蛋白转染并用大麻二酚处理的细胞显著增加了早期和晚期凋亡。与表达M蛋白但仅用载体处理的细胞相比，用M蛋白转染并用大麻二酚处理的细胞也显著提高了早期和晚期凋亡。

图16A和16B显示，大麻二酚在表达M蛋白的细胞中诱导了INFλ1和INFλ2/3，表明CBD增强了对该SARS-CoV-2蛋白的干扰素反应，并增强了先天性细胞内抗病毒反应的这一方面。

图17显示，用对照质粒和M蛋白转染并用大麻二酚处理的细胞已表现出Mx1的表达。大麻二酚在用M蛋白转印并用大麻三酚处理的的细胞中诱导Mx1基因表达的程度明显大于用大麻二醇处理但仅表达对照质粒的细胞。

图18显示，用对照质粒或M蛋白转染并用Cannabidiol处理的细胞与它们各自的载体处理的细胞相比，显示出显著更高的OAS1基因表达。

图19显示，大麻二酚显著增加了用M蛋白或对照质粒转染的细胞中IFIT1的表达，因此可能有助于启动先天性细胞免疫系统以增强启动抗病毒防御的能力。

背景技术

病毒蛋白通常在干扰宿主获得性免疫反应中发挥关键作用，但也可以直接干扰直接在感染细胞内介导的旨在阻止病毒复制和传播的抗病毒先天免疫反应。2019年新型冠状病毒(2019nCoV或SARS-CoV-2)感染引起的2019年冠状病毒病(新冠肺炎)大流行已成为国际关注的公共卫生紧急事件(PHEIC)。SARS-CoV-2在人类中具有高度致病性，给世界带来了不可估量的公共卫生挑战。

SARS-CoV-2与一种早期毒株SARS-CoV有关，该毒株也会导致人类呼吸道疾病。SARS-CoV先前的特征有助于解码SARS-CoV2基因组。

SARS-CoV-2基因组的基因组产物以小写字母表示，用斜体表示(例如orf10)，而病毒基因用大写字母表示(例如ORF10)。

2019年新型冠状病毒(2019nCoV或SARS-CoV-2)感染导致2019年冠状病毒病(新冠肺炎)大流行，截至2021年3月29日，全世界感染了1.27亿人，造成约300万人死亡，病例和死亡人数仍在攀升。据报道，一些冠状病毒蛋白在调节宿主的先天免疫中发挥重要作用，但对SARS-CoV-2的研究很少。

Lu,R.等人、Zhou、P.等人、Xu、J.等人的几项独立研究得知SARS-CoV-2与SARS-CoV几乎共享80％的基因组。

Lu,R.等人进一步研究得知SARS-CoV-2的几乎所有编码蛋白都与SARS-CoV蛋白同源。

SARS-CoV被确定为2002-2003年国际SARS爆发的病原。Chong Shan Shi等人在《免疫学杂志》(2014)上发表的一篇论文中，对SARS如何逃避先天免疫反应导致人类疾病进行了深入研究。

根据Shi的说法，由SARS-CoV编码的一种被指定为开放阅读框-9b(ORF-9b)的蛋白质发挥如下多重作用：

1.定位于线粒体，并通过触发动力蛋白样蛋白(DRP1)的泛素化和蛋白酶体降解引起线粒体伸长，动力蛋白样蛋白质是一种参与线粒体分裂的宿主蛋白；

2.它作用于线粒体，并通过篡夺聚(C)结合蛋白2(PCBP2)和HECT结构域E3连接酶AIP4来靶向线粒体相关的衔接分子，即线粒体抗病毒信号蛋白(信号体)(MAVS)，从而引发MAVS、TRAF3和TRAF6的降解。这严重限制了宿主细胞的干扰素反应。

3.瞬时ORF-9b表达导致细胞中强烈诱导自噬。Shi报告如下：

“这些结果表明，SARS-CoV ORF-9b操纵宿主细胞线粒体和线粒体功能，帮助逃避宿主的先天免疫。这项研究揭示了SARS-CoV感染发病机制的重要线索，并说明了一个小的开放阅读框可以在细胞中造成的破坏。”

科学家们正在广泛研究SARS-COV-2的所有病毒蛋白，即NSP1、NSP2、NSP3、NSP4、NSP5、NSP6、NSP7、NSP8、NSP9、NSP10、NSP11、NSP12、NSP13、NSP14、NSP15、NSP16、S蛋白、ORF3a、E蛋白、M蛋白、ORF6、ORF7a、ORF7b、ORF8、N蛋白、ORF10，以开发治疗COVID-19的新疗法(Gordon，D.E等人，2020)。

Jin Yan Li等人(2020)在其最近发表的《病毒研究》286(2020)198074中的“短通信”中检查了SARS-CoV-2的病毒蛋白。

Li等人(2020)报道了病毒感染后触发的以下机制。

i)几种转录因子(如IRF-3和NF-κB)与干扰素启动子结合，以在病毒感染时刺激i型IFN(IFN-α/β)表达(García-Sastre和Biron，2006)；

ii)干扰素的分泌及其与受体的结合；

iii)启动JAK/STAT途径并诱导干扰素与其受体结合后的干扰素应答转录因子；

iv)激活其启动子中含有干扰素刺激的应答元件(ISRE)的基因，导致一组干扰素激发的基因(ISG)表达，从而建立抗病毒状态(Catanzaro等人，2020)。

Li进一步指出，为了应对这种强大的选择性环境，来自不同家族的许多病毒，包括禽流感病毒、痘病毒、流感病毒、禽流感病毒和冠状病毒(CoV)，已经进化出多种被动和主动机制，以避免诱导抗病毒I型干扰素，并且它们可以优化细胞内资源以有效复制病毒(Volk等人，2020)。

Li等人发现，病毒ORF6、ORF8和核衣壳蛋白是I型干扰素信号通路的潜在抑制剂，这是宿主先天免疫抗病毒反应的关键成分。所有三种蛋白都对I型干扰素(IFN-β)和NF-κB响应显示强抑制性。Li的进一步检查表明，这些蛋白质能够抑制干扰素刺激

在感染仙台病毒后，只有ORF6和ORF8蛋白能够抑制干扰素刺激反应元件(ISRE)。

SARS-CoV-2ORF6、ORF8、N和ORF3b是有效的干扰素拮抗剂，在SARS-CoV-2感染的早期，IFN的延迟释放将阻碍宿主的抗病毒反应，进而有利于病毒复制。随后，迅速增加的细胞因子和趋化因子会吸引中性粒细胞和单核细胞等炎症细胞，导致过度的免疫渗透，导致组织损伤。

Khailany等人引用了Koyama等人的一篇文章，2020年，其中Koyama发现ORF10(SARS-CoV-2基因组中的短38残基肽)与NCBI储存库中的其他蛋白质不同源，Khailani进一步表示，由于ORF10在NCBI存储库中没有任何比较蛋白质，其可用于比基于PCR的策略更快地区分感染，但强烈需要对该蛋白的进一步表征。

有趣的是，chemrxiv.org上一篇Seema Mishra的题为“ORF10：大流行新型冠状病毒2019-nCoV传染性质的分子洞察”的论文，强调ORF10是一种未知蛋白质，与迄今为止存在的生物体中的任何已知蛋白质都没有同源性。她进一步进行了免疫信息学研究，通过该研究，已观察到在所有十种2019-nCoV蛋白中，ORF10是免疫原性、混杂的CTL表位中数量最多的。(细胞毒性T淋巴细胞)。

虽然ORF10与大流行性新型冠状病毒2019-nCoV的传染性有关，但她表示：“通过免疫信息学研究，已观察到，在所有十种2019-nCoV蛋白中，ORF10是免疫原性、混杂CTL表位数量最多的蛋白之一。这些表位是具有HTL表位的簇的一部分，这表明ORF10中存在高度的表位保守性。没有发现跨生物体的蛋白质序列保守性，也没有已知的结构模板来建模和推导结构来洞悉它的结构和功能。因为它的序列或结构完全没有保守性，所以它可以作为一种新的蛋白质呈现给免疫系统。此外，人体可能无法利用针对其他微生物产生的任何记忆B和T细胞来靶向ORF10并对抗这种病原体，从而导致其致命的传染性”。

此外，ORF8蛋白是另一种与SARS-CoV基因组中的其他蛋白不同源的蛋白(Xu，J.等人，Virus 2020，12244)，尽管它确实与其他相关病毒编码的蛋白显示出非常低的同源性(Tang，X.等人，National Science Review 2020，71012-1023)。SARS-CoV-2ORF8蛋白特别令人感兴趣，因为最近发现它是I型干扰素信号通路的潜在抑制剂，是宿主先天免疫抗病毒反应的关键成分。

orf8基因(登录号YP_009724396.1，UniProt ID P0DTC8·NS8_SARS2)编码在SARS-CoV-2基因组的3’端。它产生121个氨基酸长的蛋白质，其中N端区域形成预测的信号肽，识别aa 15处的切割位点(目标P-2.0预测)。预测的亚细胞定位是(使用PSORTII，https://psort.hgc.jp/form2.html)细胞外(55.6％)。

然而，已经鉴定出80多种可能与ORF8相互作用的细胞蛋白(www.ebi.ac/uk/interaction/interactors/id:P0DTC8)。这些包括参与代谢、心磷脂和脂质合成的线粒体蛋白(例如线粒体谷氨酸载体1、线粒体ATP合成酶亚基α和β、α三功能蛋白以及各种脱水酶和烯醇酶)、高尔基蛋白(例如包被体亚基α/β/γ等),内质网(ER)蛋白(例如ER凝集素1、ER膜蛋白复合物亚基1等)、蛋白酶体蛋白(例如26S蛋白酶体非ATP酶调节亚基6、蛋白酶体亚基α-7型)、核蛋白(例如EIF3A、RBP2等)等。

ORF10蛋白是一种未知蛋白，与迄今为止存在的生物体中的任何已知蛋白都没有同源性，并且由于其与SARS-CoV-2的独特关联，也是一种有趣的候选蛋白。

PSORT II预测ORF10(登录号YP_009725255.1，UniProt ID A0A663DJA2*)可能是细胞质(56.5％的概率)，但也可能是线粒体(21.7％)、核(13％)、分泌系统囊泡相关(4.3％)或内质网相关(4.4％)。这种病毒蛋白很小，只有38个氨基酸，并具有预测的跨越氨基酸5-19的N端跨膜螺旋。

来自IntAct数据库的蛋白质相互作用数据(https://www.ebi.ac.uk/intact/interactors/id:A0A663DJA2*)表示只有30个潜在的相互作用体。然而，值得注意的是，ORF8蛋白和ORF10蛋白之间存在几种常见的相互作用，包括线粒体、高尔基体和内质网蛋白。

膜糖蛋白(M蛋白，登录号YP_009724393.1)是一种在所有β冠状病毒中高度保守的结构蛋白，但已发现在SARS-CoV-2病毒中具有一些序列变体，迄今已鉴定至少7个氨基酸取代(M.Bianchi等人，国际生物医学研究2020卷文章ID 4389089)。M蛋白可能对病毒进入、复制和宿主细胞内的颗粒组装以及病毒出芽都很重要。相互作用研究的数据也表明M蛋白可能干扰线粒体代谢(https://doi.org/10.1038/s41586-020-2286-9)以及额外的细胞过程。

SARS-CoV-2基因组中有许多编码的非结构蛋白。非结构蛋白5(NSP5)编码在开放阅读框1a(orf1a)中，其产生多肽(登录号YP_009725295.1)和orf1ab(多肽登录号YPP009724389.1)，这些多肽被进一步加工以产生包括NSP5在内的非结构蛋白，作为SARS-CoV-2基因组的主要蛋白酶，它可能影响蛋白质靶向线粒体的能力并引起氧化应激，并且可能被抗氧化药物靶向治疗，尽管这尚未在实验中得到证实。

对SARS-CoV-2缺乏基本知识是开发治疗该疾病的新疗法的限制因素。尽管已观察到SARS-CoV-2与SARS-CoV共享几乎80％的基因组(Catanzaro2020)，但鉴于这两种病毒(2)之间的传染性、宿主相互作用和致病性存在差异，ORF8蛋白和ORF10蛋白以及M蛋白和NSP5在SARS-CoV-2基因组中的其他已知单个蛋白中具有重要意义。

近年来，人们对大麻二酚(CBD)的兴趣呈指数级增长。大麻二酚是大麻的一种非精神活性成分，具有强大的抗氧化和抗炎作用。

已发现大麻二酚(CBD)可调节包括转录因子在内的多种细胞蛋白的易位。CBD暴露快速增加TRPV2蛋白表达，并促进其向BV-2细胞表面易位(Samia Hassan 2014)。

Chong Shan Shi等人研究发现了被指定为开放阅读框-9b(ORF-9b)的SARS-CoV编码的蛋白质如何定位于线粒体，并通过触发动力蛋白样蛋白(DRP1)的泛素化和蛋白酶体降解导致线粒体伸长，动力蛋白样蛋白质是一种参与线粒体分裂的宿主蛋白(Shi等人2014)。研究发现，CBD可以拯救铁超载细胞中降低的动力蛋白1水平(da Silva VK等人，2014)

Enkui Hao等人报道了CBD对强力霉素诱导的心脏毒性和心脏功能障碍的保护作用

(i)减轻氧化和硝化应激，(ii)改善线粒体功能，(iii)增强线粒体生物生成，(iv)减少细胞死亡和MMPs的表达，以及(v)减少心肌炎症。

已发现CBD可调节多种细胞蛋白的易位，包括转录因子(Huang Y等人，2019)和膜阳离子通道(Hassan S等人，2014)。

已发现CBD在调节线粒体钙代谢、线粒体介导的凋亡、线粒体铁蛋白调节、电子传输链以及线粒体生物发生和分裂中发挥作用(da Silva VK，2018；Hao E等人，2015；McCallip RJ等人，2006；Ryan D等人，2009和Valvassori SS等人，2013)。

在腺病毒的内部研究中(未公布的数据)，发明人发现感染细胞中的复合物I活性较低。然而，有研究表明，大鼠的CBD治疗增加了复合物I、II、III和IV的活性，这可能是由于线粒体内钙的积累增强，这增加了钙敏感性脱氢酶的活性，并促进了NADH用于氧化磷酸化的可用性(Valvassori SS等人，2013)。

各种研究人员表明，CBD在治疗多种癌症方面显示出巨大的前景，主要基于诱导促凋亡作用的证据(Jeong S等人，2019；Jeong，Yun HK等人，2018；Sultan AS等人，2018)。在室内研究中，发明人发现，在代谢失调的细胞中，CBD减少细胞死亡，而在正常细胞中没有影响(未公布的数据)。Oláh A等人2016年和Solinas M等人2012年也观察到了这一点；。

细胞类型也可能是决定反应的因素。在缺氧缺血性损伤的体内模型中，缺氧-葡萄糖剥夺的小鼠前脑组织的胱天蛋白酶9活性增加了5倍，100μM CBD使其减弱了近50％(Castillo a等人，2010)，而5μM CBD也显著减弱了缺氧-葡萄糖剥夺培养的HT22海马神经元的凋亡和氧化应激(Sun S等人，2017)。

CBD或其他大麻二酚是否能减弱病毒蛋白的潜在促凋亡作用需要直接研究。

以下数据报告了CBD对脂质代谢的调节：

a、据报道，CBD可刺激培养自尼曼-皮克病患者的细胞中的鞘磷脂水解，这表明CBD可能有助于缓解积聚引起的症状(Burstein S等人，1984)。

b、在近40年前发表的一篇论文中，还发现大麻二酚和其他大麻二酚剂量依赖性地抑制培养的人成纤维细胞中的胆固醇酯化，而不影响三酰甘油或磷脂合成(CornicelliJA，et al 1981)。

c、培养的小鼠小胶质细胞的CBD处理也改变了膜脂筏中特定种类N-酰基乙醇胺(N-AE)的积累(Rimmerman N等人，2012)。尽管是次要成分，但N-AE具有高度生物活性。作为膜结合蛋白的对接位点和信号复合物组装的“支架位点”，脂筏是细胞中生理和病理生理调节的重要位点。

d、脂质筏的调节在新冠肺炎中也可能具有特殊重要性。ACE2受体与SARS CoV-2的棘突蛋白结合，启动细胞进入和感染，位于富含胆固醇的脂质结构域内(Lu Y等人，2008)。

由于鞘磷脂和游离(即未酯化)胆固醇都是脂筏的重要成分，这些报告表明CBD在这些膜亚结构域的调节中具有潜在作用。

大麻二酚(CANNABIDIOL)是大麻植物的主要大麻素成分。它与CB1和CB2受体结合非常弱。

大麻二酚不会诱发精神活性或认知作用，并且在人体内耐受性良好，无副作用，因此成为一个假定的治疗靶点。在美国，大麻二酚药物Epidiolex于2018年被食品和药物管理局批准用于治疗两种癫痫疾病：Dravet综合征和Lennox/Gasteaut综合征。

大麻二酚化学名称为2-[(1R,6R)-3-甲基-6-(1-甲基乙烯基)-2-环己烯-1-基]-5-戊基-1,3-苯二醇。化学结构如下。

美国专利US 6410588公开了大麻二酚治疗炎症性疾病的用途。

PCT公开号WO2001095899A2涉及大麻二酚衍生物和药物组合物，所述药物组合物包含大麻二酚衍生物，其为具有镇痛、抗焦虑、抗惊厥、神经保护、抗精神病和抗癌活性的抗炎剂。

大麻二酚(CANNABDIOL(CANNADIOL))被批准为抗癫痫药物(Barnes，2006；Devinsky等人，2017)。大麻二酚没有不良的心脏毒性，可改善糖尿病/高糖诱导的有害心肌病(Cunha等人，1980；Izzo、Borrelli、Capasso、Di Marzo和Mechoulam，2009；Rajesh等人，2010)。

具体实施方式

术语定义。

Cannabidiol和CBD是同义词。

术语早期凋亡包括作为凋亡阶段的早期凋亡。

感染后早期凋亡表明细胞在感染后发生凋亡的时间点。这包括早期和晚期细胞凋亡，只要它们发生在感染后早期。在本发明中，注意到细胞在24小时发生凋亡，这表明大麻二酚在感染后早期引起凋亡。

Rajesh M等人证明大麻二酚可有效保护人冠状动脉内皮细胞(HCAEC)的内皮功能和完整性。他们提出大麻二酚抑制下列行为：

·线粒体产生活性氧；

·NF-κB活化；

·单核细胞的跨内皮迁移；

·HCAEC中的单核细胞-内皮粘附。

Nagarkatti等人提供如下研究结果：

·大麻二酚(大麻的活性成分)和内源性大麻二酚通过激活被称为大麻二酚受体1和2(CB1和CB2)的特定大麻二酚感受器介导其作用。

·大麻二酚系统在体内和体外均显示通过其免疫调节特性参与调节免疫系统。

·大麻二酚抑制炎症反应，随后减轻疾病症状。大麻二酚的这一特性通过多种途径介导，如诱导激活的免疫细胞凋亡、抑制炎症部位的细胞因子和趋化因子以及上调FoxP3调节性T细胞。

·大麻二酚已在多发性硬化症、类风湿性关节炎、结肠炎和肝炎等自身免疫性疾病的几种实验模型中进行了测试，并已证明通过诱导多种抗炎途径保护宿主免受发病机制的影响。

Vuolo等人证明了大麻二酚治疗在哮喘动物模型中的作用。与哮喘有关的所有6种细胞因子的水平，即TNFα，在对照动物、哮喘诱导动物和用大麻二酚治疗的哮喘诱导动物中测定IL-6、IL-4、IL-13、IL-10和IL-5。诱导性哮喘增加了所有6种细胞因子；然而，在用CBD治疗的动物组中，所有细胞因子的水平都显著降低。大麻二酚的这种作用不仅在哮喘中非常重要，而且在其他据报道细胞因子升高的情况下也非常重要。Huang，C.等人最近的研究表明，除了呼吸困难、低氧血症和急性呼吸窘迫外，淋巴细胞减少和细胞因子释放综合征也是严重SARS-CoV-2感染患者的重要临床特征。因此，由于大麻二酚能够减少细胞因子，因此也建议将其作为新冠肺炎的治疗方法。

本发明的发明人提出，通过多种已知和未知的作用，大麻二酚将成为一种非常理想的治疗剂。它是一种心脏保护药物，大麻二酚在降低LQT中的作用至关重要。

据报道，大麻二酚可有效保护人冠状动脉内皮细胞(HCAEC)的内皮功能和完整性。

大麻二酚可降低诱发哮喘的细胞因子。大麻二酚具有多种作用，如抗炎、细胞因子抑制剂、LQT降低剂和心脏保护剂。

大麻二酚的长期治疗被认为是安全的。

本发明还包括治疗患有下列疾病的个体的方法，这些疾病包括：任何心脏病症、任何呼吸病症或任何感染或由于单独或与另一种合适的治疗剂一起施用大麻酚组合物而观察到细胞因子和/或炎症的升高病症。

这些组合物可以在使用大麻二酚的单次治疗中使用，或者借助于包括大麻二酚片剂和上述药物的日历包装泡罩卡，作为预防剂或辅助治疗。

本发明还包括在某些情况下预防性地施用大麻二酚组合物，使得近期可能需要的任何治疗都不会引起LQT、细胞因子升高、炎症和心脏损伤。

本发明提供用于增强任何治疗(包括抗病毒治疗，尤其包括新冠肺炎治疗)的安全性的组合物和方法，其中所述治疗包括施用一种或多种可能导致药物诱导LQTs的药物。

大麻二酚对以下一种或多种疾病的发病机制产生有益于治疗的作用，包括但不限于新冠肺炎、SARS、MERS、流感、获得性、诱导性和药物相关的长QT综合征、长QTc综合征、长QRS综合征、心肌病、心力衰竭、心律失常、心肌缺血、心肌梗死(Ml)，缺血性和非缺血性心律失常、炎症、血管功能障碍、心肌病、心脏重塑、适应不良、不同类型的心绞痛、药物性心力衰竭、心脏损伤、医源性心脏和血管疾病或其任何组合。

发明人此前提出，大麻二酚在治疗新冠肺炎中的作用将是多方面的。大麻二酚被认为可以安全地长期使用，并且具有心脏保护作用。它可以减少细胞因子并作为抗炎剂。最重要的是，它可以降低LQT，并可以预防/挽救心脏离子通道的过度兴奋。通过这种方式，它可以提高治疗的安全性，该治疗建议使用治疗新冠肺炎但能够引起LQT的药物，并使患者获得最佳治疗。

为了开发治疗新冠肺炎-19的新疗法，正在广泛研究SARS-COV-2的所有病毒蛋白，即NSP1、NSP2、NSP3、NSP4、NSP5、NSP6、NSP7、NSP8、NSP9、NSP10、NSP11、NSP12、NSP13、NSP14、NSP15、NSP16、S蛋白、ORF3a、E蛋白、M蛋白、ORF6、ORF7a、ORF7b、ORF8、N蛋白、ORF10。(Gordon，D.E等人，2020)。

了解病毒蛋白的细胞特性和功能将有助于测试新冠肺炎的新疗法和战略干预措施。本发明者已开始研究ORF8、ORF10、M蛋白和NSP5的作用机制。这些新的蛋白质，ORF8和ORF10，尚未通过实验完全表征，它们在细胞中的功能无法从先前的工作中推断出来。SARS-CoV-2型M蛋白和NSP5的功能尚不清楚。事实上，对构成SARS-CoV-2基因组的蛋白质还知之甚少，因为它们与其他已知的病毒蛋白质相比都存在差异。对SARS-CoV-2基因组中这些新蛋白的细胞功能和病理生理作用的了解有望为治疗干预提供潜在的新靶点。此外，这项工作开始于某些化合物，这些化合物可能干扰这些病毒蛋白的作用，并被证明对人类抗击大流行有用。这些化合物是那些尤其可以逆转由这些病毒蛋白引起的细胞扰动的化合物。

截至2021年3月26日，WorldMeters报告了全世界126203749例新冠肺炎病例和2769596例死亡。

最初感染病毒不会导致严重疾病(估计感染剂量为1000个病毒粒子)。只有当病毒进入细胞并劫持细胞机器进行复制，形成1000或数百万个新病毒粒子时，才会发生疾病。

这是因为SARS-CoV-2有许多变种，其中一些变种具有

i)传播力增加，ii)毒力增加，以及

iii)疫苗效力降低。

SARS-CoV-2的显著变异包括集群5，谱系B.1.1.7、谱系B..1.2007、谱系B1.1.317、谱集B.1.1.318、谱系B.1.351、谱系B-1.429/CAL.20C、谱系B1.525、谱系P.1、谱系P.3。

攻击病毒的机制有很多。大多数方法只关注抑制病毒复制。防止病毒最初复制、然后传播以及变异的一种独特方法是，使受感染的宿主机器无法用于病毒。如果受感染细胞的先天免疫反应导致早期凋亡，导致受感染细胞死亡，这将破坏宿主的受感染细胞机制，阻止i)复制和ii)新的感染性病毒粒子的形成，否则这些病毒粒子可以在全身传播，造成巨大的感染。

新冠肺炎的一个问题是先天免疫反应通常不足。病毒进入会触发干扰素，但如果干扰素的触发量不够，那么干扰素诱导不足是成问题的。

研究人员一直在研究通过一种或多种方法预防病毒复制，例如通过比较药物处理的细胞中的病毒RNA数量和载体处理的对照中的病毒RNA含量来测量药物处理后病毒RNA数量的减少。在其他研究中，对用药物处理并受到感染的细胞进行刺突蛋白染色，并绘制表达刺突蛋白的细胞的百分比。

本发明人专注于三种病毒蛋白，即ORF8、ORF10和M蛋白。

ORF8是一种辅助蛋白，它干扰宿主的免疫反应已被提出。ORF8的独特之处在于它在病毒复制中可能是可有可无的，但它具有独特的逃避宿主细胞免疫监视的作用，即它在病毒逃避宿主细胞免疫力的方式中发挥作用。

Khailany等人引用了Koyama等人的一篇文章，2020年，其中Koyama发现ORF10(SARS-CoV-2基因组中的短38残基肽)与NCBI储存库中的其他蛋白质不同源，Khailani进一步表示，由于ORF10在NCBI存储库中没有任何比较蛋白质，其可用于比基于PCR的策略更快地区分感染，但强烈需要对该蛋白进一步表征。

膜糖蛋白(M蛋白，登录号YP_009724393.1)是一种在所有β冠状病毒中高度保守的结构蛋白，但已发现在SARS-CoV-2病毒中具有一些序列变体，迄今已鉴定至少7个氨基酸取代(M.Bianchi等人，BioMed Research International Vol2020Article ID 4389089)。M蛋白可能对病毒进入、复制和宿主细胞内的颗粒组装以及病毒出芽都很重要。相互作用研究的数据也表明M蛋白可能干扰线粒体代谢(https://doi.org/10.1038/s41586-020-2286-9)以及额外的细胞过程。

在早先提交的共同未决申请IN202021030633中，发明人思考了CBD或其他大麻二酚是否能减弱病毒蛋白的潜在促凋亡作用的问题，并得出结论，除非进行直接调查，否则无法回答该问题。首先，应该确定病毒蛋白是否表现出促凋亡作用，然后需要研究大麻二酚是否改变蛋白质的作用。

当宿主细胞感染病毒时，它们会转录干扰素，阻止RNA加工，试图阻止病毒复制。病毒“劫持”细胞机制来复制自己，这需要RNA加工。

干扰素是一种非常早期的反应，当病毒颗粒进入细胞时，它们会关闭细胞中RNA介导的过程。这会阻止病毒复制。然而，干扰素的这种作用也可能阻止细胞分裂，并导致细胞凋亡和死亡。然而，大多数情况下，细胞选择性地阻断病毒蛋白，同时允许细胞蛋白继续制造。

因此，重要的是找到能够增强细胞初始细胞内抗病毒防御的因子，特别是那些宿主细胞在病毒进入后可以立即启动的防御，例如恢复I型、II型或III型干扰素信号通路。

本发明提供用于治疗新冠肺炎传染病的药物组合物和方法，包括向患者投与包含治疗有效量的大麻二酚的药物组合物，其中向所述患者投与所述药物组合物而产生先天免疫的增强归因于以下效应中的至少一种，

i)受感染的患者细胞在感染后早期发生凋亡；

ii)诱导患者中的干扰素转录；

iii)在患者体内诱导干扰素诱导的抗病毒效应物。

当受感染的患者细胞发生凋亡时，病毒无法利用这些细胞进行突变。

因此本发明提供了预防或减少患者中Sars-Cov-2病毒突变的组合物和方法，其中所述方法包括通过向新冠肺炎患者施用包含治疗有效量的大麻二酚的药物组合物，从而使受感染的患者细胞在感染后早期发生凋亡而使它们不能被病毒用于突变。

本发明还提供用于预防或预防治疗新冠肺炎传染病的药物组合物和方法，包括向哺乳动物/人施用包含治疗有效量的大麻二酚的此类药物组合物，其中向所述哺乳动物/人如此施用所述药物组合物可增强患者的先天免疫，其作用归因于以下至少一种：

i)诱导患者体内的干扰素转录；

ii)在患者体内诱导干扰素诱导的抗病毒效应剂。

当本发明的组合物用于预防或预防性治疗新冠肺炎传染病时，令人惊讶的是，未被感染的此类哺乳动物/人类的细胞没有发生任何凋亡，这表明这些方法和组合物“启动”了哺乳动物/人类系统对病毒的反应，而不是仅仅导致系统开始死亡。

因此，大麻二酚组合物和其施用方法让即使健康的个体也能应对病毒的威胁，而不会对任何细胞造成伤害。在这种哺乳动物/人中，观察到干扰素诱导或干扰素诱发的抗病毒效应物的诱导，其也令人惊讶地不会引起未感染/健康细胞的凋亡。

在这两种情况下，即在治疗患者和预防性治疗未被病毒感染的哺乳动物/人类时，最常诱导的干扰素包括II型和III型干扰素。

在这两种情况下发现的最常见的干扰素诱导的抗病毒效应剂，即在治疗患者和预防性治疗未感染病毒的哺乳动物/人时，包括OAS1、Mx1和IFIT1基因。

本发明还提供了包含治疗有效量的大麻二酚的组合物以及用于由于各种原因即将遭遇病毒或即将感染的哺乳动物和人类的方法。这些人类有时面临更高的风险，因为他们来自大流行更为强烈的地区。他们的风险更高，因为他们是一线工作人员或卫生工作者，或者有合并症，或者因为与患者接触而被隔离，或者他们是常客。这一类别还包括风险不高但仍即将感染的哺乳动物和人类。可以得出结论，在没有病毒的情况下用大麻二酚处理(如数据所示，Mx1和IFIT1)诱导干扰素和抗病毒效应剂而实际上不触发细胞凋亡。这种准备状态增加了暴露于病毒的人立即在感染细胞中触发细胞凋亡的可能性，从而防止了感染的复制和传播(从而预防了疾病)。

最初感染病毒不会导致严重疾病(估计感染剂量为1000个病毒粒子)。只有当病毒进入细胞并劫持细胞机器进行复制，形成1000或数百万个新病毒粒子时，才会发生疾病。

然而，当即将遭遇病毒或即将感染的人服用大麻二酚时，会增加病毒的治病“感染剂量”。在这种情况下，病毒无法控制和充分复制，从而不能使人生病。

宿主细胞通过干扰素的诱导和干扰素诱导的抗病毒效应物(如OAS1)的更高转录而被激发，这样，一旦它们也遇到病毒(但在没有病毒的情况下不会有害)，它们就可以更好地进行凋亡。这表明，CBD有可能在病毒基因表达时“启动”细胞准备应对病毒威胁。

因此本发明提供了一种药物组合物和施用组合物的方法，所述组合物包含治疗有效量的大麻二酚，用于预防或更好地应对即将感染Covid-19的哺乳动物/人类的新冠肺炎传染病，其中将所述药物组合物施用于哺乳动物/人类，能增强他们的先天免疫，其作用来自于以下至少一种：

i)在哺乳动物/人中诱导干扰素转录；

iii)在哺乳动物/人中诱导干扰素诱导的抗病毒效应物；

其中这种诱导在开始时不与细胞凋亡相关，使细胞能够为病毒威胁做好准备，包括增加病毒对机体的感染剂量，并且其中所述细胞在感染后早期发生凋亡，这使得所述细胞不能用于病毒的复制和/或突变。

本发明包括使用用病毒蛋白转染的质粒进行的许多实验。

选择HEK293(人胚胎肾)细胞用各种病毒蛋白来转染。将HEK293接种在96孔板中，然后用表达空对照载体(pCMV-3Tag-3a)的质粒或表达病毒Orf8、Orf10或M蛋白的载体转染。几小时后，用1μM大麻二酚处理细胞，然后生长24小时，并使用检测BrdU掺入的比色ELISA进行测定。

本发明人进行的研究集中于以下实验，实验中测量BrdU，

i)研究大麻二酚对用表达对照载体的对照质粒转染的细胞中细胞核BrdU掺入的影响；

ii)研究大麻二酚对用表达病毒蛋白的质粒转染的细胞中的细胞核BrdU掺入的影响；

BrdU掺入分裂细胞的细胞核，因此可以提供细胞增殖的相对测量。然而，由于该测量依赖于存在的细胞数量，因此BrdU掺入的测量只能解释为在数据归一化为存在的和被测量的细胞的相对数量后，细胞增殖率的变化。因此，BrdU掺入的减少可能意味着细胞增殖率较低，或者意味着细胞的增殖率没有差异，但被测细胞较少。

测定病毒蛋白ORF8、ORF10和M蛋白对BrdU掺入HEK293(人胚胎肾)细胞的影响，并进行进一步研究，以检查用大麻二酚处理转染细胞是否逆转病毒蛋白的任何观察到的影响。

令人惊讶的是，病毒蛋白对HEK293(人胚胎肾)细胞的BrdU掺入没有太大影响。尽管没有观察到显著的影响，但在所有病毒蛋白中观察到HEK293(人胚胎肾)细胞的BrdU掺入率的轻微降低，其中降低高于使用表达对照载体的对照质粒的降低。对于HEK293(人胚胎肾)细胞，即使表达对照载体的对照质粒也是异物，但未观察到由于对照质粒导致的BrdU掺入的显著减少。

进一步令人惊讶地观察到，当用大麻二酚处理时，在用SARS-CoV-2的各种病毒蛋白转染的HEK293(人胚胎肾)细胞中，观察到这些细胞的BrdU掺入率急剧且显著降低。这种效应在所有测试的病毒基因中都很常见。

发明人进行了双向方差分析。这已经在不同的天/周进行了多次单独的试验，其中n＝5至6个生物重复(其中细胞的单独传代被视为不同的生物重复)。每个生物复制品在每个平板上接种2至6个技术复制品，并在每个试验中对其进行平均，得出该试验中该生物复制品的n＝1。请注意，这些数据没有归一化为每个孔中存在的细胞的相对数量。

这些结果如下图1-5和表1所示：

表1：为测量BrdU掺入水平而进行的研究

通过将溴脱氧尿苷(BrdU)掺入并定量到活跃增殖细胞的DNA中来测量BrdU掺入到DNA中的水平。吸光度由ELISA测定,它通过使用BioTek Synergy H1混合多模微孔板阅读器在370nm(参考波长：约492nm)下测量。图1-5提供了测试的结果。图6结合了所有图中的数据，以便进行比较。吸光度表示为未处理对照的％，吸光度值进行了归一化处理。

吸光度值反映了每个细胞孔中并入细胞核的BrdU的平均量，因为这些细胞的DNA已并入溴脱氧尿苷，这是在测定中测量的。用表达空对照载体(pCMV-3Tag-3a)的质粒转染细胞时的吸光度作为对照。pCMV-3Tag-3A是一种对照载体，表达由3个FLAG标签串联组成的非常小的蛋白质(氨基酸序列为DYKDDDDKDYKDddDKDYKDDDK。将所有吸光度值与对照值进行比较。与对照值的显著偏差应反映BrdU掺入的减少或增加。它可能反映细胞增殖的差异，也可能反映细胞数量的差异，表明细胞凋亡的增强，这将减少BrdU的掺入。)每个孔的细胞数。

通过用表达不同病毒蛋白的质粒转染细胞来模拟病毒感染的细胞。在使用检测BrdU掺入的比色ELISA对转染细胞进行分析之前，将转染细胞培养24小时以留出病毒蛋白表达的时间。没有观察到明显的偏转，但吸光度值略有降低，这表明病毒蛋白单独对BrdU掺入没有或只有很小的抑制作用。

通过用大麻二酚处理用表达不同病毒蛋白的质粒转染的细胞，模拟大麻二酚对病毒感染细胞的影响。

在使用检测BrdU掺入的比色ELISA对转染细胞进行分析之前，将转染细胞培养24小时以留出病毒蛋白表达的时间。令人惊讶的是，在用大麻二酚治疗后，观察到吸光度显著降低。

由于观察到用表达空对照载体的质粒转染细胞时的吸光度最大，因此将该吸光度值归一化为100％或100，并相对于100％绘制所有其他值。

如图3所示，在表达ORF8蛋白并用CBD处理的细胞中，平均BrdU掺入比表达ORF7蛋白但未用大麻二酚处理的细胞低37.28％。

如图4所示，在表达Orf10且用大麻二酚处理的细胞中，平均细胞BrdU掺入量比表达Orf1但用大麻二酚未处理的细胞低30.44％。

如图5所示，在表达M蛋白并用CBD处理的细胞中，平均细胞BrdU掺入比表达M蛋白但用大麻二酚处理的细胞低37.28％。

因此，大麻二酚影响了用SARS-CoV-2的所有三种病毒蛋白转染的HEK293(人胚胎肾)细胞的BrdU掺入水平。令人惊讶的是，在未处理的细胞以及用表达对照载体的对照质粒转染的细胞中，大麻二酚不会降低细胞增殖。这表明大麻二酚在影响感染细胞的细胞数量或细胞增殖方面具有巨大潜力。

大麻二酚治疗后吸光度的降低或BrdU掺入的减少确实反映了一些情况。

干扰素是作为对病毒进入的反应而产生的。然而，干扰素会阻止细胞增殖并增加细胞凋亡，这会减少细胞数量并减少BrdU掺入。因此，即使产生干扰素，也可能导致吸光度降低。因此，吸光度的降低可能反映了干扰素产生的增强，以及对这些SARS-CoV-2基因的固有细胞内反应的增加。

BrdU掺入的减少，因此吸光度的降低也可能是由于细胞凋亡的增加。如果吸光度的降低是由于细胞凋亡增加导致的细胞数量减少，那么这也反映了对病毒基因的先天细胞防御的激活。这表明转染细胞(用病毒基因转染的细胞)正在经历程序性细胞死亡。这一过程有可能使受感染的宿主细胞选择性地发生凋亡，留下健康的细胞。因此，受感染细胞的宿主机制被破坏或分裂，病毒没有复制或变异的地方，从而抑制了新变种的产生。

有可能干扰素也产生，转染的细胞也发生凋亡。

在每种情况下，用大麻二酚处理后细胞防御的激活都是明显的。

最近，Banerjee等人报道了SARS-CoV-2的所有负责抑制细胞RNA加工的病毒蛋白(NSP1、NSP8、NSP9和NSP16)都是在病毒生命周期的第一阶段，即双链RNA(dsRNA)产生之前产生的。dsRNA由宿主免疫传感器检测，并触发I型干扰素应答。这意味着，能够阻止干扰素转录的SARS-CoV-2病毒蛋白比引发I型干扰素应答的事件更早形成。因此，除非一种机制能够允许干扰素仍然产生，否则面对SARS-CoV-2蛋白的干扰素生产停滞，细胞对病毒感染的防御就无法激活。

本研究提供了这样一种早期防御机制，其中由于大麻二酚的存在，细胞在病毒进入后，当病毒蛋白表达时迅速产生干扰素，或者由于细胞防御导致感染细胞凋亡。

图1-6中反映BrdU掺入减少的数据未归一化为细胞数。这可能意味着，当用对照质粒转染的细胞和用不同病毒蛋白转染的质粒转染并用大麻二酚处理时，所注意到的BrdU掺入的减少实际上不是由于细胞增殖速率的降低，而是由于细胞凋亡增加而导致的细胞数量的减少。为了确认用大麻二酚处理是否降低细胞增殖，细胞增殖数据应归一化为细胞数。图7A、7B和7C提供了分别用ORF8、ORF10和M蛋白转染并用Cannabidiol处理的细胞的BrdU掺入/细胞增殖，其中BrdU相对掺入的测量标准化为每孔相对细胞数。它还提供了用对照质粒转染并用大麻二酚处理的细胞。值得注意的是，当将BrdU掺入/细胞增殖率归一化为细胞数量时，其没有显著差异，即当用对照质粒或病毒蛋白转染的细胞用Cannabidiol处理时，细胞增殖率没有降低。这意味着，尽管先前观察到BrdU掺入水平降低，但用大麻二酚处理用对照质粒或表达病毒蛋白的质粒转染的细胞不会降低细胞增殖率。进一步有必要找到早期观察到的BrdU掺入减少的原因。这可以通过结晶紫染色法进行，该法提供了孔中粘附细胞数量的相对测量。图7D、7E和7F分别提供了结晶紫测定，其中细胞被结晶紫染色，因此提供了相对细胞数。图7D提供了用对照质粒或表达ORF8的质粒转染细胞并用大麻二酚处理时的相对细胞数。

图7E提供了用对照质粒或表达ORF10的质粒转染细胞并用大麻二酚处理时的相对细胞数。图7F提供了用对照质粒或表达M蛋白的质粒转染细胞并用大麻二酚处理时的相对细胞数。

结晶紫分析表明，对于用每种病毒蛋白转染并用大麻二酚处理的细胞，相对细胞数r显著减少。这表明用大麻二酚处理的细胞凋亡，因此需要进行凋亡研究。

进行了一项研究，以找出i)细胞BrdU掺入数据未归一化为细胞数时，如先前观察到的和图1-6所示，在用病毒蛋白转染后，由于用大麻二酚处理而导致的细胞BrdU掺入减少是否是由于细胞凋亡增加，以及ii)当用病毒蛋白转染细胞并用大麻二酚处理时，相对细胞数的减少是由于细胞凋亡增加。在本研究中，令人惊讶地发现，尽管大麻二酚对用对照质粒(空质粒)转染的细胞没有任何显著影响，但对用表达病毒Orf8、Orf10或M蛋白的质粒转染的的细胞具有独特而显著的影响。本研究揭示了大麻二酚治疗新冠肺炎的几种途径。

首先，这反映了大麻二酚可能能够区分非感染细胞和感染细胞，并采取相应的行动。

其次，由于用病毒蛋白转染但未用大麻二酚处理的细胞未显示出与对照值相比的任何显著偏差/降低，因此可能在此类细胞中未产生干扰素或未诱导凋亡。

单独的病毒质粒似乎只引起细胞增殖的轻微下降(或可能增加细胞死亡，或两者兼而有之)。

细胞凋亡研究

凋亡细胞的死亡是一个高度调控的过程，其特征是细胞结构的定型和形态学变化，包括细胞收缩、质膜泡、细胞分离、磷脂酰丝氨酸外化、核浓缩和最终DNA断裂(Taylor，R.C.等人，2008年和Henry，C.M.，2013年)。

在细胞凋亡早期，细胞外磷脂酰丝氨酸浓度升高。pSIVA是与磷脂酰丝氨酸结合的早期凋亡标志物，当细胞凋亡开始时，磷脂酰丝蛋白在细胞外的浓度升高，结合后发出荧光。细胞还不需要具有渗透性才能发生这种相互作用。

在晚期凋亡中，使用碘化丙啶(PI)与DNA结合，引起荧光。PI只能在细胞处于凋亡后期时进入细胞，此时细胞和核膜已变得可渗透并开始碎裂，这允许PI进入细胞。该荧光在平板读取器中读取，该读取器在不同的激发/发射光谱下检测pSIVA和PI，因此两者都可以存在，但单独读取。

步骤如下：

1.选择HEK293(人胚胎肾)细胞进行研究。以每孔104个细胞的密度将细胞接种在96孔板中，然后生长至60-70％的汇合。

2.然后用表达对照载体即pCMV-3Tag-3A的对照质粒转染细胞，或用表达ORF8、ORF10或M蛋白的质粒转染。这些转染是重复进行的。

3.一侧用CBD处理，一侧用乙醇(0.01％v/v最终浓度)处理。

3.pORF8和pORF10质粒表达ORF8或ORF10，每个都用3xFLAG标签标记(因此pCMV-3-tag-3A基本上是一个完美的对照)，而M蛋白用绿色荧光蛋白标记。因此，pCMV-3Tag-3A代表一种控制质粒，它是一种小的外来DNA，表达一种来源于非病毒的小的外来转录物。

4.转染/处理24小时后，通过向培养基中添加两种凋亡标志物，即pSIVA(用于早期凋亡)和碘化丙啶(用于晚期凋亡)，测试细胞的相对凋亡率。

荧光读数给出了24小时处于细胞凋亡早期或晚期的孔中细胞比例的相对测量值。

实验是用固定数量的细胞开始的。然而，当实验进行超过24小时时，由于细胞凋亡，细胞会分离和破碎。早期和晚期凋亡标记物读取粘附细胞，因此当凋亡测定完成时，有必要测量孔中细胞的相对数量。

每个孔的细胞密度是通过用细胞染色剂(如结晶紫)对细胞进行染色来估计的。然后从细胞中洗脱结晶紫，并测量每个孔的吸光度。吸光度越高，细胞数量越多。下一步是通过将这些荧光值除以结晶紫吸光度测量值，将凋亡测量值(即pSIVA的总荧光和PI的总荧光)归一化为相对细胞数。

图8A和8B分别提供了用i)表达对照载体的对照质粒和ii)表达病毒蛋白ORF8的质粒转染的HEK293(人胚胎肾)细胞的早期和晚期凋亡数据；然后用大麻二酚处理。用对照质粒转染的用大麻二酚处理过的细胞在早期和晚期凋亡方面没有表现出任何显著的变化，但用表达病毒蛋白ORF8的质粒转染用大麻二酚处理过的细胞表现出明显更大的早期凋亡和晚期凋亡。

ORF8与细胞凋亡

·在用对照质粒转染的细胞中，CBD没有增加进入凋亡早期或晚期的细胞比例。

·然而，在用ORF8转染的细胞中，CBD确实显著增强了凋亡进入和晚期凋亡的细胞比例。

·与用CBD处理并用对照质粒转染的孔相比，用CBD和ORF8处理的孔中早期或晚期凋亡的细胞比例更高。

·*P<0.05，**P<0.01，表明各组之间存在显著差异，如标注所示。

由于各种原因，该数据极其重要。首先，仅在转染后24小时内出现的早期凋亡表明，由于大麻二酚的存在，早期细胞防御机制已经启动。第二，如果受感染的宿主细胞由于大麻二酚而发生凋亡，那么宿主机器就无法让病毒复制和变异。迄今为止，还没有提供抑制宿主细胞内病毒突变的方法。第三，由于用大麻二酚没有增加仅用对照质粒转染的细胞的早期或晚期凋亡，因此它不可能引起健康细胞的凋亡。第四，ORF8蛋白参与细胞宿主防御逃避和病毒发病机制。如果大麻二酚能够在宿主感染细胞中存在这种病毒蛋白的情况下起作用并导致细胞凋亡，它可以防止病毒逃避宿主的免疫系统。

这一数据表明，如果在病毒进入人体时，大麻二酚已经存在于人体中，或者在病毒进入的同时服用大麻二酚，它甚至可以通过早期干预预防感染。

ORF10与细胞凋亡

图12A和12B提供了用表达ORF10的对照质粒或病毒质粒转染并用大麻二酚处理的细胞中的早期凋亡和晚期凋亡数据。

大麻二酚对ORF10的细胞反应比对对照质粒的反应更强，表明CBD有助于细胞识别SARS-CoV-2基因并对其作出反应。相对于载体对照，大麻二酚对ORF10表达的凋亡反应的增强并不显著。

M蛋白与细胞凋亡

图15A和15B提供了用表达M蛋白的对照质粒或病毒质粒转染并用大麻二酚处理的细胞中的早期凋亡和晚期凋亡数据。

对于表达M蛋白并用大麻二酚处理的细胞，与仅用载体处理的表达M蛋白的细胞相比，早期和晚期凋亡均显著增加。

CBD没有显著改变仅表达对照质粒的细胞的早期或晚期凋亡。相对于对照转染细胞中的这些标记物，大麻二酚处理或载体处理细胞中的M蛋白表达分别显著增加了早期和晚期凋亡。因此，大麻二酚增强了M蛋白的促凋亡作用。

刺激干扰素和干扰素刺激的抗病毒效应物——ORF8蛋白

研究涉及第三步，调查大麻二酚的作用是否也是由于转染病毒蛋白的细胞产生干扰素所致。这检查了用病毒蛋白转染和用大麻二酚处理时干扰素及其下游效应物的产生。

该研究涉及评估用表达病毒ORF8的质粒转染并用大麻二酚处理的细胞的干扰素lamda-1水平。在用表达对照质粒的对照载体转染并用大麻二酚处理的细胞中也估计了水平。

图9A提供了用大麻二酚处理表达ORF8或对照质粒的细胞时产生的干扰素Lambda1mRNA水平。它还提供了表达ORF8但未用CBD处理的细胞与未用大麻二酚处理的对照处理细胞之间干扰素Lambda 1水平的产生的比较。

在表达ORF8但未经CBD处理的细胞中，与对照处理的细胞相比，干扰素Lambda 1基因表达没有显著升高。这突出了细胞对SARS-CoV-2的先天抗病毒反应不足的问题。

在表达ORF8的细胞中，与单独用载体处理相比，CBD在24小时显著增加了干扰素lambda 1，表明CBD特异性增强对SARS-Cov-2基因的抗病毒反应。

此外，还研究了用对照质粒和表达病毒蛋白的质粒转染的细胞中干扰素γ的水平。如图9B所示，CBD增加了对照和ORF8表达细胞中INF-gamma的表达，但对ORF8细胞中的表达有更大的影响。

这一发现具有巨大的应用价值。通过在短短24小时内显著提高干扰素lambda 1。

干扰素水平的升高本质上是一个有趣的发现。作为对病毒进入的反应，人体内干扰素的升高刺激了干扰素刺激的基因，也称为干扰素诱导的抗病毒效应器。如果这些基因在人体内被发现，则表明人体的免疫反应增强，健康个体能够更好地抵抗感染，因为情况不会恶化，患者能够更好地应对新冠肺炎感染。

在研究这种下游效应基因时，发明人发现这种效应基因在用病毒蛋白特别是ORF8转染并用大麻二酚处理的细胞中显著升高。

如图10所示，在用ORF8蛋白转染并用Cannabidiol处理的细胞中发现OAS1(寡腺苷酸合成酶1)基因表达的高度显著增加。如图11所示，另一种也由大麻二酚加ORF8表达诱导的干扰素刺激基因是Mx1(类动力GTPase粘病毒抗性蛋白1)。CBD增强ORF8细胞中OAS1的程度显著高于CBD增强用对照载体转染的细胞中OAS 1表达的程度。这一发现非常有趣和令人兴奋，它证实了卡纳比妥在治疗新冠肺炎感染中的作用。

有趣的是，最近Zhou Sirui等人(Zhou Sirui等人，2021)指出：

“……我们发现，OAS1水平的s.d.增加与新冠肺炎死亡或通气(优势比(or)＝0.54，P＝7×10-8)、住院(or＝0.61，P＝8×10-8)和易感性(or＝0.78，P＝8×10-6)降低有关。通过测量504名个体的OAS1水平，我们发现非感染状态下较高的血浆OAS1水平与新冠肺炎易感性和严重性降低有关。进一步的分析表明，欧洲血统个体中的OAS1的尼安德特人亚型提供了这种保护。因此，MR和病例对照研究的证据支持OAS1在新冠肺炎不良后果中的保护作用。提高OAS1水平的可用药物可优先用于药物开发。”

因此，OAS1基因水平的显著提高证实了在药物开发中可选择大麻二酚作为治疗剂。

更有趣的是，干扰素刺激的基因仅仅在用ORF8转染和大麻二酚处理时会发现上调，单独用ORF8转染时则未被发现上调，尽管干扰素gamma在用表达ORF8的质粒转染细胞时显著上调(即使不添加大麻二酚)。ORF8是一种辅助蛋白，已被提议干扰宿主的免疫反应。干扰宿主免疫反应的蛋白质在大麻二酚的存在下将不能发挥任何作用，因为在本例中ORF8被表达并且仍然大量产生OAS1。

特别是，当用表达ORF8蛋白的质粒转染细胞而不用大麻二酚处理时，与用对照质粒转染的载体处理的细胞中的水平相比，OAS1基因表达没有显著升高。这表明，在没有大麻二酚的情况下暴露于病毒蛋白的个体不能产生大量的干扰素和干扰素诱导的抗病毒效应剂，如OAS1。此外，大麻二酚对对照转染细胞的影响较小，或没有影响，这表明其安全性很高。

图11中的数据也非常有趣，因为在没有病毒蛋白ORF8的情况下，大麻二酚也产生了一定量的OAS1，这意味着如果未接触病毒的健康人食用大麻二酚，他们也可以诱导干扰素转录和干扰素诱导的抗病毒效应剂，并更好地应对病毒威胁。

当引入病毒蛋白使个体更好地对抗新冠肺炎时，这种OAS1表达可以增加10倍、20倍和30倍以上。

刺激干扰素和干扰素刺激的抗病毒效应剂——ORF10蛋白

如图13所示，在表达ORF10的细胞中，CBD显著增加了干扰素gamma的表达，这是免疫增强的标志。gamma干扰素的表达也见于用对照质粒转染的大麻二酚处理过的细胞。在没有病毒蛋白的情况下，这种表达在存在病毒蛋白ORF10的情况下增加了3-4倍。因此，大麻二酚显著增强了表达ORF10细胞的先天免疫反应。

与仅用载体处理的细胞相比，CBD显著增强了对ORF10反应的OAS1的诱导。响应ORF10加CBD的OAS1诱导低于响应CBD加对照质粒的诱导。然而，CBD确实增强了用任一质粒转染的细胞的这种抗病毒反应。

干扰素和干扰素刺激的抗病毒效应物的刺激——M蛋白

如图16A和16B所示，Cannabidiol在表达M蛋白的细胞中诱导了INF lambda 1和INF lambeda 2/3，表明Cannabidiol增强了对该SARS-CoV-2蛋白的干扰素反应，并增强了先天免疫反应。在仅用对照质粒转染的细胞中，大麻二酚不会诱导INF lambeda 1或干扰素lambeda 2/3。

Mx1是另一种干扰素诱导的抗病毒效应剂。如图17所示，与用对照载体转染并用大麻二酚处理的细胞相比，用M蛋白转染且用大麻二酚治疗的细胞具有更高的Mx1表达。这表明，CBD有可能在病毒基因表达时“启动”细胞准备应对病毒威胁。与过度表达对照质粒的细胞相比，CBD处理导致表达M蛋白的细胞中Mx1的表达增强，这表明在该病毒基因存在下增强了抗病毒反应。

在另一项更有趣的研究中，如图18所示，与载体处理的对照细胞相比，用对照质粒或M蛋白转染并用大麻二酚处理的细胞显示出OAS1基因表达的显著升高。

即使在没有病毒蛋白的情况下，大麻二酚也能增强干扰素和干扰素诱导的抗病毒效应剂。这是选择大麻二酚作为预防药物的有力理由，CBD可能有助于启动先天免疫反应的这一方面。IFIT1(干扰素诱导的具有四肽重复序列的蛋白)是另一种干扰素诱发的抗病毒效应剂。如图19所示，与单独用载体处理的细胞相比，用对照质粒和M蛋白转染并用大麻二酚处理的细胞显示IFIT1的表达升高。在表达M蛋白的细胞中，这种增强低于表达对照质粒的细胞，但仍然是显著的增强，表明CBD可能有助于启动先天免疫反应的这一方面。

正如Zhou Sirui等人(Zhou-Sirui等，2021)所报告的那样，对于治疗新冠肺炎，“可提高OAS1水平的可用药理剂可优先用于药物开发”。在测试的三种病毒蛋白中，有两种显示出强烈的理由选择CBD用于新冠肺炎治疗。

令人惊讶的是，本发明的发明人发现了多种事实，这些事实强化了CBD在预防和治疗新冠肺炎中的多种作用。

这些角色总结如下：

在细胞凋亡中的作用

1.CBD增强了细胞被病毒基因转染24小时后的早期和晚期凋亡诱导，这表明CBD可以帮助细胞抵御初始感染。受感染的宿主细胞凋亡，宿主机器不可用于病毒复制和突变。病毒转录物出现在细胞中后早期诱导细胞凋亡对感染具有高度保护作用。病毒进入细胞，然后“劫持”细胞机器，开始产生新病毒。这是导致广泛传播感染的原因，也是突变可以被引入病毒基因组的时候(即在病毒基因组复制期间)，导致新变种的出现。然而，凋亡会导致细胞器断裂，最终导致细胞分裂。如果它发生在感染后早期，它可以防止感染细胞产生新病毒。这将导致病毒和感染细胞从一个人身上早期清除，而这个人可能甚至不会意识到自己已经被感染。

2.表达ORF8的细胞中的早期凋亡非常重要，因为这种蛋白质被认为会干扰宿主的免疫反应。ORF8的独特之处在于它在病毒复制中可能是可有可无的，但它具有独特的逃避宿主细胞免疫监视的作用，即它在病毒逃避宿主细胞免疫力的方式中发挥作用。

3.与单独的载体相比，CBD不会增加对照转染细胞的早期或晚期凋亡，这表明CBD具有高度的安全性，并且CBD和SARS-CoV-2病毒蛋白的组合具有特异性。

在表达干扰素和干扰素诱导的抗病毒效应中的作用

4.干扰素的诱导导致先天的细胞内抗病毒宿主防御，其本身不需要免疫细胞。有不同类型的干扰素。1型(α和β)倾向于减缓增殖，并调节细胞存活。II型(γ)往往也调节细胞存活和增殖。III型干扰素(即Lambda型干扰物)倾向于迫使细胞凋亡，比i型或II型更为明显。尽管在I型干扰素中没有观察到太多变化，但由于CBD治疗，II型和III型干扰物也有一些显著增加。CBD扮演着双重角色。它在用病毒蛋白转染的细胞中表达干扰素，也在用对照质粒转染并用大麻二酚处理的细胞中表达干扰素。因此可以看出，即使在没有病毒的情况下，CBD也能为宿主应对病毒威胁做好准备。

5.在用大麻二酚治疗期间表达的一些干扰素诱导的抗病毒效应物包括Mx1、IFIT1和OAS1。

6.IFIT是“干扰素诱导的具有四肽重复序列的蛋白质”的缩写。它与缺乏标志性甲基化序列(表明外来(可能是病毒)来源)的RNA结合以抑制其翻译，因此是一种先天的细胞机制，其功能是帮助阻止病毒mRNA翻译成蛋白质。它还“与其他细胞蛋白相互作用，通过调节先天免疫信号和细胞凋亡，扩大它们对宿主抗病毒反应的调节作用。”因此，诱导IFIT应该有助于减缓病毒复制。CBD增强了对照转染细胞和表达M蛋白的细胞中IFIT1的转录。

7.MX1(动力样GTPase粘病毒抗性蛋白1)是一种干扰素刺激的基因。该基因可由I型和/或III型干扰素(即INFλ)诱导。Mx1抑制病毒RNA的转录。Bizzotto Juan等人(BizzotoJuan等人，2020)报告称，在SARS-CoV-2感染中，MX1水平随着病毒载量的增加而增加。Mx1转录通过CBD和ORF8或CBD和M蛋白的组合增强。

https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/32989429/

8.OAS1代表寡腺苷酸合成酶(OAS)，它是干扰素刺激的基因家族，可以通过激活RNaseL诱导病毒中的RNA降解。

Zhou等人报道，在欧洲血统的人中，高水平的OAS1与尼安德特人单核苷酸多态性相关，高水平可降低新冠肺炎死亡、通气、住院或易感性的风险。

在测试的三种蛋白质中，用两种蛋白质即ORF8和M蛋白转染并用大麻二酚处理的细胞显示OAS1基因的表达显著增加。这使大麻二酚成为治疗新冠肺炎的确诊候选药物。

OAS1产生后将激活内核糖核酸酶L(RNAse L)，该酶降解所有细胞RNA，包括病毒和细胞RNA。这导致细胞凋亡，这在本例中是明显的。这一作用远比允许细胞存活的抗病毒或复制抑制作用更大、更显著。

与载体对照处理相比，在表达对照质粒或ORF8、ORF10或M蛋白的细胞中，CBD处理显著提高了OAS1转录水平。预期这将显著增强细胞凋亡对病毒存在的反应，或使细胞为病毒感染做好准备，从而对病毒感染产生更快速的抗病毒、促凋亡反应。

增强OAS1基因的诱导与对SARS-CoV-2的显著保护有关(高表达的人不太可能生病)。

因此，综上所述，大麻二酚有多种途径增强宿主细胞的免疫反应。它使宿主细胞为病毒威胁做好准备，并可作为预防药物。用CBD处理的对照转染细胞中OAS1表达和INF-γ的轻微增加表明，CBD“启动”细胞准备对病毒威胁作出反应，而实际上不增加细胞凋亡。另一方面，当用大麻二酚处理转染病毒蛋白的细胞时，发现干扰素和干扰素诱导的效应基因的显著增加可以增强细胞的免疫反应。大麻二酚引起ORF8和M蛋白转染细胞的早期和晚期凋亡。无论细胞凋亡是由于大麻二酚单独引起的，还是由于III型干扰素(即Lambda干扰素)水平的增加，后者倾向于迫使细胞凋亡，都会使感染的宿主细胞无法被病毒复制和变异。

大麻二酚

大麻二酚还可以改善新冠肺炎现有免疫策略的效果，包括但不限于通过减少接种后和个体完全免疫反应前病毒颗粒传播的机会，同时通过防止突变防止病毒基因库的扩大。

事实上，即使在通过疫苗接种获得免疫力后，感染SARS-CoV-2的个体在病毒复制过程中发生突变时仍能产生新的变异，因为病毒复制发生在细胞感染和激活有效的完全体液获得(也称为适应性)免疫应答之间的时间。这种激活可能需要数小时至数天的时间，因此，即使接种疫苗的人也可能在这段时间内传播病毒，并产生变异株。通过增强暴露于病毒基因的细胞的凋亡，大麻二酚可以防止病毒复制，从而防止新的SARS-CoV-2变异体的形成。

大麻二酚也可以作为候选药物，包括但不限于对旅行者、基本工作人员和其他高危人群进行预防，以潜在地控制病毒在宿主体内的传播以及传播给他人。此外，预防突变的潜力变得非常重要，特别是对于那些可能容易将非本土菌株引入新地理区域的旅行者来说，这可能会增加变异。

大麻二酚也已获得监管批准，可用于1岁以下罕见癫痫患者的儿科用药。因此，对于可能是Sars-CoV-2和其他病毒的无症状携带者和/或病毒蓄水池的儿童，其用于预防的潜力不能被削弱，以减少社区传播和增加变异和突变的机会。大麻二酚也可以用于新生儿，可作为大麻二酚的单一治疗或作为Sars-CoV-2和其他病毒的预防或辅助治疗。

大麻二酚(CBD)的合适剂量/治疗有效量为0.00001mg/kg体重至4000mg/kg体重。大麻二酚的合适剂量/治疗有效量也可以是0.00001至1000mg/kg体重或0.00001至500mg/kg体重。大麻二酚的优选剂量/优选治疗有效量可以是0.00001至100mg/kg体重或0.00001至10mg/kg体重。

剂量将取决于人类或动物患者健康的性质和状态。它还取决于年龄和合并症(如果有的话)。此外，剂量将取决于类型，例如口服或肠外或局部的组合物。

为了更好地理解本发明，我们描述了以下药物制剂/组合物，它们不以任何方式限制本发明的范围。

药物成分：

合适的口服剂型包括但不限于片剂——舌下、口腔、泡腾、咀嚼；片剂、锭剂、可分散粉末或颗粒剂；胶囊、溶液、悬浮液、糖浆、锭剂、含药牙龈、口腔凝胶或贴剂。片剂可以使用本领域熟知的压缩或模塑技术制成。其他剂型也可以通过3D或4D打印以及碳石墨烯负载的纳米颗粒和微粒制备。明胶或非明胶胶囊可以配制成硬或软胶囊壳，其可以使用本领域公知的技术封装液体、固体和半固体填充材料。

以下实例提供了大麻二酚(CBD)的各种药物组合物

口服喷雾剂配方包括大麻二酚(CBD)；每种浓度为0.00001mg至200mg/ml，并具有赋形剂如稀释剂，即甘露醇，浓度范围为10–15mg/ml；甜味剂如5-10mg/ml的三氯蔗糖，风味剂如覆盆子、草莓5-10mg/ml，滋味调节剂如0.1-0.5mg/ml的氯化钠和丙二醇，用纯净水作为基础溶剂或载体。制剂的比重可以在1.01至1.5g/ml之间。

此外，所述口服喷雾剂可包含表面活性剂、增溶剂和胶凝剂，如Pluronic F127或Poloxamer 407，浓度范围为1–200mg/ml。该制剂在低于10℃的温度下为液体，在高于30℃的温度范围内开始胶凝。这是一种无菌、无热原的溶液。如果重新配制，pH值范围应为5-9，优选为6.5-7.5。可以使用带有专用喷嘴的适当喷雾容器进行给药，以便于在舌头下方，即舌下或口腔或鼻腔内喷雾。喷雾也可以是微米级或纳米级悬浮液的形式。鼻喷雾剂配方将不含甜味剂和香料。它在体温下凝胶，从而促进更长的停留时间，可能增强药物通过粘膜衬里的渗透。这种药物递送模式绕过了胃的苛刻酸性条件，也绕过了肝脏的分解，从而可能提高了生物利用率。制剂的比重可以在1.01至1.7g/ml之间。

注射制剂含有大麻二酚(CBD)；浓度为0.00001mg至200mg/ml，增溶剂如乙醇20％/ml和丙二醇40％/ml，注射用水～40％/ml。溶液应为等渗性，可使用张力调节盐如氯化钠。5-9的pH范围可以用合适的缓冲剂调节，最好是6-8，最好是6.5-7.5。这是一种无菌、无热原的溶液。所述注射制剂可以是溶液或微米级或纳米级分散体的形式。所述制剂也可以在有或没有医疗设备的帮助下通过吸入(计量或未计量)和/或通过雾化鼻腔给药(即肺部给药)给药。所述制剂还可以通过口腔途径使用适当的医疗设备以口腔滴剂或口腔喷雾的形式给药。所述制剂可以通过舌下途径使用适当的医疗设备作为舌下滴剂或作为舌下喷雾施用。无菌注射制剂的另一变型也可以是冻干注射剂。该注射液还可含有柠檬酸钠二水合物和无水柠檬酸；最后为白色至黄色冻干粉末或塞子。该溶液只能用1至2mL无防腐剂无菌氯化钠注射液、0.9％或无防腐性无菌注射用水配制。复原的溶液是透明的，微黄色，基本上没有可见颗粒。制剂的比重可以在1.01至1.7g/ml之间。液滴的粒度可以在5微米至500微米的范围内。

吸入剂或肺胶囊的大麻二酚(CBD)浓度为0.00001mg至50mg/胶囊，并含有辅料，如硬脂酸镁[吸入级]或乳糖[吸入级]。该制剂的核心重量范围为25–500mg/胶囊。

气雾剂或肺给药系统的大麻二酚(CBD)浓度为0.00001mg至100mg/次，并含有推进剂气体、丙二醇、水、表面活性剂、防泡沫乳液和防冻赋形剂等赋形剂。液滴的粒度可以在5微米至500微米的范围内。

舌下片含有大麻二酚(CBD)；浓度为0.00001mg至50mg/片，并具有赋形剂如稀释剂，即乳糖一水合物或甘露醇，范围为10–30mg/片；

崩解剂，如淀粉或Crospovidone，10-15mg/片；填料如微晶纤维素5-10mg/片，润滑剂如硬脂酸镁0.5–1mg/片。它还可以含有大约5-10mg/片的味道调节剂或掩蔽剂，如氯化钠或缓冲剂，如磷酸二氢钾。该制剂的核心重量范围为50-80毫克/片。

口服分散片(ODT)的大麻二酚(CBD)含量为0.00001mg至100mg/片，辅料如稀释剂，即乳糖一水合物或甘露醇，含量范围为10-15mg/片；崩解剂，如淀粉或Crospovidone，10-15mg/片；填料如微晶纤维素5-10mg/片，润滑剂如硬脂酸镁0.5-1mg/片。该制剂的核心重量范围为50-80毫克/片。

口腔片含有0.00001mg至100mg/片的大麻二酚(CBD)，并含有赋形剂，例如聚合物，即丙烯酸和丙烯酸C10-C30烷基酯的聚合物，其与烯丙基季戊四醇交联，例如Carbopol934，范围为10-15mg/片，或羟丙基甲基纤维素(HPMC)K4M，范围为35-40mg/片；填料，如甘露醇(可直接压缩)，10-15mg/片；和润滑剂，如硬脂酸镁，0.5-1mg/片。该制剂的核心重量范围为50-80毫克/片。

延迟释放片剂含有0.00001mg至200mg/片的大麻二酚(CBD)，并含有赋形剂，如甘露醇、微晶纤维素(MCC PH 102)、磷酸三钠、羟丙基甲基纤维素(HPMC 5cps)、羟基丙基甲基纤维(HPMC 15cps)和Crospovidone、胶体二氧化硅，硬脂酸镁作为片剂芯，使用合适的溶剂体系(即水性、非水性)涂覆有包含乙基纤维素的密封涂层组合物；优选非水(异丙醇和二氯甲烷)，使最终用水性抗胃包衣组合物即Eudragit L100-55、柠檬酸三乙酯、遮光剂和着色剂包衣的片剂芯增加4-5％重量，使片剂芯的总重量增加26-30％。该制剂的核心重量范围为50-1200mg/片。

缓释片含有0.00001mg至200mg/片的大麻二酚(CBD)，并含有赋形剂如填料，即微晶纤维素(MCC PH 101)；聚合物，即羟丙基甲基纤维素(HPMC K100M)和羟丙基乙基纤维素(HPMCK15M)；

粘合剂，即聚维酮(PVP K29/32)和润滑剂，即硬脂酸镁，作为片剂芯，使用合适的溶剂体系，即水性或非水性，涂覆有薄膜包衣组合物；优选非水(异丙醇和二氯甲烷)，使片剂芯重增加2-3％。该制剂的核心重量范围为50-1200mg/片。

泡腾片的大麻二酚(CBD)含量为0.00001mg至200mg/片，辅料如柠檬酸、碳酸氢钠、柠檬酸钾、甘露醇、阿斯巴甜、草莓味剂、缓冲剂、苯甲酸钠和聚乙二醇6000。该制剂的核心重量可在50至2000mg/片之间。

渗透控制释放口服递送系统(OROS)片剂含有0.00001mg至200mg/片的大麻二酚(CBD)，并含有赋形剂如山梨糖醇单月桂酸酯和氯化钠、微晶纤维素(MCC PH 102)、聚合物即羟丙基甲基纤维素(HPMC K100M)和羟丙基乙基纤维素(HPMCK15M)，胶体二氧化硅和硬脂酸镁作为片剂芯；片剂芯的薄膜涂层使用非水介质将片剂芯的重量增加2.5至3.0％w/w，并用乙酸纤维素在异丙醇中的非水分散体对片剂进行功能涂层。该制剂的核心重量范围为50-1000毫克/片。

胶囊含有0.00001mg至200mg/胶囊的大麻二酚(CBD)，并含有辅料如微晶纤维素(MCC PH 105)、胶体二氧化硅和硬脂酸镁作为芯；包裹在硬明胶胶囊中。该制剂的核心重量范围为30-2055mg/粒。

压缩的锭剂或咀嚼剂或棒棒糖含有0.00001mg至200mg/单位的大麻二酚(CBD)，并含有赋形剂，聚维酮(PVP K29/32)和FD&C黄色6号和硬脂酸镁为核心。配方的核心重量范围为100-3000mg/单位

软凝胶胶囊的大麻二酚(CBD)含量为0.00001mg至200mg/胶囊，辅料如丙二醇、聚乙二醇-400、聚乙烯吡咯烷酮K29/32、丁基羟基甲苯和乙醇-水混合物作为填充到不透明软凝胶胶囊中的核心材料。该制剂的核心重量范围为100-800毫克/粒。

快速溶解膜-口服和/或舌下，含有0.00001mg至200mg/单位的大麻二酚(CBD)，并含有赋形剂，如普鲁兰糖、山梨醇、聚山梨酯80、三氯蔗糖、甘草酸单铵和薄荷味。配方的核心重量范围为50–800mg/单位

Oro口腔粘胶膜-口腔或舌下，含有0.00001mg至200mg/单位的大麻二酚(CBD)，并含有赋形剂，如羟丙基纤维素、羟乙基纤维素和羧甲基纤维素钠、聚羟基35蓖麻油(Cremophore EL/Kolliphor EL)、苯甲酸钠、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、，柠檬酸钠和糖精钠。配方的核心重量可以是50-80毫克/单位。

口服乳剂含有0.00001mg至200mg/g的大麻二酚(CBD)，并含有赋形剂，如聚羟基35蓖麻油(Cremophore EL/Kolliphor EL)、糖精钠、焦糖、着色剂、薄荷油、玉米油、蔗糖和水。配方的比重可以在0.5–1.5g/ml之间。

阴道凝胶含有0.00001mg至200mg/g的大麻二酚(CBD)，并含有赋形剂如聚羟基35蓖麻油(Cremophore EL/Kolliphor EL)、抗坏血酸、甘油或丙二醇、羟丙基甲基纤维素(HPMC E50)、柠檬酸三钠二水合物和水。具体的配方的比重可以在1.01–1.8g/ml之间。

滴眼剂制剂含有0.00001mg至200mg/ml的大麻二酚(CBD)，并含有赋形剂，如聚山梨酯20/80、苯扎氯铵、乙二胺四乙酸二钠、羧甲基纤维素钠(Na CMC)、柠檬酸一水合物、氢氧化钠、盐酸和水。最终的溶液是无菌的。配方的比重可以在1.01–1.8g/ml之间。

栓剂制剂含有0.00001mg至200mg/g的大麻二酚(CBD)，并含有硬脂、表面活性剂等赋形剂和以下非活性成分：丁基羟基茴香醚、丁基羟基甲苯、乙二酸、甘油、聚乙二醇3350、聚乙二醇8000、纯净水和氯化钠。配方的核心重量范围为200–3000mg/单位

实施例

实施例1：测量细胞增殖率的方法

通过将溴脱氧尿苷(BrdU)掺入并定量到活跃增殖细胞的DNA中来测量溴脱氧尿苷掺入率。吸光度值由ELISA测定，它通过BioTek Synergy H1混合多模微孔板阅读器在370nm(参考波长：约492nm)下测定吸光度值。图1-5提供了所执行测试的结果。然而，请注意，只有将数据归一化为细胞数，才能推断出细胞增殖水平。图6结合了所有图中的数据，以便进行比较。吸光度表示为未处理对照的％。在图7中，数据被归一化为相对细胞数。

实施例2-结晶紫染色

如Duncan，R.E.等人所述，使用结晶紫染色定量相对细胞数[Duncan、R.E.等人，2004]。简言之，在BrdU掺入试验或细胞凋亡试验后，用1x磷酸盐缓冲盐水(PBS)轻轻洗涤接种在96孔板中的细胞，用10％甲醇10％乙酸固定并用结晶紫染色。在595nm的读板器中测量样品的吸光度。

实施例3：细胞凋亡测定

根据制造商的说明，使用凋亡检测试剂盒(Abcam，ab 129817)检测凋亡细胞。简言之，转染后24小时，接种在96孔板中的培养细胞用极性敏感的存活和凋亡指示剂(pSIVA，检测早期/持续的凋亡)和碘化丙啶(PI，检测晚期凋亡)标记。用平板阅读器在469/525nm(用于检测pSIVA)和531/647nm(用于PI)下测量样品的荧光。

实施例4：测量干扰素和效应基因表达水平的方法

逆转录酶-实时定量聚合酶链反应(qPCR)分析如我们先前所述进行。细胞在24孔板中生长，并用pCMV-3Tag-3A作为对照载体或表达ORF8、ORF10或M蛋白的质粒转染，6小时后用1μM CBD或载体对照(0.01％乙醇)处理24小时。简言之，使用制造商(Invitrogen，Waltham，MA)描述的

引物序列：

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参考文献：

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