一种鸡骨草配方颗粒HPLC特征图谱构建方法

技术领域

本发明涉及分析检测技术领域，尤其是涉及一种鸡骨草配方颗粒HPLC特征图谱构建方法。

背景技术

鸡骨草是豆科植物相思子属植物，在我国有着悠久的用药历史，常以全株入药，具有利湿退黄、清热解毒、舒肝止痛等功效，临床上常用于湿热黄疸，胁肋不舒，胃脘胀痛，乳痈肿痛，脂肪性肝病、肝炎和跌打内伤的治疗。此外，鸡骨草还具有抗肿瘤、抗氧化、抗菌、抗病毒、抗炎镇痛、促进伤口愈合、免疫调节等多种药理作用。鸡骨草广泛的药理作用，加之廉价易栽培的特点，使其具有极高的经济价值和社会效益，有着巨大的开发潜力和广阔的市场前景。经文献查阅发现，对鸡骨草配方颗粒进行的相关质量标准研究较少。

目前缺少一种有效手段对其进行质量控制。本发明旨在构建一种鸡骨草配方颗粒高效液相特征图谱方法，全面反映鸡骨草配方颗粒及其相关制剂的质量水平，为鸡骨草配方颗粒药材、饮片及其相关制剂在质量控制方面提供指导。

发明内容

有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种鸡骨草配方颗粒HPLC特征图谱构建方法，本发明构建的鸡骨草配方颗粒HPLC特征图谱方法稳定，可靠，可以对鸡骨草配方颗粒的质量进行控制。

本发明提供了一种鸡骨草配方颗粒HPLC特征图谱构建方法，包括：

A)将供试品原料采用溶剂溶解，提取，得到待测液；

B)将待测液采用高效液相色谱法测定，得到鸡骨草配方颗粒HPLC特征图谱；

所述高效液相色谱法色谱条件为：色谱柱为C18柱；流动相A为0.1％甲酸水溶液，流动相B为乙腈，梯度洗脱。

优选的，还包括制备参照物溶液：分别取没食子酸、相思子碱、刺桐碱、异夏佛塔苷、夏佛塔苷、维采宁-2，采用甲醇溶解，得到参照物溶液；

将所述参照物溶液采用高效液相色谱法测定，得到参照物的色谱图；并根据参照物的色谱图对鸡骨草配方颗粒HPLC特征图谱的成分进行定性。

优选的，所述参照物溶液的浓度具体为：没食子酸为50μg/mL，相思子碱为50μg/mL，刺桐碱为60μg/mL，异夏佛塔苷为55μg/mL，夏佛塔苷为50μg/mL，维采宁-2为30μg/mL。

优选的，所述梯度洗脱具体为：

0～4min，A相：98～90％、B相：2～10％；

4～16min，A相：90％～90％、B相：10％～10％；

16～17min，A相：90％～86％、B相：10％～14％；

17～20min，A相：86％～85％、B相：14％～15％；

20～21min，A相：85％～85％、B相：15％～15％；

21～22min，A相：85％～83％、B相：15％～17％；

22～50min，A相：83％～83％、B相：17％～17％。

优选的，所述色谱柱为InertSustain C18 250×4.6mm5μm、phenomenexC18250×4.6mm 5μm、Agilent 5TC-C18(2)250×4.6mm5μm；柱温35℃。

优选的，所述流动相流速为1.0mL/min；检测波长为280nm；进样量为10μL。

优选的，采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统对鸡骨草配方颗粒HPLC特征图谱的相似度进行评价，得到由7个特征峰构成的鸡骨草配方颗粒HPLC标准特征图谱，其中峰1为没食子酸，峰2为相思子碱，峰3为刺桐碱，峰4为维采宁-2，峰5为夏佛塔苷，峰6为异夏佛塔苷。

优选的，在所述标准特征图谱中，以维采宁-2为参照峰S峰，计算各特征峰与S峰的相对保留时间，所述相对保留时间在规定值的±8％之内，所述规定值分别为：0.308(峰1)、0.459(峰2)、0.601(峰3)、1.000(峰4，S)、1.092(峰5)、1.132(峰6)、1.245(峰7)。

优选的，步骤A)所述溶剂为水；所述提取为加热回流提取或超声提取；所述加热回流提取的时间为20～40min；所述超声的功率为600W，频率40kHz；超声时间为30min。

优选的，步骤A)所述供试品原料的质量g和溶剂的体积mL的比为(0.2～0.3)：(20～30)；

所述供试品原料为鸡骨草配方颗粒。

与现有技术相比，本发明提供了一种鸡骨草配方颗粒HPLC特征图谱构建方法，包括：A)将供试品原料采用溶剂溶解，提取，得到待测液；B)将待测液采用高效液相色谱法测定，得到鸡骨草配方颗粒HPLC特征图谱；所述高效液相色谱法色谱条件为：色谱柱为C18柱；流动相A为0.1％甲酸水溶液，流动相B为乙腈，梯度洗脱。本发明采用高效液相色谱法，选用乙腈-0.1％甲酸溶液为流动相进行梯度洗脱，以没食子酸、相思子碱、刺桐碱、异夏佛塔苷、夏佛塔苷、维采宁-2为参照物，建立了鸡骨草配方颗粒HPLC特征图谱，重复性、精密度好，方法稳定，可靠，可以对鸡骨草配方颗粒的质量进行控制。

附图说明

图1为没食子酸紫外吸收光谱图；

图2相思子碱紫外吸收光谱图；

图3刺桐碱紫外吸收光谱图；

图4夏佛塔苷紫外吸收光谱图；

图5异夏佛塔苷紫外吸收光谱图；

图6维采宁-2紫外吸收光谱图；

图7鸡骨草配方颗粒3D色谱图；

图8鸡骨草配方颗粒各波长比较图；

图9为色谱柱温度考察结果图；

图10为流速考察结果图；

图11为延迟性试验结果图；

图12为提取溶剂考察结果图；

图13为提取方式考察结果图；

图14为提取时间考察结果图；

图15为溶媒用量考察结果图；

图16鸡骨草配方颗粒特征图谱色谱峰指认；

图17不同仪器考察结果图；

图18鸡骨草配方颗粒色谱柱耐用性考察；

图19鸡骨草配方颗粒特征图谱；

图20为鸡骨草配方颗粒对照特征图谱；

图21为不同流动相对比图；

图22为不同流动相梯度图。

具体实施方式

本发明提供了一种鸡骨草配方颗粒HPLC特征图谱构建方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都属于本发明保护的范围。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明提供了一种鸡骨草配方颗粒HPLC特征图谱构建方法，包括：

A)将供试品原料采用溶剂溶解，提取，得到待测液；

B)将待测液采用高效液相色谱法测定，得到鸡骨草配方颗粒HPLC特征图谱；

所述高效液相色谱法色谱条件为：色谱柱为C18柱；流动相A为0.1％甲酸水溶液，流动相B为乙腈，梯度洗脱。

本发明供试品原料包括但不限于鸡骨草配方颗粒。

本发明提供的一种鸡骨草配方颗粒HPLC特征图谱构建方法首先将取鸡骨草配方颗粒原料，溶剂溶解，提取，得到待测液。所述溶剂优选为水。

具体为将鸡骨草配方颗粒内容物，溶剂溶解，提取，放冷，摇匀，滤过，即得。

本发明所述提取为加热回流提取或超声提取；所述加热水流提取的时间优选为15～45min；更优选为20～40min；最优选为30min。

所述超声的功率为600W，频率40kHz；超声时间为30min。

其中，所述鸡骨草配方颗粒原料的质量g和溶剂的体积mL的比优选为(0.2～0.3)：(20～30)；更优选为0.5：25。

本发明上述原料皆可通过本发明的方法进行质量控制和定性定量检测。

本发明还包括制备参照物溶液：分别取没食子酸、相思子碱、刺桐碱、异夏佛塔苷、夏佛塔苷、维采宁-2，采用甲醇溶解，得到参照物溶液。

其中，没食子酸为50μg/mL，相思子碱为50μg/mL，刺桐碱为60μg/mL，异夏佛塔苷为55μg/mL，夏佛塔苷为50μg/mL，维采宁-2为30μg/mL。

将所述参照物溶液采用高效液相色谱法测定，分别得到参照物的色谱图；并根据参照物的色谱图对鸡骨草配方颗粒HPLC特征图谱的成分进行定性测定。

本发明所述流动相流动相A为0.1％甲酸水溶液，流动相B为乙腈，梯度洗脱。

本发明所述梯度洗脱优选具体为：

0～4min，A相：98～90％、B相：2～10％；

4～16min，A相：90％～90％、B相：10％～10％；

16～17min，A相：90％～86％、B相：10％～14％；

17～20min，A相：86％～85％、B相：14％～15％；

20～21min，A相：85％～85％、B相：15％～15％；

21～22min，A相：85％～83％、B相：15％～17％；

22～50min，A相：83％～83％、B相：17％～17％。

本发明在上述洗脱梯度下基线分离好，各个峰分离度好，基线平稳。

InertSustain C18 250×4.6mm5μm、phenomenexC18 250×4.6mm 5μm、Agilent5TC-C18(2)250×4.6mm5μm。

本发明采用色谱柱进行耐用性检测，耐用性良好。

本发明柱温优选为35℃。本发明在上述色谱柱温度下色谱峰峰形较好，分离度适中。

流动相流速优选为1.0mL/min。

本发明发现流速1.0mL/min下各色谱峰分离较好，分离度适中，作为最优选方案。

本发明柱温优选为35℃。

本发明检测波长优选为280nm。

本发明人发现，在280nm处色谱峰信息量较大，色谱图基线更平稳，各峰峰面积较大。

本发明进样量为10～15μL；优选为10μL。

本发明的有益效果是，一个液相色谱条件下，以特征图谱控制鸡骨草配方颗粒的物质群，以没食子酸、相思子碱、刺桐碱、异夏佛塔苷、夏佛塔苷、维采宁-2对特征图谱进行定位；能够大大降低检测的成本，实现定性检测。

采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统对鸡骨草配方颗粒HPLC特征图谱的相似度进行评价，得到由7个特征峰构成的鸡骨草配方颗粒HPLC标准特征图谱，其中峰1为没食子酸，峰2为相思子碱，峰3为刺桐碱，峰4为维采宁-2，峰5为夏佛塔苷，峰6为异夏佛塔苷。

在所述标准特征图谱中，以维采宁-2为参照峰S峰，计算各特征峰与S峰的相对保留时间，所述相对保留时间在规定值的±8％之内，所述规定值分别为：0.308(峰1)、0.459(峰2)、0.601(峰3)、1.000(峰4，S)、1.092(峰5)、1.132(峰6)、1.245(峰7)。

质量判断标准：取鸡骨草配方颗粒样品，按上述同法操作，得到鸡骨草配方颗粒特征图谱，采用国家药典委员会《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》2012版对鸡骨草配方颗粒标准特征图谱和样品特征图谱进行分析，相似度大于0.90。

采用本发明所提供的方法能有效的监控不同批次鸡骨草配方颗粒的质量，使其质量稳定，方法具有精密度高、重现性好等特点，有利于全面监控产品的质量。

本发明建立的鸡骨草配方颗粒特征图谱以尿嘧啶、腺嘌呤、次黄嘌呤，为参照物，注重各个特征峰的顺序和与药材及中间产品的相关性，能全面评价产品的整体质量面貌特征，方法科学可靠。

本发明提供了一种鸡骨草配方颗粒HPLC特征图谱构建方法，包括：A)将供试品原料采用溶剂溶解，提取，得到待测液；B)将待测液采用高效液相色谱法测定，得到鸡骨草配方颗粒HPLC特征图谱；所述高效液相色谱法色谱条件为：色谱柱为C18柱；流动相A为0.1％甲酸水溶液，流动相B为乙腈，梯度洗脱。本发明采用高效液相色谱法，选用乙腈-0.1％甲酸溶液为流动相进行梯度洗脱，以没食子酸、相思子碱、刺桐碱、异夏佛塔苷、夏佛塔苷、维采宁-2为参照物，建立了鸡骨草配方颗粒HPLC特征图谱，重复性、精密度好，方法稳定，可靠，可以对鸡骨草配方颗粒的质量进行控制。

为了进一步说明本发明，以下结合实施例对本发明提供的一种鸡骨草配方颗粒HPLC特征图谱构建方法进行详细描述。

高效液相色谱仪：Waters2695-e2998型高效液相色谱仪、安捷伦1260型高效液相色谱仪、岛津LC-20AD型高效液相色谱仪；

电子天平：ME204E/02、MS205DU、XP26(梅特勒-托利多仪器有限公司)；

超纯水机：细胞型1810A(上海摩勒科学仪器有限公司)；

超声波清洗器：KQ5200DB型(600W，40KHz；昆山市超声仪器有限公司)；

色谱柱：InertSustainC18 250×4.6mm 5μm、phenomenex C18 250×4.6mm5μm、Agilent 5-TC C18(2)5μm 4.6×250mm；

乙腈、甲酸为色谱纯，水为超纯水，其余试剂均为分析纯；

没食子酸(中国食品药品检定研究院，批号：110831-201611，含量以95.6％计)；

相思子碱(中国食品药品检定研究院，批号：111808-201302，含量以96.6％计)；

刺桐碱(四川省维克奇生物科技有限公司，批号：wkq18012302，含量≥92％)；

维采宁-2(四川省维克奇生物科技有限公司，批号：wkq18012302，含量≥98％)；

夏佛塔苷(北京世纪奥科生物技术有限公司，批号：180320，含量≥98％)；

异夏佛塔苷(北京世纪奥科生物技术有限公司，批号：170813，含量≥98％)；

鸡骨草对照药材(北京世纪奥科生物技术有限公司，批号：171110)。

鸡骨草配方颗粒(SY1810001、SY1810002、SY1810003、1802001)。

实施例1色谱条件筛选

1.2色谱条件

以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(柱长为250mm，内径为4.6mm，粒度为5μm)；以0.1％甲酸为流动相A，以乙腈为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；流速为每分钟1.0mL；柱温为35℃；检测波长为280nm。理论板数按维采宁-2峰计算应不低于6000。

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1.2.1波长选择

在以上拟定的实验条件基础上，利用二极管阵列检测器对供试品溶液进行全波段扫描，并分别提取供试品溶液在250nm、270nm、280nm、300nm、330nm波长下的色谱图。见图1-图8。其中图1为没食子酸紫外吸收光谱图；

图2相思子碱紫外吸收光谱图；图3刺桐碱紫外吸收光谱图；图4夏佛塔苷紫外吸收光谱图；图5异夏佛塔苷紫外吸收光谱图；图6维采宁-2紫外吸收光谱图；图7鸡骨草配方颗粒3D色谱图；图8鸡骨草配方颗粒各波长比较图。结果表明，在检测波长为280nm时色谱峰信息量较大，色谱图基线更平稳，各峰峰面积较大，故检测波长确定为280nm。

1.2.2柱温考察

在以上拟定的实验条件基础上，分别对柱温为25℃、30℃、35℃时进行考察。见图9、表1。图9为色谱柱温度考察结果图；

表1柱温考察—特征峰相对保留时间比值

结果表明，柱温分别为25℃、30℃、35℃时，各特征峰的相对保留时间RSD为0.00％-4.64％，在柱温为35℃时，色谱图峰形较好，分离度适中。故柱温确定为35℃。

1.2.3流速考察

在以上拟定的实验条件基础上，分别对流速为0.8ml/min、1ml/min、1.2ml/min时进行了考察。见图10，表2；图10为流速考察结果图。

表2流速考察—特征峰相对保留时间比值

结果表明，流速分别为0.8mL/min、1.0mL/min、1.2mL/min时，各特征峰的相对保留时间RSD为0.00％-16.39％，在流速为1.0mL/min时，色谱图峰形较好，分离度适中。故流速确定为1.0mL/min。

1.2.4延迟性试验

在以上拟定的实验条件基础上，将色谱图采集时间延长至100min。结果见图11，图11为延迟性试验结果图。

结果表明，在色谱图采集到50分钟时，已将色谱峰采集完全。故将色谱图采集时间确定为50分钟。

1.3参照物溶液的制备

取鸡骨草对照药材约0.5g，精密称定，精密加入水50ml，称定重量，超声处理(功率600W，频率40kHz)30分钟，放冷，再称定重量，用水补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，作为对照药材参照物溶液。

另取没食子酸对照品、相思子碱对照品、刺桐碱对照品、异夏佛塔苷对照品、夏佛塔苷对照品、维采宁-2对照品适量，精密称定，加甲醇分别制成每1ml含没食子酸50μg、相思子碱50μg、刺桐碱60μg、异夏佛塔苷55μg、夏佛塔苷50μg、维采宁-2 30μg的混合溶液，作为对照品参照物溶液。

1.4供试品溶液的制备

1.4.1提取溶剂考察

取本品(批号：1802001)约0.25g，共四份，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别对供试品提取溶剂为水、甲醇、80％甲醇、50％甲醇溶液时进行考察，加入各提取溶剂25mL，密塞，称定重量，超声处理(功率600W，频率40kHz)30分钟，放冷，再称定重量，用提取溶剂补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。见图12，图12为提取溶剂考察结果图。

结果表明，在提取溶剂为水时，所得的色谱图色谱峰信息量大，峰形较好，分离度好，故选择水作为鸡骨草配方颗粒特征图谱的提取溶剂。

1.4.2提取方式考察

取本品(批号：1802001)约0.25g，共两份，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入水25mL，密塞，称定重量，分别对供试品提取方法为回流提取和超声提取进行考察，提取时间30分钟，放冷，再称定重量，用水补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。见图13，图13为提取方式考察结果图。

结果表明，对供试品分别进行超声提取与回流提取时，提取所得的色谱图峰形和峰面积无显著差异，故选择简便的超声方式作为鸡骨草配方颗粒供试品溶液制备的提取方法。

1.4.3提取时间考察

取本品(批号：1802001)约0.25g，共三份，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入水25mL，密塞，称定重量，超声处理(功率600W，频率40kHz)，分别对供试品提取时间为10分钟、30分钟、50分钟进行考察，放冷，再称定重量，用水补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。见图14。图14为提取时间考察结果图；结果表明，在提取时间为30分钟时，即可充分提取，所得的色谱图峰形较好。故供试品提取时间确定为30分钟。

1.4.4溶媒用量考察

取本品(批号：1802001)约0.25g，共三份，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入水，密塞，称定重量，超声处理(功率600W，频率40kHz)30分钟，分别对供试品溶媒用量为10mL、25mL、50mL进行考察，放冷，再称定重量，用水补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。见图15。图15为溶媒用量考察结果图。

结果表明，在溶媒用量为25mL时，色谱峰面积适中，峰形较好。故供试品溶媒用量确定为25mL。

1.4.5最终确定供试品制备方法

取本品适量，研细，取约0.25g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入水25mL，密塞，称定重量，超声处理(功率600W，频率40kHz)30分钟，放冷，再称定重量，用水补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

实施例2方法学考察

2.5.1色谱峰指认

供试品溶液的制备：按以上拟定的实验条件，制备鸡骨草配方颗粒供试品溶液。

参照物溶液的制备：取鸡骨草对照药材约0.5g，精密称定，精密加入水50ml，称定重量，超声处理(功率600W，频率40kHz)30分钟，放冷，再称定重量，用水补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，作为对照药材参照物溶液。另取没食子酸对照品、相思子碱对照品、刺桐碱对照品、异夏佛塔苷对照品、夏佛塔苷对照品、维采宁-2对照品适量，精密称定，加甲醇分别制成每1ml含没食子酸50μg、相思子碱50μg、刺桐碱60μg、异夏佛塔苷55μg、夏佛塔苷50μg、维采宁-2 30μg的溶液，作为对照品参照物溶液。

阴性对照溶液的制备：按以上拟定的实验条件，制备鸡骨草配方颗粒阴性对照溶液。

对鸡骨草配方颗粒特征图谱峰进行定位。见图16。图16鸡骨草配方颗粒特征图谱色谱峰指认：结果表明，峰1为没食子酸；峰2为相思子碱；峰3为刺桐碱；峰4为维采宁-2；峰5为夏佛塔苷；峰6为异夏佛塔苷。在以下方法学考察中，对样品中的7个峰进行考察。

2.5.2精密度试验

取鸡骨草配方颗粒供试品溶液(批号：1802001)，按拟定实验方法连续进样6次，每次10μl，计算各峰的保留时间及峰面积。见表3、表4。

表3精密度特征峰保留时间考察

表4精密度考察-特征峰峰面积

结果表明，各峰保留时间的RSD值为0.16％-0.49％，峰面积的RSD为0.08％-2.75％，该仪器精密度良好。

2.5.3重复性考察

精密称取鸡骨草配方颗粒(批号：1802001)6份，按拟定实验方法进行制备及测定。见表5、表6。

表5重复性考察—特征峰相对保留时间比值

表6重复性考察—特征峰相对峰面积比值

结果表明，各特征峰相对保留时间的RSD在0.00％～0.29％，各特征峰相对峰面积的RSD在0.00％～5.78％，该方法重复性良好。

2.5.4中间精密度考察

2.5.4.1不同仪器考察

在以上拟定的实验条件基础上，分别精密称取鸡骨草配方颗粒(批号：1802001)共3份，制备供试品溶液，分别在Agilent 1260、Waters e2695-2998、岛津LC-20AD高效液相色谱仪上进行测定(色谱柱均为Agilent 5TC-C18(2)250×4.6mm5μm)。见图17，表7、表8。图17不同仪器考察结果图；

表7不同仪器考察—特征峰相对保留时间比值

表8不同仪器考察—特征峰相对峰面积比值

结果表明，用上述3种仪器对供试品进行检测时，各特征峰相对保留时间的RSD在0.00％～2.70％；各特征峰相对峰面积的RSD在0.00％～20.04％，该方法耐用性良好。

2.5.4.2不同人员和时间考察

在以上拟定的实验条件基础上，由不同人员(A、B)在不同时间(T1、T2)分别精密称取鸡骨草配方颗粒(批号：1802001)各一份，制备供试品，进行测定。见表9、表10。

表9不同人员与时间考察—特征峰相对保留时间比值

表10不同人员与时间考察—特征峰相对峰面积比值

结果表明，不同样品制备人员和不同样品制备时间条件下，各特征峰相对保留时间的RSD在0.00％～0.07％；各特征峰相对峰面积的RSD在0.00％～0.90％，该方法精密度良好。

2.5.5耐用性考察

2.5.5.1色谱柱耐用性考察在以上拟定的实验条件基础上，分别对色谱柱为InertSustain C18250×4.6mm5μm、phenomenexC18 250×4.6mm 5μm、Agilent 5TC-C18(2)250×4.6mm5μm进行考察。见图18，表11、表12。图18鸡骨草配方颗粒色谱柱耐用性考察。

表11色谱柱耐用性考察—特征峰相对保留时间

表12色谱柱耐用性考察—特征峰相对峰面积比值

结果表明，用上述3种色谱柱对样品进行检测，特征峰相对保留时间的RSD在0.00％～3.21％峰相对峰面积的RSD在0.00％～24.61％，表明该方法耐用性良好。

2.5.5.2稳定性

在以上拟定的实验条件基础上，取同一供试品溶液，分别于0h，2h，4h，9h，17h，24h时测定。见表13、表14。

表13稳定性考察—特征峰保留时间比值

表14稳定性考察—特征峰峰面积比值

结果表明，其相对应的特征峰保留时间的RSD在0.00％～0.46％，特征峰峰面积的RSD在0.00％～6.11％，该方法的稳定性良好。

综上所述，各特征峰相对保留时间的RSD在以上各项考察中均符合要求，该方法良好。将上述7个特征峰纳入后续考察。

实施例3

3.5.6特征峰的确定及对照图谱的建立

3.5.6.1 3批鸡骨草配方颗粒验证结果

采用拟定的方法对本品3批样品进行特征图谱的测定，计算相对保留时间、相对峰面积。见图19，表15-16。图19鸡骨草配方颗粒特征图谱。

表15 3批鸡骨草配方颗粒相对保留时间

表16 3批鸡骨草配方颗粒相对峰面积

根据相对保留时间稳定及各批次样品均能检出且峰相对较高的原则，共选择了7个重复性较好的峰作为特征峰。3批次鸡骨草配方颗粒7个特征峰相对保留时间RSD在0.00％～0.02％，方法学考察过程中7个特征峰相对保留时间RSD在0.00％～16.39％，说明该方法重复性好。

3.5.6.2相对保留时间规定值限度的制定

方法学各考察项目及验证结果汇总见表17：

表2方法学各项目结果RSD％汇总标准—相对保留时间

由上表可知不同色谱柱对保留时间的影响较大，为了增加方法的重现性和适用性，故将各峰的相对保留时间规定值暂定为±8％。

最终规定：供试品特征色谱中应呈现7个特征峰，其中与维采宁-2参照物相应的峰为S峰，计算各特征峰与S峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±8％范围之内。规定值为：0.308(峰1)、0.459(峰2)、0.601(峰3)、1.000(峰4，S)、1.092(峰5)、1.132(峰6)、1.245(峰7)。

采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)对3批鸡骨草配方颗粒进行合成，建立了鸡骨草配方颗粒特征图谱的对照图谱。见图20。图20为鸡骨草配方颗粒对照特征图谱。

对比例1不同流动相对比

以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(柱长为250mm，内径为4.6mm，粒度为5μm)；以0.1％甲酸或0.1％磷酸分别为流动相A，以乙腈为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；流速为每分钟1.0mL；柱温为35℃；检测波长为280nm。理论板数按维采宁-2峰计算应不低于6000。

0.1％甲酸与0.1磷酸对比结果图见图21。由图21可知，以0.1％甲酸为流动相时各色谱峰峰形、分离度均优于0.1％磷酸。

对比例2不同流动相梯度

以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(柱长为250mm，内径为4.6mm，粒度为5μm)；以0.1％甲酸为流动相A，以乙腈为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；流速为每分钟1.0mL；柱温为35℃；检测波长为280nm。理论板数按维采宁-2峰计算应不低于6000。

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图见22，由图22可知，在21～22min时，有机相比例从85→80；22～50分钟时，有机相比例从80→80，在该流动相比例中，相较与较优方法，有机相比例减小，致使25分钟至30分钟所有峰均分离度变差。故拟定的色谱条件为最佳色谱条件。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。