一种降解苯胺黑药的伯克霍尔德菌及其生物炭-降解菌制剂和应用

技术领域

本发明涉及微生物菌剂技术领域，具体地，涉及一种降解苯胺黑药的伯克霍尔德菌及其生物炭-降解菌制剂和应用。

背景技术

泡沫浮选工艺被广泛地应用于加工矿石以富集其中有价值的矿物质。随着全球对金属需求的不断增加，每年通过泡沫浮选来处理超过20亿吨的矿石，并且产生了大量含有残留浮选试剂的浮选废水。据报道，每年在中国产生超过12亿立方米的浮选废水。苯胺黑药作为一个良好的捕收剂被广泛用于分离、提取选矿过程中有价值的金属。但是，在浮选过程中不能完全消耗苯胺黑药，残留的苯胺黑药随着废水被排出。而且现有的技术没有办法经济、大规模地实现对废水的重复使用。最终，这些含有苯胺黑药的选矿废水大部分都几乎没有经过处理便直接排放到的天然水域中。这给矿山周边生态环境带来了巨大的破坏。

苯胺黑药是一种具有苯胺和二硫代磷酸基团的生物持久性浮选捕收剂，最近的研究表明，在许多环境介质中均发现了苯胺黑药的存在，包括废水，地表水，灌溉水，土壤和市政污泥。更为严重的是，当废水中的残留的苯胺黑药进入天然水体后，在光，氧气，高温和微生物的作用下，很容易分解成苯胺和二硫代磷酸盐。苯胺具有剧毒，能对动物的肝脏造成严重损害。二硫代磷酸盐可以通过非特异性抑制神经系统中乙酰胆碱酯酶的非特异性抑制导致对生物的毒性。因此苯胺和二硫代磷酸盐都比苯胺黑药更具毒性，最终会危害到人类的身体健康。因此，展开对选矿废水有效处理的研究非常重要。

目前，已经开发出了多种水处理技术(例如物理吸附，化学氧化和生物降解)来去污染物。但是到目前为止，对处理废水中的苯胺黑药研究很少，尤其是微生物固定化菌剂方法降解的研究。高成本和二次污染限制了物理和化学处理方法的应用。生物降解不仅可以选择性地从废水中消除苯胺黑药，而且微生物代谢和繁殖速度均较快，能够自我更新，进而提高废水处理效率，降低维护成本，是一种很经济实惠的方法。利用能降解苯胺黑药的主要菌株的生物学过程降解苯胺黑药是理想的技术。然而废水中不仅含有苯胺黑药还可能还有大量的重金属，当重金属的含量达到一定浓度时能够产生毒害和致死作用，复杂废水环境影响降解菌株的存活率和降解性能。还有较长的降解反应时间(相对于物理和化学法)，均令生物降解在处理浮选废水方面存在局限性。

固定化微生物技术，是一种通过将微生物固定在载体的表面上，为微生物提供庇护场所以应对复杂环境，还可吸附固定污染物，从而为微生物提供有效的污染物的降解环境。固定化微生物技术能够提高微生物密度和活性，加快反应速度，为微生物提供稳定的附着环境，使微生物对环境影响更好的抵抗力。近年来，生物炭被认为是微生物的理想载体，其特异性表面体积，孔径和良好的可吸收性。例如：Zhao等人报道，生物炭作为Pseudomonascitronellolis的同时庇护所，吸附剂，pH缓冲液和底物，以促进废水中高浓度的苯酚的生物降解(Zhao,L.,Xiao,D.,Liu,Y.,Xu,H.,Nan,H.,Li,D.,...&Cao,X.(2020).Biochar assimultaneous shelter,adsorbent,pH buffer,and substrate of Pseudomonas citronellolis to promote biodegradation of high concentrations of phenol inwastewater.Water Research,172,115494.)。

综上所述，现阶段迫切需要一种能够高效降解苯胺黑药的微生物，同时找到适合固定所述微生物的载体材料，以提高微生物的降解活性。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的上述不足，提供一种降解苯胺黑药的伯克霍尔德菌及其生物炭-降解菌制剂和应用。

本发明的第一个目的是提供一种伯克霍尔德菌(Burkholderia sp.)WX-6。

本发明的第二个目的是提供所述伯克霍尔德菌(Burkholderia sp.)WX-6在降解黑药类化合物和/或制备降解黑药类化合物的生物制剂中的应用。

本发明的第三个目的是提供所述伯克霍尔德菌(Burkholderia sp.)WX-6在降解苯胺和/或邻苯二酚，和/或制备降解苯胺和/或邻苯二酚的生物制剂中的应用。

本发明的第四个目的是提供一种生物制剂。

本发明的第五个目的是提供所述的生物制剂在降解黑药类化合物和/或制备降解黑药类化合物的生物制剂中的应用。

本发明的第六个目的是提供所述的生物制剂在降解苯胺和/或邻苯二酚，和/或制备降解苯胺和/或邻苯二酚的生物制剂中的应用。

本发明的第七个目的是提供一种降解黑药类化合物和/或黑药类化合物降解的中间产物的方法。

为了实现上述目的，本发明是通过以下方案予以实现的：

一种伯克霍尔德菌(Burkholderia sp.)WX-6，所述伯克霍尔德菌(Burkholderiasp.)WX-6已于2022年8月23日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，其保藏号为GDMCC No：62722。

所述伯克霍尔德菌(Burkholderia sp.)WX-6在降解黑药类化合物和/或制备降解黑药类化合物的生物制剂中的应用。

优选地，所述黑药类化合物为苯胺黑药、25号黑药和丁钠黑药中的一种或多种。

所述伯克霍尔德菌(Burkholderia sp.)WX-6在降解苯胺和/或邻苯二酚，和/或制备降解苯胺和/或邻苯二酚的生物制剂中的应用。

一种生物制剂，所述生物制剂中含有所述的伯克霍尔德菌(Burkholderia sp.)WX-6。

优选地，所述生物制剂中还含有生物炭。

优选地，所述生物制剂的制备方法为：

S1：将所述伯克霍尔德菌(Burkholderia sp.)WX-6接入LB培养基中，接菌量OD

S2：将生物炭与步骤S1的重悬菌体液混匀，生物炭与重悬菌体液的比值为3.8～4.2：1，得菌体生物炭混合物；

S3：用戊二醛固定液与步骤S2的菌体生物炭混合物充分混匀，固定，用乙醇缩水，冷冻干燥得生物炭-降解菌制剂。

优选地，步骤S1所述LB培养基的含量为49.8～50.2mL，用4.8～5.2mL灭菌生理盐水重悬菌体。

更优选地，步骤S1所述LB培养基的含量为50mL，用5mL灭菌生理盐水重悬菌体。

优选地，步骤S3戊二醛固定液与步骤S2的菌体生物炭混合物的比值为0.9～1.1mL：1g，所述戊二醛固定液中戊二醛的体积浓度为2.4～2.6％。

更优选地，步骤S3戊二醛固定液与步骤S2的菌体生物炭混合物的比值为1mL：1g，所述戊二醛固定液中戊二醛的体积浓度为2.5％。

优选地，步骤S3所述固定条件为3.8～4.2℃静置4～16h。

更优选地，步骤S3所述固定条件为4℃静置4h。

优选地，步骤S3所述乙醇缩水中乙醇的梯度体积浓度依次为30％、50％、70％、80％、90％和100％。

更优选地，用体积浓度为30％、50％、70％、80％和90％的乙醇缩水一次，用体积浓度为100％的乙醇缩水两次，每次静置14～16min，其中体积浓度为70％的乙醇缩水后静置14～16h。

更优选地，每次乙醇缩水静置15min。

所述的生物制剂在降解黑药类化合物和/或制备降解黑药类化合物的生物制剂中的应用。

优选地，所述黑药类化合物为苯胺黑药、25号黑药和丁钠黑药中的一种或多种。

所述的生物制剂在降解苯胺和/或邻苯二酚，和/或制备降解苯胺和/或邻苯二酚的生物制剂中的应用。

一种降解黑药类化合物、苯胺和/或邻苯二酚的方法，用所述的伯克霍尔德菌(Burkholderia sp.)WX-6或权利要求5或6所述的生物制剂进行降解。

优选地，所述黑药类化合物为苯胺黑药、25号黑药和丁钠黑药中的一种或多种。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明公开了一种降解苯胺黑药的伯克霍尔德菌及其生物炭-降解菌制剂和应用。本发明的伯克霍尔德菌(Burkholderia sp.)WX-6已于2022年8月23日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，其保藏号为GDMCC No：62722。所述伯克霍尔德菌(Burkholderia sp.)WX-6与固定化载体如生物炭等混合制备成菌剂后，WX-6菌株在固定化载体如生物炭等内部及表面附着生长。

一方面本发明的菌剂富集了WX-6菌株在污染废水中的密度，减弱外界环境包括重金属离子对功能菌株的不利影响，为WX-6菌株提供稳定的生长环境，有利于WX-6菌株在废水中存活，提高对重金属废水的治理效果，增强其对目标污染物的降解去除效果。

另一方面，固定化载体如生物炭，具有一定比表面积，将污染重金属废水中苯胺黑药物质定向吸附于表面，促进污染物的定向迁移，增强WX-6菌株与污染物之间的界面接触，提升污染物的降解去除效果。

WX-6菌株与固定化载体如生物炭等混合制备成菌剂后，处理不含重金属离子的中性和碱性苯胺黑药模拟废水中96h后的去除率达分别达89.7％和88.8％，处理含高浓度单一(100mg/L Cu

WX-6菌株是从苯胺黑药污染的矿山采集的活性污泥中中富集培养获得，WX-6菌株活力高，对苯胺黑药降解能力强，生长速度快，培养方法简单，不易变异。

附图说明

图1为伯克霍尔德菌(Burkholderia sp.)WX-6的形态特征图片。其中A为伯克霍尔德菌(Burkholderia sp.)WX-6在LB平板上的菌落形态特征图片，B为伯克霍尔德菌(Burkholderia sp.)WX-6的扫描电镜图片。

图2为伯克霍尔德菌(Burkholderia sp.)WX-6系统进化树。

图3为伯克霍尔德菌(Burkholderia sp.)WX-6降解苯胺黑药的影响因素分析。其中A为温度对伯克霍尔德菌(Burkholderia sp.)WX-6降解苯胺黑药的影响；B为pH对伯克霍尔德菌(Burkholderia sp.)WX-6降解苯胺黑药的影响；C为接种量对伯克霍尔德菌(Burkholderia sp.)WX-6降解苯胺黑药的影响；D为盐度(NaCl)对伯克霍尔德菌(Burkholderia sp.)WX-6降解苯胺黑药的影响。

图4为响应曲面法的实验结果。其中A为伯克霍尔德菌(Burkholderia sp.)WX-6对苯胺黑药降解率与温度和pH的响应分析曲面，B为伯克霍尔德菌(Burkholderia sp.)WX-6对苯胺黑药降解率与温度和pH的等高线。

图5为伯克霍尔德菌(Burkholderia sp.)WX-6对不同初始浓度苯胺黑药的降解动力学曲线。

图6为苯胺黑药降解产物的质谱图。其中A为苯胺的质谱图，B为邻苯二酚的质谱图。

图7为伯克霍尔德菌(Burkholderia sp.)WX-6的苯胺双加氧酶和邻苯二酚1，2-双加氧酶基因扩增片段的电泳鉴定。

图8为伯克霍尔德菌(Burkholderia sp.)WX-6降解苯胺黑药途径。

图9为生物炭固菌前后扫描电镜图。其中A为固菌前生物炭的电镜图，B为生物炭固定伯克霍尔德菌(Burkholderia sp.)WX-6后的电镜图片。

图10为在不同类型的废水中，伯克霍尔德菌(Burkholderia sp.)WX-6和生物炭-降解菌制剂对苯胺黑药的去除效率。其中A为pH 7.0的模拟废水，B为pH9.0的模拟废水，C为含有Cu

图11为在含有Cu

具体实施方式

下面结合说明书附图及具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。所述矿山污泥样品来源于广西省南丹县拉甲坡矿区和芒场矿区的土壤和尾矿污泥。

实施例1菌株的分离与鉴定

一、实验方法

1、富集驯化菌株

向100mL已灭菌的MSM培养基中加入苯胺黑药，使苯胺黑药终浓度为50mg/L，并加入矿山污泥样品5g，于摇床(30℃、150rpm)培养7d后，以5％接种量转接至到相同的新MSM培养基中，连续转接5次，培养基中苯胺黑药浓度每转接一次增加一倍，最终将苯胺黑药浓度提至1000mg/L。取最终的培养液在固体LB平板上划线分离出单菌落，并保存单菌落于4℃冰箱。

2、利用通用引物F27(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)和R1492(5’-ACGGHTACCTTGTTTACGAC TT-3’)扩增上述分离的菌株的16S rDNA片段，PCR反应条件为：95℃初始预热5min；熔断94℃45s，退火55℃45s，延伸72℃1min 15s，循环32次，最后72℃保持10min。

3、将扩增产物纯化并回收测序，获得菌株的16S rDNA序列，所述16S rDNA的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。将16S rDNA序列提交至GenBank数据库中，并利用BLAST进行比对分析，用ClustalX软件对匹配度高的相关序列进行同源性分析。采用MEGA 5.0软件中的邻接法(Neighborhood-joining)进行关系分析和构建菌株的系统进化树。

二、实验结果

分离出的菌株被命名为WX-6(下文称为菌株WX-6)，在LB琼脂上培养3天的菌株WX-6菌落呈圆形、透明、凸起、棕黄色。(图1A)

经16S rDNA测序，鉴定菌株WX-6为Burkholderia sp.，经扫描电镜观察显示为直或微弯曲杆菌，单个或成对排列(图1B)。

系统进化树分析表明菌株WX-6与Burkholderia stagnalis strain LMG 28156亲缘关系较近，属于Burkholderia菌属(图2)。

将所述菌株WX-6菌株命名为：伯克霍尔德菌(Burkholderia sp.)WX-6，并于2022年8月23日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，其保藏号为：GDMCCNo：62722，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。

实施例2伯克霍尔德菌(Burkholderia sp.)WX-6对苯胺黑药的降解影响因素分析

一、实验方法

1、伯克霍尔德菌(Burkholderia sp.)WX-6对苯胺黑药的降解条件

(1)制备伯克霍尔德菌(Burkholderia sp.)WX-6菌悬液

挑取实施例1的伯克霍尔德菌(Burkholderia sp.)WX-6单菌落于LB培养基中培养过夜(14～16h)，后离心去上清，用0.9％生理盐水冲洗三次后重悬，作为种子菌悬液。降解测定时，除无特殊说明外，都以OD

(2)温度对菌株降解苯胺黑药的影响

向装有100mL的灭菌MSM培养基的三角瓶中，添加苯胺黑药，使其浓度为300mg/L，接种伯克霍尔德菌(Burkholderia sp.)WX-6菌悬液，接菌量为0.6(OD

(3)pH对降解菌株降解苯胺黑药的影响

将配制好的MSM培养基，以每瓶100mL MSM培养基的量，分瓶至5个250mL培养瓶中。用pH计测量pH值，用1M HCl和1M NaOH将培养基的pH值分别调至5.0、6.0、7.0、8.0和9.0后，高温高压灭菌。向灭菌的培养基中加入苯胺黑药，使苯胺黑药浓度为300mg/L。接种伯克霍尔德菌(Burkholderia sp.)WX-6菌悬液，接菌量为0.6(OD

(4)接菌量对菌株WX-6降解苯胺黑药的影响

接菌量按0.2、0.4、0.6、0.8和1.0(OD

(5)盐度对菌株降解苯胺黑药的影响

将NaCl加入装有100mL灭菌MSM培养基的250mL培养瓶中(pH 7.0)，使培养基盐度分别为0.0％、1.0％、2.0％、3.0％、4.0％和5.0％；同时加入苯胺黑药作为生长基质，使苯胺黑药终浓度为300mg/L；接种伯克霍尔德菌(Burkholderia sp.)WX-6菌悬液，接菌量为0.6(OD

(6)根据本实施例步骤(2)～(4)的实验结果，用设计pH、温度和接种量的组合条件，确定伯克霍尔德菌(Burkholderia sp.)WX-6降解苯胺黑药的最优降解条件。

用响应曲面法将pH、温度和接种量三个因素对菌株降解AAF能力的影响进行优化。以pH(X1)、温度(X2)和接种量(X3)为自变量，并以-1、0、1表示自变量的3水平，以菌株在第3d对300mg/L的苯胺黑药的降解率为响应值(Y)，通过响应曲面法确定菌株降解苯胺黑药的最佳组合条件。各因素水平编码见表1。

表1基于Box-Behnken设计实验因素水平及编码

(7)重金属离子对菌株生长的影响

选矿废水中含有Cu

实验方法：

1)分别称取1.6g Pb(NO

2)用移液枪吸取0.1mL、0.5mL、1.0mL、2.0mL、3.0mL、4.0mL和5.0mL Cu

二、实验结果

1、如图3A所示，在20～40℃范围内，伯克霍尔德菌(Burkholderia sp.)WX-6对苯胺黑药的降解率高于60％。

2、如图3B所示，伯克霍尔德菌(Burkholderia sp.)WX-6降解苯胺黑药的pH范围较广，在pH 6～9范围内保持80％以上的降解效率。

3、如图3C所示，3天内不同接种量的WX-6对MSM培养基中的苯胺黑药的降解率达81.56～86.52％。当接种量为0.6(OD

4、如图3D所示，伯克霍尔德菌(Burkholderia sp.)WX-6耐受一定的盐度，在盐度低于2％时保持80％以上的降解率，但当盐度高于3％时，其降解效率迅速下降，低于20％。

5、经Box-Behnken设计，得到伯克霍尔德菌(Burkholderia sp.)WX-6的降解条件实验设计及经实验后获得实验结果(见表2)。

表2Box-Behnken设计实验及结果

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注：表中X1为pH的编码值；X2为温度的编码值；X3为接菌量的编码值。以上结果为3次重复平均值±标准误。表中同列数据后标有相同字母者表示在5％水平差异不显著。

拟合得到苯胺黑药降解率(Yi)的模型方程，通过模型显著性和方差分析，评价模型的可靠性。最后按照最优降解条件的理论值培养降解菌株，以降解率为衡量评价指标，验证模型结论可靠性(表3)。模型方程如下：

表3模型方程显著性和方差分析

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R

统计分析结果显示其决定系数(R

为了使各因素及其交互影响能有效地直观反映，用Design-Expert 8.0软件绘制响应曲面如图4所示。根据方程，固定接菌量为0.6(OD

对模拟所得降解最优条件(温度33℃，pH 7.6，接菌量0.6(OD

综上，伯克霍尔德菌(Burkholderia sp.)WX-6降解苯胺黑药的最优条件为温度33℃，pH 7.60，接菌量0.6(OD

6、重金属离子如Cu离子在浓度≥100mg/L对伯克霍尔德菌(Burkholderiasp.)WX-6降解苯胺黑药有明显抑制效应(表4)。

表4不同重金属离子的最小抑制浓度

实施例3伯克霍尔德菌(Burkholderia sp.)WX-6对苯胺黑药的降解动力学

一、实验方法

分别向100mL的灭菌MSM培养基中添加不同量的苯胺黑药，使苯胺黑药终浓度分别为100、300、600和1000mg/L，接种实施例2的伯克霍尔德菌(Burkholderia sp.)WX-6菌悬液，接菌量为OD

二、实验结果

由图5可知，在MSM培养基中，苯胺黑药终浓度为100～1000mg/L的范围内，伯克霍尔德菌(Burkholderia sp.)WX-6都充分利用苯胺黑药作为唯一碳源和能源生长。说明伯克霍尔德菌(Burkholderia sp.)WX-6还耐受更大浓度的苯胺黑药。整体而言，伯克霍尔德菌(Burkholderia sp.)WX-6对苯胺黑药的降解率随苯胺黑药初始浓度的增加而下降，表明高浓度的苯胺黑药对菌株WX6的生长具有抑制作用。

如表5所示，为根据降解动力学拟合模型与半衰期模型拟合得出不同苯胺黑药初始浓度，伯克霍尔德菌(Burkholderia sp.)WX-6对其降解动力学方程与半衰期结果。伯克霍尔德菌(Burkholderia sp.)WX-6对苯胺黑药降解半衰期与底物浓度呈正相关关系，100、300、600和1000mg/L苯胺黑药对应的半衰期分别是16.39h、18.73h、31.11h和35.55h。伯克霍尔德菌(Burkholderia sp.)WX-6降解苯胺黑药初始浓度范围较宽、降解半衰期较短，苯胺黑药耐受性和降解效率都较高。

表5不同初始浓度苯胺黑药的降解动力学参数

实施例4测定伯克霍尔德菌(Burkholderia sp.)WX-6的底物广谱性

一、实验方法

测试底物为25号黑药、丁钠黑药、苯胺和邻苯二酚，其中25号黑药和丁钠黑药属于黑药类化合物，苯胺和邻苯二酚是苯胺黑药生物降解过程中可能产生的中间产物。

在灭菌的基础MSM培养基中分别加入这些测试底物，使其终浓度各为300mg/L，并接入新鲜的实施例2的伯克霍尔德菌(Burkholderia sp.)WX-6菌悬液，在实施例2确定的最优降解条件(温度33℃，pH 7.6，接菌量0.6(OD

二、实验结果

表6表明伯克霍尔德菌(Burkholderia sp.)WX-6很好地利用25号黑药和丁钠黑药作为唯一的碳源和能源，同时还利用苯胺黑药降解中间体苯胺和邻苯二酚，表明伯克霍尔德菌(Burkholderia sp.)WX-6底物利用能力广泛，对苯胺黑药能够进一步降解，用于修复受苯胺黑药污染的环境。

表6伯克霍尔德菌(Burkholderia sp.)WX-6的底物广谱性

实施例5苯胺黑药降解产物的鉴定及降解途径分析

一、实验方法

将实施例2的伯克霍尔德菌(Burkholderia sp.)WX-6菌悬液接种到装有100mL灭菌的液体MSM培养基的250mL三角瓶中，并添加苯胺黑药使其终浓度为300ppm，在实施例2确定的最优降解条件(温度33℃，pH 7.6，接菌量0.6(OD

降解途径分析：通过LC-MS测定苯胺黑药在不同时间段的降解产物，结合图谱分析和底物利用情况，推测伯克霍尔德菌(Burkholderia sp.)WX-6对苯胺黑药的降解途径。

参照NCBI上已报道的苯胺双加氧酶基因的核苷酸序列(Accessionnumber.D86080)，设计了一对简并引物对伯克霍尔德菌(Burkholderia sp.)WX-6的苯胺双加氧酶基因进行PCR扩增，PCR反应体系如下：

目的菌液：2μL，引物各1μL，Taq酶12.5μL，加无菌去离子水补齐50μL。PCR扩增程序为：95℃4min；95℃解链30s；55℃退火30s；72℃延伸1min；共29个循环；72℃延伸10min，4℃保存。

为了阐明伯克霍尔德菌(Burkholderia sp.)WX-6对苯胺黑药的降解途径，用LC-TOF-MS/MS鉴定分析待测液中的中间产物。

二、实验结果

由二级质谱图可知，伯克霍尔德菌(Burkholderia sp.)WX-6降解苯胺黑药的产物中存在苯胺(图6A)、邻苯二酚两种物质(图6B)。

通过同源克隆获得了苯胺双加氧酶基因(图7)，综合分析推测伯克霍尔德菌(Burkholderia sp.)WX-6对苯胺黑药的降解途径如图8所示，苯胺黑药首先降解为苯胺，然后在苯胺双加氧酶的作用下生成邻苯二酚，最后经过邻苯二酚1,2-双加氧酶开环进入三羧酸循环。

实施例6制备生物炭-降解菌制剂

一、实验方法

挑取实施例1伯克霍尔德菌(Burkholderia sp.)WX-6的单菌落，将其接入50mL LB培养基中，接菌量0.6(OD

称取20g生物炭加入到灭菌的三角瓶中，倒入重悬菌体，混匀，作为后续实验样品用。

取1g上述实验样品，用生理盐水冲洗2次，加入1mL 2.5％的戊二醛固定液充分混匀，4℃静置4h(时间尽量延长或过夜(14～16h))固定；用生理盐水清洗3次后，进行乙醇梯度缩水，即分别加入30％、50％、70％、80％和90％(v/v)的乙醇各一次，100％乙醇两次，每次静置15min，离心去除上清(70％的乙醇脱水后，过夜(14～16h)，第二天继续梯度脱水)，冷冻干燥得生物炭-降解菌制剂，用扫描电镜观察。

二、实验结果

如图9所示，固菌前(图9A)，生物炭表面不光滑，具有不规则褶皱和缝隙；固菌后(图9B)，生物炭表面形态无明显变化，伯克霍尔德菌(Burkholderiasp.)WX-6被捕获于生物炭表面的褶皱和缝隙中；在高倍电镜下，生物炭表面伯克霍尔德菌(Burkholderia sp.)WX-6形态清晰可见，并未发生明显变化且含量丰富，表明生物炭固菌能力显著。

实施例7降解菌制剂的实际修复效果

一、实验方法

废水中苯胺黑药浓度大致在150～350mg/L范围内，废水通常呈碱性。根据实际情况开展实验，在之后的实验中用固定化微生物对模拟废水进行处理，通过模拟实验确定基础数据，为实际场合的应用打下来一些科学的基础。

分别称取1.6g Pb(NO

每升原始模拟废水的配方如下：300mg苯胺黑药、1000mg KH

对原始模拟废水的pH和金属离子含量进行调整，得到4种废水：

1、废水pH值为7。

2、废水pH值为9。

3、在模拟废水中添加Cu

4、在模拟废水中添加100mg/L Cu离子，其他条件与本实施例第3种废水相同。

用上述4种废水分别设置3个实验组，以比较生物炭、实施例2的伯克霍尔德菌(Burkholderia sp.)WX-6和实施例6的生物炭-降解菌制剂对苯胺黑药的处理效果。

第一组：加入2g生物炭吸附苯胺黑药；

第二组：加入1mL实施例2的伯克霍尔德菌(Burkholderia sp.)WX-6菌悬液，接菌量为0.6(OD

第三组：加入2g实施例6的生物炭-降解菌制剂，降解苯胺黑药。

将各组放入恒温震荡培养箱中，温度设置为33℃，定时取样，对样品进行过滤处理，用紫外分光光度计对溶液中剩余的苯胺黑药进行测定，用酸性高锰酸钾法测定水中的化学耗氧量(COD)。

二、实验结果

1、由图10A可知：0～24h，苯胺黑药降解效率从高到低依次为：生物炭>生物炭-降解菌制剂>单菌(实施例2的伯克霍尔德菌(Burkholderia sp.)WX-6)>CK；24h后，生物炭-降解菌制剂和单菌先后超过了生物炭，生物炭在48h后的吸附固定达到饱和，整个实验周期中生物炭-降解菌制剂的降解能力最强，单菌次之。单菌对不含重金属离子的中性废水(pH7.0)中的苯胺黑药处理6h、12h、24h、36h、48h、72h和96h后的去除率分别达1.8％、9.69％、15.76％、66.41％、74.01％、80.33％和83.67％。生物炭-降解菌制剂对不含重金属离子的中性废水(pH 7.0)中的苯胺黑药处理96h后的去除率达89.7％。

由图10B可知：受强碱环境的影响，48h内生物炭-降解菌制剂和单菌对苯胺黑药的降解率与中性环境相比，呈下降趋势，但不显著。实施例2的伯克霍尔德菌(Burkholderiasp.)WX-6具有较强的碱性耐受能力，这是导致强碱环境对菌悬液降解苯胺黑药影响小的原因。单菌对不含重金属离子的碱性废水(pH 9.0)中的苯胺黑药处理6h、12h、24h、36h、48h、72h和96h后的去除率分别达0.43％、8.95％、7.42％、54.67％、66.41％、74.01％和77.99％。生物炭-降解菌制剂对不含重金属离子的碱性废水(pH 9.0)中的苯胺黑药处理96h后的去除率达88.8％。

由图10C和图10D可知：高浓度的单一Cu离子和混合重金属离子(Cu

2、如图11A所示，在含有单一Cu离子的废水中，60h内，单菌、生物炭-降解菌制剂和生物炭对废水COD的去除效率无显著差异，但是生物炭-降解菌制剂在84h的实验时间内一直保持高的COD去除速度。相反，单菌和生物炭在60h和72h的去除速度先后降低。96h后，各对废水COD的去除效率从高到低依次为：生物炭-降解菌制剂>生物炭>单菌；如图11B所示，高浓度的混合重金属离子存在下，生物炭-降解菌制剂和单菌对COD的去除能力均得到减弱，其中单菌的去除能力下降最为显著，生物炭-降解菌制剂的能力下降较少，故生物炭-降解菌制剂对COD的去除能力得到了凸显。生物炭-降解菌制剂对含Cu离子的废水处理96h和含混合重金属离子(Cu

综上，单独接种伯克霍尔德菌(Burkholderia sp.)WX-6、单独添加生物炭及添加生物炭-降解菌制剂都不同程度地促进了模拟废水中苯胺黑药和COD的去除，其中添加生物炭-降解菌制剂的效果最佳。

鉴于此，生物炭-降解菌制剂对苯胺黑药的去除机理为生物炭首先通过吸附作用与溶液中一部分的苯胺黑药和重金属离子结合，因此降低了溶液中的苯胺黑药浓度，减少重金属离子毒害，从而间接地提高了伯克霍尔德菌(Burkholderia sp.)WX-6对毒性重金属离子的抗性，让伯克霍尔德菌(Burkholderia sp.)WX-6得以生长及繁衍，然后通过伯克霍尔德菌(Burkholderia sp.)WX-6在溶液中对苯胺黑药的降解作用，进一步去除苯胺黑药。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，对于本领域的普通技术人员来说，在上述说明及思路的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。