用于精神类药物基因多种SNP位点检测的核酸组合物、试剂盒和非诊断方法

技术领域

本公开涉及基因多态性检测技术领域，特别涉及一种用于精神类药物基因多种SNP位点检测的核酸组合物、试剂盒和非诊断方法。

背景技术

目前，精神疾病的主要干预手段是药物治疗，对于临床医生来说如何合理地选择药物、剂量调整、临床监测以及合理地控制不良反应显得尤为重要。

在个体化治疗过程中，通过对每个患者的特定基因信息进行分析，可以辅助医师在第一时间内确定相应的治疗方案，在提高治疗效率、减少药物毒副作用的同时，可以很大程度上避免方案的重叠，节省患者的宝贵时间，减少巨大的医疗开支。以药物基因组学和药物遗传学为基础，通过先进的分子病理检测手段，检测患者的基因多态性和基因表达水平，并在分子水平上指导临床医生为患者量身打造个体化用药方案。所有检测基因均来源于FDA、NMPA、PharmGKB、CPIC等权威指南、相关数据库和专业文献。

近年来，美国FDA批准的药品说明书中，已有多种精神科药物标注了药物基因组学信息，如抗抑郁药西酞普兰的主要代谢酶CYP2C19和CYP2D6。药物疗效方面，氯氮平、利培酮等药物的疗效个体差异可能与基因位点有关，阳性和阴性症状疗效也可能与某些基因位点有关。因此，根据相关基因检测进行个体化治疗，对提高药物在精神科患者的临床疗效起到积极作用。此外，肝细胞色素P450不同酶的不同强度的代谢者，治疗剂量有所不同。基因多态性对药物血药浓度及临床疗效都有影响，可根据不同位点基因多态性为药物的个体化治疗提供依据，例如快代谢型患者可加大初始剂量，若加大初始剂量仍不能达到有效治疗浓度应考虑换药。而另一些慢代谢患者，只服用较低的剂量就能达到治疗参考浓度范围，避免了大剂量用药造成的药物不良反应。因此，精神类药物在使用时应该考虑药物基因多态性的影响。

综上上述，目前亟需一种用于精神类药物基因多种SNP位点检测的核酸组合物。

发明内容

本公开的主要目的在于提供一种用于精神类药物基因多种SNP位点检测的核酸组合物、试剂盒和非诊断方法，以克服现有技术中的不足。

为了实现上述目的，本公开采用了以下的技术方案：

本公开提供了一种用于精神类药物基因多种SNP位点检测的核酸组合物，上述核酸组合物包括引物探针组合1-引物探针组合10中的任意一种或两种以上的组合；

上述引物探针组合1包括SEQ ID NO.1所示的上游引物，SEQ ID NO.2所示的下游引物，SEQ ID NO.3所示的野生型探针，SEQ ID NO.4所示的突变型探针；

上述引物探针组合2包括SEQ ID NO.5所示的上游引物，SEQ ID NO.6所示的下游引物，SEQ ID NO.7所示的野生型探针，SEQ ID NO.8所示的突变型探针；

上述引物探针组合3包括SEQ ID NO.9所示的上游引物，SEQ ID NO.10所示的下游引物，SEQ ID NO.11所示的野生型探针，SEQ ID NO.12所示的突变型探针；

上述引物探针组合4包括SEQ ID NO.13所示的上游引物，SEQ ID NO.14所示的下游引物，SEQ ID NO.15所示的野生型探针，SEQ ID NO.16所示的突变型探针；

上述引物探针组合5包括SEQ ID NO.17所示的上游引物，SEQ ID NO.18所示的下游引物，SEQ ID NO.19所示的野生型探针，SEQ ID NO.20所示的突变型探针；

上述引物探针组合6包括SEQ ID NO.21所示的上游引物，SEQ ID NO.22所示的下游引物，SEQ ID NO.23所示的野生型探针，SEQ ID NO.24所示的突变型探针；

上述引物探针组合7包括SEQ ID NO.25所示的上游引物，SEQ ID NO.26所示的下游引物，SEQ ID NO.27所示的野生型探针，SEQ ID NO.28所示的突变型探针；

上述引物探针组合8包括SEQ ID NO.29所示的上游引物，SEQ ID NO.30所示的下游引物，SEQ ID NO.31所示的野生型探针，SEQ ID NO.32所示的突变型探针；

上述引物探针组合9包括SEQ ID NO.33所示的上游引物，SEQ ID NO.34所示的下游引物，SEQ ID NO.35所示的野生型探针，SEQ ID NO.36所示的突变型探针；

上述引物探针组合10包括SEQ ID NO.37所示的上游引物，SEQ ID NO.38所示的下游引物，SEQ ID NO.39所示的野生型探针，SEQ ID NO.40所示的突变型探针。

在一种实施方式中，上述SNP分别选自rs4244285、rs4986893、rs12248560、rs16947、rs5030865、rs1065852、rs1800497、rs1799978、rs489693、rs1414334。

本公开还提供了一种用于精神类药物基因多种SNP位点检测的试剂盒，包括如上所述的核酸组合物。

在一种实施方式中，还包括PCR缓冲液、dNTPs和Taq DNA聚合酶。

本公开还提供了一种用于精神类药物基因多种SNP位点检测的非诊断方法，包括以下步骤：

S1、提取样本DNA；

S2、将样本DNA、阴性对照、阳性对照分别加入装有上述核酸组合物的PCR反应管中，将PCR反应管放入PCR仪中进行PCR扩增；

S3、采集PCR扩增过程中的荧光信号，对上述样本DNA进行检测结果分析。

在一种实施方式中，上述PCR扩增的条件为95℃预变性5min，进行1个循环；95℃变性10s，60℃退火45s，进行40个循环。

在一种实施方式中，将PCR反应管放入PCR仪前置于温度为2-8℃的环境中保存。

在一种实施方式中，上述PCR扩增时采集荧光信号的荧光通道包括FAM通道、VIC通道、ROX通道。

本公开还提供了一种如上任一所述的核酸组合物在人全血样本中精神类相关药物基因多态性定性检测中的应用。

在一种实施方式中，上述精神类相关药物包括奥氮平、氯氮平、利培酮、阿立哌唑、三环类抗抑郁药、米氮平、度洛西汀、托莫西汀、喹硫平、帕利哌酮、氟哌啶醇、氨磺必利和齐拉西酮。

本公开提供的上述技术方案的有益效果至少包括：本公开的一种用于精神类药物基因多种SNP位点检测的核酸组合物、试剂盒和非诊断方法，采用聚合酶链式反应(PCR)结合Taqman-MGB探针技术通过10个引物探针组合对精神类药物基因的多种SNP位点进行检测，通过PCR扩增过程中检测相应通道的荧光信号对样本中的信号强度进行实时监测和输出，实现检测结果的定性分析，从而可以针对性的制定用药方案，为个体化用药提供更为精准的参考。

附图说明

为了更清楚地说明本公开实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简要介绍。通过阅读参照以下附图所作的对非限制性实施例的详细描述，本公开的其它特征、目的和优点将会变得更明显。

图1为本公开实施例提供的纯和野生型扩增图谱示例；

图2为本公开实施例提供的杂合突变型扩增图谱示例；

图3为本公开实施例提供的纯和突变型扩增图谱示例。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本公开进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本公开，而不是为了限制本公开的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本公开的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

本公开提供了一种用于精神类药物基因多种SNP位点检测的核酸组合物，上述核酸组合物包括引物探针组合1-引物探针组合10中的任意一种或两种以上的组合；

针对CYP2C19基因rs4244285的引物探针组合1包括SEQ ID NO.1所示的上游引物，SEQ ID NO.2所示的下游引物，SEQ ID NO.3所示的野生型探针，SEQ ID NO.4所示的突变型探针；

针对CYP2C19基因rs4986893的引物探针组合2包括SEQ ID NO.5所示的上游引物，SEQ ID NO.6所示的下游引物，SEQ ID NO.7所示的野生型探针，SEQ ID NO.8所示的突变型探针；

针对CYP2C19基因rs12248560的引物探针组合3包括SEQ ID NO.9所示的上游引物，SEQ ID NO.10所示的下游引物，SEQ ID NO.11所示的野生型探针，SEQ ID NO.12所示的突变型探针；

针对CYP2D6基因rs16947的引物探针组合4包括SEQ ID NO.13所示的上游引物，SEQ ID NO.14所示的下游引物，SEQ ID NO.15所示的野生型探针，SEQ ID NO.16所示的突变型探针；

针对CYP2D6基因rs5030865的引物探针组合5包括SEQ ID NO.17所示的上游引物，SEQ ID NO.18所示的下游引物，SEQ ID NO.19所示的野生型探针，SEQ ID NO.20所示的突变型探针；

针对CYP2D6基因rs1065852的引物探针组合6包括SEQ ID NO.21所示的上游引物，SEQ ID NO.22所示的下游引物，SEQ ID NO.23所示的野生型探针，SEQ ID NO.24所示的突变型探针；

针对ANKK1基因rs1800497的引物探针组合7包括SEQ ID NO.25所示的上游引物，SEQ ID NO.26所示的下游引物，SEQ ID NO.27所示的野生型探针，SEQ ID NO.28所示的突变型探针；

针对DRD2基因rs1799978的引物探针组合8包括SEQ ID NO.29所示的上游引物，SEQ ID NO.30所示的下游引物，SEQ ID NO.31所示的野生型探针，SEQ ID NO.32所示的突变型探针；

针对MC4R基因rs489693的引物探针组合9包括SEQ ID NO.33所示的上游引物，SEQID NO.34所示的下游引物，SEQ ID NO.35所示的野生型探针，SEQ ID NO.36所示的突变型探针；

针对HTR2C基因rs1414334的引物探针组合10包括SEQ ID NO.37所示的上游引物，SEQ ID NO.38所示的下游引物，SEQ ID NO.39所示的野生型探针，SEQ ID NO.40所示的突变型探针。

在一种实施方式中，上述SNP分别选自CYP2C19基因的rs4244285、rs4986893、rs12248560，CYP2D6基因的rs16947、rs5030865、rs1065852，ANKK1基因的rs1800497，DRD2基因的rs1799978，MC4R基因的rs489693，HTR2C基因的rs1414334。

其中，CYP2C19基因多态性与抗精神失常类药物毒性相关，包括但不限于三环类抗抑郁药、氯氮平、米氮平、度洛西汀、托莫西汀等，以上药物主要由肝药酶CYP2C19和/或CYP2D6代谢，CYP2C19基因多态性会影响酶的活性，进而影响药物的治疗效果或不良反应，中国人群中CYP2C19(*2、*3、*17)等位基因的突变频率较高，建议给予抗精神失常类药物时，检测患者的CYP2C19基因型以确定合适方案或给药剂量；CYP2D6基因多态性与抗精神失常类药物相关，包括但不限于三环类抗抑郁药、氯氮平、米氮平、度洛西汀、托莫西汀等，以上药物主要由肝药酶CYP2C19和/或CYP2D6代谢，CYP2D6基因多态性会影响酶的活性，进而影响药物的治疗效果或不良反应，中国人群中CYP2D6(*2、*10、*14)等位基因的突变频率较高，建议给予抗精神失常类药物时，检测患者的CYP2D6基因型以确定合适方案或给药剂量；ANKK1基因多态性(rs1800497)与奥氮平、氯氮平和利培酮药物毒性相关，另外与阿立哌唑疗效相关，ANKK1基因编码锚蛋白重复序列和激酶结构域，属于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族和蛋白激酶超家族，参与信号转导途径，ANKK1在神经系统调节等生物功能方面发挥重要作用，ANKK1控制大脑中多巴胺的合成，调节D2多巴胺受体的密度，通过偶联G蛋白Gi亚型偶连受体，进而抑制腺苷酸环化酶活性和cAMP合成，从而调节多巴胺在神经系统的各种生理机能；DRD2基因编码多巴胺受体的D2亚型，在神经系统调节等生物功能方面发挥重要作用，DRD2基因多态性(rs1799978)与利培酮药物疗效和毒性相关，与DRD2 T(rs1799978)等位基因相比，C等位基因携带者对药物的响应更差，对于儿童和青少年精神病患者，携带C等位基因的患者更容易出现高泌乳素血症；HTR2C基因多态性(rs1414334)是患者服用氯氮平，奥氮平或利培酮药物后患代谢综合征的风险因素，HTR2C基因编码5-羟色胺受体2C，是5-HT2受体的一种亚型，属于5-羟色胺受体家族，也是一种G蛋白偶联受体，HTR2C在调节大脑神经递质释放过程中发挥重要作用；MC4R基因基因多态性(rs489693)是服用利培酮、喹硫平、奥氮平、帕利哌酮、氟哌啶醇、氨磺必利、氯氮平、阿立哌唑和齐拉西酮等药物后出现高甘油三酯血症和体重增加的风险因素，MC4R基因编码黑皮质素4受体，一种膜结合受体，属于肾上腺皮质受体家族的成员。

在一种实施方式中，采用ACTB基因作为内参基因，对于ACTB基因：上游引物如SEQID NO.41所示，下游引物如SEQ ID NO.42所示，探针如SEQ ID NO.43所示。

本公开还提供了一种用于精神类药物基因多种SNP位点检测的试剂盒，包括如上所述的核酸组合物。在一种实施方式中，还包括PCR缓冲液、dNTPs和Taq DNA聚合酶。本公开的用于精神类药物基因多种SNP位点检测的试剂盒主要组成成分如下表所示。

本公开还提供了一种用于精神类药物基因多种SNP位点检测的非诊断方法，包括以下步骤：

S1、提取样本DNA；

S2、将样本DNA、阴性对照、阳性对照分别加入装有上述核酸组合物的PCR反应管中，将PCR反应管放入PCR仪中进行PCR扩增；

S3、采集PCR扩增过程中的荧光信号，对上述样本DNA进行检测结果分析。

在一种实施方式中，上述PCR扩增的条件为95℃预变性5min，进行1个循环；95℃变性10s，60℃退火45s，进行40个循环。上述PCR扩增时采集荧光信号的荧光通道包括FAM通道、VIC通道、ROX通道。

在一种实施方式中，将PCR反应管放入PCR仪前置于温度为2-8℃的环境中保存。

本公开还提供了一种如上任一所述的核酸组合物在人全血样本中精神类相关药物基因多态性定性检测中的应用。

在一种实施方式中，上述精神类相关药物包括奥氮平、氯氮平、利培酮、阿立哌唑、三环类抗抑郁药、米氮平、度洛西汀、托莫西汀、喹硫平、帕利哌酮、氟哌啶醇、氨磺必利和齐拉西酮。

下面结合具体实施例对本公开进行详细说明：

实施例1

1.PCR前处理

1.1试剂准备(试剂准备室)：

1)从冰箱中取出试剂盒，平衡至室温，各组分充分融解，涡旋混匀，瞬时低速离心。

2)核算当次实验所需要的反应数(N)，按照40μL/孔的分装量将

10种反应液分装到N个PCR反应管内。PCR反应管通过传递窗转移至样本处理室，剩余试剂放回-20℃±5℃冰箱避光保存。

N＝(样本数+阴性对照(1T)+阳性对照(1T))×10

1.2样本准备(样本处理室)：

1)样本DNA提取：参考所购买的商用基因组DNA提取试剂盒说明书进行操作。使用广州瑞博奥生物科技有限公司血液基因组提取试剂盒，用于血液基因组DNA的提取，得到待测样本的基因组DNA。

2)加样：将待测样本的基因组DNA、阴性对照、阳性对照分别加入已装有10种反应液的PCR反应管，加入量为10μL/孔。盖好PCR反应管盖，记录样本加样情况。瞬时低速离心，将PCR反应管转移到核酸扩增区进行上机检测。若PCR反应管内加入模板后不能立即上机，建议将加好模板的PCR反应管置于2～8℃暂时保存，并在24小时内尽快上机检测。

2.PCR扩增(PCR扩增室)：

将准备好的PCR反应管放置在仪器样本槽相应位置，并记录放置顺序。PCR扩增的相关参数如下表所示：

检测通道如下表所示。

3.基线和阈值设定

反应结束后，根据扩增曲线，设定合适的基线(Baseline)和荧光阈值(Threshold)。Baseline设为3-15Cycler(根据实际情况，Baseline Cycler可在一定范围内变化)，荧光阈值一般设定在扩增曲线指数增长期的拐点，得到不同通道的Ct值。

4.质量控制

1)阴性对照：FAM均无扩增曲线或扩增曲线为轻微斜线，且Ct显示为Undet。

2)阳性对照：FAM三个通道均有典型的S型扩增曲线且Ct值<32。

5.检测结果的判定

在阴性对照和阳性对照均正常的情况下，结果判断如下：

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其中，纯和野生型扩增图谱如图1所示，当检测样本为纯和野生型时，针对SNP位点涉及的特异性探针中的野生型探针会结合SNP靶序列，但由于野生型靶序列突变不含纯和突变型SNP位点，此时野生型探针和靶序列结合，故荧光PCR会出现一条扩增曲线；杂合突变扩增图谱如图2所示，当检测样本为杂合突变型时，针对SNP位点设计的特异性不同荧光标记的探针中的野生型探针和突变型探针会同时结合SNP靶序列，故荧光PCR会出现两条扩增曲线；纯和突变型扩增图谱如图3所示，当检测样本为纯合突变型时，针对SNP位点设计的特异性探针中的突变型探针会结合SNP靶序列，但由于纯合突变型靶序列不含野生型SNP位点，此时野生型探针不和靶序列结合，故荧光PCR会出现一条扩增曲线。

实施例2

采用本公开的用于精神类药物基因多种SNP位点检测的试剂盒和非诊断方法，对已知SNP位点基因型结果的22份样品进行检测，其中上述22份样品均来自临床，样品类型为全血或口腔拭子，已知结果如下表所示。

检测结果如下表所示。

根据检测结果与已知结果的对比情况可以发现，采用本公开的用于精神类药物基因多种SNP位点检测的试剂盒和非诊断方法可以很好的检测出测试血样样品的各种基因型，包含CYP2C19、CYP2D6、ANKK1、DRD2、MC4R和HTR2C六个基因检测10个SNP位点的结果与已知的临床样本结果完全一致。

以上说明书中描述的只是本公开的具体实施方式，各种举例说明不对本公开的实质内容构成限制，所属技术领域的普通技术人员在阅读了说明书后可以对以前上述的具体实施方式做修改或变形，而不背离本公开的实质和范围。