一种评估中国荷斯坦奶牛的乳品质性状的试剂盒

技术领域

本发明属于分子育种技术领域。更具体地，涉及一种评估中国荷斯坦奶牛的乳品质性状的试剂盒。

背景技术

中国荷斯坦奶牛是本地黄牛与引进的荷斯坦奶牛经过不断选育后逐渐形成的适合本地环境养殖的品种，属于肉乳兼用型品种，也是我国饲养最多的奶牛品种。经过长期的选育，逐渐形成更加具有中国特色的荷斯坦奶牛，是我国产奶量最高、数量最多、分布最广的奶牛品种。在奶牛的健康管理中，通过遗传改良策略改善奶牛乳品质性能的应用越来越广泛，结合健康性状信息的育种策略有机会改善动物的健康状况和整个乳产业的现状。

脱氢酶/还原酶3(dehydrogenase/reductase 3，DHRS3)又被称为视网膜短链脱氢酶/还原酶(retinal short-chain dehydrogenase/reductase，retSDR1)，短链醇脱氢酶/还原酶超家族(SDR16C家族)中高度保守的成员，是一类蛋白质编码基因。据报道DHRS3是一种脂滴蛋白，并且在脂质和类维生素A(视黄醇)的代谢中起作用。视黄醇是类视黄醇化合物家族中的一员，主要通过调节基因表达影响细胞生物学的几个方面。DHRS3能够根据底物和辅因子的可用性催化氧化或还原，是将全反式视黄醛(All-trans retinal)还原为全反式视黄醇(All-trans retinol,atRAL)即维生素A，并防止过量视黄酸的合成。最初DHRS3被鉴定为具有与全反式视黄醇脱氢酶相似的酶活性，随后被证明在视锥细胞视周期中促进视网膜还原为视黄醇。脱氢酶/还原酶家族被认为依赖于NADP(H)，并且具有多种底物。而DHRS3可催化多种底物的氧化/还原，包括类视黄醇和类固醇。基于此观点，相关研究证实，只有全反式视黄醛被确定为DHRS3底物。有研究表明，在小鼠成肌细胞分化过程中DHRS3的表达显著增加，表明了DHRS3对C2-C12成肌细胞分化和小鼠骨骼肌再生起积极作用。有研究报道在视锥细胞的视觉周期中，DHRS3减少了视黄醛向视黄醇的转化；以及DHRS3作为视黄醇还原酶，DHRS3和视黄酸脱氢酶10，这两个相关的膜结合蛋白在功能上相互激活，介导视黄醇和视网膜之间的转化。DHRS3通过降低全反式视黄醇水平参与全反式视黄酸(all trans-retinoic acid，atRA)的代谢，从而阻止atRA在胚胎发育过程中的过度形成。目前已经证实当有过多的维甲酸，DHRS3的表达上调，而当维甲酸合成被阻断时，DHRS3的表达下调，表明DHRS3基因转录对的维甲酸的形成具有一定调控作用。

此外，DHRS3在医学临床上也有相关报道，证实DHRS3是一类肿瘤抑制因子，与人类胃癌及骨关节炎的作用机制和肿瘤分化程度有关。研究发现DHRS3的表达降低与胃癌的发生有关，研究发现上调DHRS3可以促进hBMSCs成骨分化。据报道，成神经细胞瘤细胞中DHRS3的异位表达可增加视黄醇的浓度，支持DHRS3作为视网膜还原酶在生成视黄醇存储形式中的作用。最近的研究显示，磷酸化缺陷突变体RARαS77A的抗肿瘤作用至少部分是由miR-3074-5p的上调所介导的，它直接针对DHRS3，通过抑制RARαS77的磷酸化，可以绕过RA刺激以反式激活肿瘤抑制性miR-3074-5p并减少致癌DHRS3，从而达到治疗肿瘤的目的。虽然关于DHRS3对视黄醇代谢影响的研究很多，但DHRS3对于乳品质性状的影响仍缺少理论依据。

产奶性状是奶牛最重要的经济性状，包括产奶量、乳脂量、乳蛋白量、乳脂率和乳蛋白率，属于受大量基因和诸多环境因素共同影响的数量性状。其中乳脂是决定奶牛的产奶性能的重要性状之一，它的组成及含量是影响牛奶口感及营养价值的主要因素。牛乳脂代谢是一个复杂而又高度协调的基因表达程序，主要受遗传因素调控。基因的表达调控、候选基因的选择、基因间的相互作用，共同构成了奶牛乳脂性状的调控作用网络。在过去的几十年里，数量性状位点(Quantitative Trait Locus QTL)、候选基因分析和全基因组关联研究(Genome-Wide Association Studies GWAS)被广泛用于鉴定奶牛的产奶性状基因，例如AGPAT6、GHR和POU1F1等基因已被证实与产奶性状显著相关。但是关于DHRS3基因在中国荷斯坦牛产奶性能方面尚无相关报道。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供一种评估中国荷斯坦奶牛的乳品质性状的试剂盒。

本发明的第一目的是提供检测SNP位点的基因的试剂在评估中国荷斯坦奶牛的乳品质性状中的应用。

本发明的第二目的是提供检测SNP位点的基因的试剂在制备评估中国荷斯坦奶牛的乳品质性状的试剂盒中的应用。

本发明的第三目的是提供一种用于评估中国荷斯坦奶牛的乳品质性状的试剂。

本发明的第四目的是提供一种用于制备评估中国荷斯坦奶牛的乳品质性状的试剂盒的试剂。

本发明的第五目的是提供一种评估中国荷斯坦奶牛的乳品质性状的试剂盒。

本发明的第六目的是提供一种评估中国荷斯坦奶牛的乳品质性状的方法。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

以DHRS3作为对象，通过扩增中国荷斯坦奶牛DHRS3基因，采用直接测序检测单核苷酸多态性位点(Single nucleotide polymorphisms，SNPs)，分析其在群体中的遗传多态性，并与乳品质相关性状进行关联分析，发现了一个跟乳汁中乳糖含量相关的SNP位点。DHRS3基因的3’UTR中存在一个突变位点即rs133328478位点(其位于NC_037343.1：41160246，即ARS-UCD1.2版牛基因组的第16染色体的第41160246位)，并存在AA、AG、GG 3种基因型，AG基因型个体的乳糖含量显著高于GG基因型个体(P<0.05)，而与乳脂、乳蛋白、产奶量、尿素氮以及干物质的含量均没有显著相关性(P>0.05)。

因此本发明要求保护检测SNP位点的基因的试剂在评估中国荷斯坦奶牛的乳品质性状中的应用，所述SNP位点位于为rs133328478位点，所述乳品质性状为乳糖含量，其基因型为AG的个体分泌的乳汁中乳糖含量显著比基因型为GG的个体分泌的乳汁中乳糖含量高。

本发明还要求保护检测SNP位点的基因的试剂在制备评估中国荷斯坦奶牛的乳品质性状的试剂盒中的应用，所述SNP位点位于为rs133328478位点，所述乳品质性状为乳糖含量，其基因型为AG的个体分泌的乳汁中乳糖含量显著比基因型为GG的个体分泌的乳汁中乳糖含量高。

优选地，所述试剂为引物。

更优选地，所述引物为核苷酸序列如SEQ ID NO:1和2所示的引物。

上游引物：5'-TATGGGAACCACTACTCAAC-3'(SEQ ID NO:1)，

下游引物：5'-TGCCTCCTTCTTGTCTACTC-3'(SEQ ID NO:2)。

本发明还要求保护一种用于评估中国荷斯坦奶牛的乳品质性状的试剂，其用于检测rs133328478位点的基因型，所述乳品质性状为乳糖含量，其基因型为AG的个体分泌的乳汁中乳糖含量显著比基因型为GG的个体分泌的乳汁中乳糖含量高。

本发明还要求保护一种用于制备评估中国荷斯坦奶牛的乳品质性状的试剂盒的试剂，其用于检测rs133328478位点的基因型，所述乳品质性状为乳糖含量，其基因型为AG的个体分泌的乳汁中乳糖含量显著比基因型为GG的个体分泌的乳汁中乳糖含量高。

优选地，所述试剂为引物。

更优选地，所述引物为核苷酸序列如SEQ ID NO:1和2所示的引物。

本发明还要求保护一种评估中国荷斯坦奶牛的乳品质性状的试剂盒，含有所述的试剂。

优选地，还含有PCR试剂。

更优选地，所述PCR试剂为2×Green Taq Mix和/或ddH

作为一个具体的实施例，所述试剂盒含有：核苷酸序列如SEQ ID NO:1和2所示的引物、2×Green Taq Mix和ddH

其使用方法为：

1、提取血液DNA

2、PCR扩增及产物检测

对血液DNA的进行PCR扩增，其上游引物：5'-TATGGGAACCACTACTCAAC-3'(SEQ IDNO:1)，下游引物：5'-TGCCTCCTTCTTGTCTACTC-3'(SEQ ID NO:2)；

PCR反应体系共为20μL，2×Green Taq Mix 10μL，ddH

PCR扩增过程：首先95℃预变性5min，95℃变性30s，60℃退火45s，72℃延伸1min，循环40次，72℃延伸5min，放在4℃下保存。PCR产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳检测后，进行测序。

3、结果判断

扩增产物经过1.5％琼脂糖凝胶电泳检验，在799bp出现明亮且单一的条带，具有特异性。采用直接测序法对PCR产物进行检测，检测rs133328478位点的基因型，其基因型为AG的个体分泌的乳汁中乳糖含量显著比基因型为GG的个体分泌的乳汁中乳糖含量高。

本发明还要求保护一种评估中国荷斯坦奶牛的乳品质性状的方法，使用所述的试剂检测位于rs133328478位点的基因型，其位于NC_037343.1：41160246，即ARS-UCD1.2版牛基因组的第16染色体的第41160246位，所述乳品质性状为乳糖含量，其基因型为AG的个体分泌的乳汁中乳糖含量显著比基因型为GG的个体分泌的乳汁中乳糖含量高。

作为一个具体的实施例，所述方法包括以下步骤：

1、提取血液DNA

2、PCR扩增及产物检测

对血液DNA的进行PCR扩增，其上游引物：5'-TATGGGAACCACTACTCAAC-3'(SEQ IDNO:1)，下游引物：5'-TGCCTCCTTCTTGTCTACTC-3'(SEQ ID NO:2)；

PCR反应体系共为20μL，2×Green Taq Mix 10μL，ddH

PCR扩增过程：首先95℃预变性5min，95℃变性30s，60℃退火45s，72℃延伸1min，循环40次，72℃延伸5min，放在4℃下保存。PCR产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳检测后，进行测序。

3、结果判断

扩增产物经过1.5％琼脂糖凝胶电泳检验，在799bp出现明亮且单一的条带，具有特异性。采用直接测序法对PCR产物进行检测，检测rs133328478位点的基因型，其基因型为AG的个体比基因型为GG的个体分泌的乳汁中乳糖含高。

本发明具有以下有益效果：

本发明提供了一个中国荷斯坦奶牛中，与乳品质性状中的乳糖含量相关的SNPrs133328478位点，其位于NC_037343.1：41160246，即ARS-UCD1.2版牛基因组的第16染色体的第41160246位，其基因型为AG的个体分泌的乳汁中乳糖含量显著比基因型为GG的个体分泌的乳汁中乳糖含量高。本发明为中国荷斯坦奶牛DHRS3基因的生物学功能和优质奶牛育种标记选择提供了依据。

附图说明

图1为荷斯坦奶牛DHRS3基因扩增产物电泳图；M为DL2000Marker，1、2为不同个体的PCR产物

图2为DHRS3基因rs133328478位点的3种测序结果；Ⅰ是基因型为AA的个体，Ⅱ是基因型为AG的个体，Ⅲ是基因型为GG的个体。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

试验试剂：血液基因组提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司；Green TaqMIX购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司；Agarose购自北京全式金生物；DL2000 DNAmarker购自宝日医生物技术(北京)有限公司；4SGelblue,(10000X in water)和50×TAEBuffer购自生工生物工程(上海)股份有限公司；

试验仪器：高速冷冻离心机

除非特别说明，以下实施例其他所用试剂和材料均为市购。

实施例1 DHRS3基因的SNP位点

一、实验材料

饲养环境相同的106头中国荷斯坦奶牛来自黑龙江某牛场，通过牛颈静脉采血(5mL/头)的方式，加入抗凝剂放于-80℃保存。

二、实验方法

1、血液DNA的提取

血液DNA的提取使用天根生化科技(北京)有限公司的血液基因组DNA提取试剂盒，按照试剂盒说明书要求对荷斯坦奶牛血液样本进行全基因DNA提取。使用分光光度计检测提取的DNA浓度并记录，于-20℃保存备用。

2、引物的设计与合成

根据NCBI网站中的Ensembl查询到牛DHRS3基因序列(ENSBTAG00000024493)，利用Primer 5.0对DHRS3基因进行引物设计。上游引物：5'-TATGGGAACCACTACTCAAC-3'(SEQ IDNO:1)，下游引物：5'-TGCCTCCTTCTTGTCTACTC-3'(SEQ ID NO:2)，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

3、PCR扩增及产物检测

PCR反应体系共为20μL，2×Green Taq Mix 10μL，ddH

PCR扩增过程：首先95℃预变性5min，95℃变性30s，60℃退火45s，72℃延伸1min，循环40次，72℃延伸5min，放在4℃下保存。PCR产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳检测后，送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。

三、实验结果

以荷斯坦奶牛血液DNA为模板，以SEQ ID NO:1和2作为引物进行扩增，DHRS3基因的扩增产物经过1.5％琼脂糖凝胶电泳检验，在799bp出现明亮且单一的条带，具有特异性。结果如图1所示。

采用直接测序法对PCR产物进行检测，在该基因的3‘UTR区发现一个重叠峰即SNP位点，其基因型峰图见图2。定位至DHRS3基因序列，该突变位点位于NC_037343.1：41160246，即ARS-UCD1.2版牛基因组的第16染色体的第41160246位的SNP位点，由A突变为G，即rs133328478位点。

实施例2DHRS3基因rs133328478位点的群体遗传特性

一、实验方法

利用SeqMen对实施例1的得到的106头中国荷斯坦奶牛测序后所提供的结果进行分析，鉴别个体的基因型，利用EXCEL等软件统计分析基因频率、基因型频率、有效等位基因数(Ne)、遗传杂合度(H)和多态信息含量(PIC)计算χ

二、实验结果

DHRS3基因rs133328478位点的群体遗传特性结果如表1所示，从表1中可以看出优势基因型为GG，优势等位基因为G其频率大于0.5，rs133328478位点的基因杂合度(H)和多态信息含量均处于0～0.25，这一结果意味着该位点在DHRS3基因中呈现为低度多态，χ

表1 DHRS3基因rs133328478位点的群体遗传特性：

实施例3DHRS3基因rs133328478位点与中国荷斯坦奶牛乳品质性状的相关分析

一、实验方法

对实施例1中的饲养环境相同的106头中国荷斯坦奶牛的乳品质性状(奶量、脂肪、蛋白质、乳糖、尿素、和干物质)进行检测，具体检测方法为：利用乳成分分析仪检测了生长在同一环境下的并正处于泌乳期的106头奶牛的乳品质性状，主要包括乳脂、乳蛋白、乳糖、体细胞数、尿素氮、干物质含量等。

个体产奶量即每头奶牛各泌乳期的产奶量是奶量统计计算的基础，个体产奶量常以305天产奶量、305天校正产奶量表示。

305天产奶量：只自产犊后第一天开始到第305天为止的产奶量。

305天的校正产奶量：对于泌乳期达不到305天，或超过305天而又无日产奶记录时，将这些记录的实际产奶量乘以相对系数，校正为305天近似产量。

利用SPSS26.0软件中的单因素方差的多重比较分析对中国荷斯坦牛的产奶性状与基因型之间的关系进行差异性显著检验，当P<0.05时表示差异显著，当P<0.01时表示差异极显著。结果使用平均值±标准差表示。

二、实验结果

DHRS3基因rs133328478位点与中国荷斯坦奶牛的乳品质性状的相关分析结果如表2所示，该SNP位点与奶牛乳品质性状中的乳糖具有显著相关性(P<0.05)，其中AG基因型的个体具有较高的乳糖水平，其基因型为AG的个体比基因型为GG的个体分泌的乳汁中乳糖含显著高，并且该位点与乳脂、乳蛋白、产奶量、尿素氮以及干物质的含量均没有显著相关性。

表2 DHRS3基因rs133328478位点与中国荷斯坦奶牛乳品质性状的相关分析：

实施例4一种评估中国荷斯坦奶牛的乳品质性状的方法

一、实验方法

1、血液DNA的提取

血液DNA的提取使用天根生化科技(北京)有限公司的血液基因组DNA提取试剂盒，按照试剂盒说明书要求对荷斯坦奶牛血液样本进行全基因DNA提取。使用分光光度计检测提取的DNA浓度并记录，于-20℃保存备用。

2、PCR扩增及产物检测

对血液DNA的进行PCR扩增，其上游引物：5'-TATGGGAACCACTACTCAAC-3'(SEQ IDNO:1)，下游引物：5'-TGCCTCCTTCTTGTCTACTC-3'(SEQ ID NO:2)；

PCR反应体系共为20μL，2×Green Taq Mix 10μL，ddH

PCR扩增过程：首先95℃预变性5min，95℃变性30s，60℃退火45s，72℃延伸1min，循环40次，72℃延伸5min，放在4℃下保存。PCR产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳检测后，进行测序。

二、结果判断

扩增产物经过1.5％琼脂糖凝胶电泳检验，在799bp出现明亮且单一的条带，具有特异性。采用直接测序法对PCR产物进行检测，检测NC_037343.1：41160246，即ARS-UCD1.2版牛基因组的第16染色体的第41160246位的SNP位点，即rs133328478位点的基因型，其基因型为AG的个体比基因型为GG的个体分泌的乳汁中乳糖含高。

实施例5一种评估中国荷斯坦奶牛的乳品质性状的试剂盒

一、组成

核苷酸序列如SEQ ID NO:1和2所示的引物、2×Green Taq Mix和ddH

二、使用方法

同实施例4。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。