一种新的色氨酸脱羧酶突变体、重组基因工程菌的构建及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种新的色氨酸脱羧酶突变体、重组基因工程菌的构建及其应用。

背景技术

色胺及5-羟基色胺均属于色氨酸衍生物，与色氨酸结构类似。色胺存在于哺乳动物大脑中，具有潜在的神经调节功能。作为一种重要的中间产物，色胺可进一步合成多种萜类吲哚生物碱，如长春胺、长春西汀和异胡豆苷等，在医药与化工领域具有重要价值。

5-羟基色胺最早从血清中发现，又名血清素。其广泛存在于哺乳动物组织中，且主要分布于松果体和下丘脑，能够调节多种生理功能，如睡眠、食欲、情绪、免疫调节和痛觉感知等。此外，5-羟基色胺在植物中也发挥重要功能，包括开花周期、形态建成、衰老、抵御生物胁迫等生理调节过程。

5-羟基色胺可通过化学合成或从动植物中提取获得，色胺主要依赖化学、生物合成。化学合成涉及众多有毒有害试剂，且工艺流程长、使用原料种类多、条件苛刻和三废多。南京法恩化学有限公司在其专利CN112300049B中利用5-羟基吲哚、硝基乙烯经过多步化学反应生产5-羟基色胺，收率高达91％，但需要多种有机溶剂、反应条件严苛。吴静等人利用化学脱羧法合成色胺，其收率达99.4％，但反应需在120℃高温下进行，且使用的二苯醚属于有毒有害试剂。动植物提取技术尚不成熟，且产量低、纯度低。而生物合成属于绿色合成工艺，具有三废少且易处理，可规模化、性价比高等特点，应用前景广阔。新泰市佳禾生物科技有限公司在其专利CN113403351A中使用酶法催化L-色胺酸形成色胺及D-色氨酸，转化率达98.9％，但生产过程较为复杂，如粗酶液获取需经高压均质处理、反应前需对底物消旋反应等，额外增加了生产成本。

本发明从提升脱羧酶活性和简化生产工艺两方面出发，探究色胺及5-羟基色胺的工业化生产条件，降低了生产成本，提高了合成效率。

发明内容

为了解决以上技术问题，本发明提供了一种新的色氨酸脱羧酶(L-Tryptophandecarboxylase，TDC)突变体、重组基因工程菌的构建及其应用。

为了解决上述技术问题，本发明采用了以下技术方案：

第一方面，本发明提供一种色氨酸脱羧酶突变体，

(a)其氨基酸序列由SEQ ID NO:1所示序列突变而来，在选自下组的一个或多个氨基酸残基位点发生突变：37位、73位、91位、187位、352位和432位，即37位、73位、91位、187位、352位和432位突变可以选自除原本氨基酸外的其他氨基酸中的任意一种；

或(b)所述色氨酸脱羧酶与(a)所述的氨基酸序列相似性达95％以上，优选98％以上，更优选99％以上，并且具有(a)所述蛋白的功能，其中对应于SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的37位、73位、91位、187位、352位和/或432位氨基残基与(a)所述的氨基酸序列突变方式相同；

或(c)所述色氨酸脱羧酶由在(a)所述的氨基酸序列的C末端和/或N末端添加或缺失1-20个，优选1-10个，更优选1-5个的氨基酸残基而形成，并且具有(a)所述蛋白的功能，其中对应于SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的37位、73位、91位、187位、352位和/或432位氨基残基与(a)所述的氨基酸序列突变方式相同。

优选地，37位的突变是突变为脯氨酸、丝氨酸或天冬氨酸，73位的突变是突变为异亮氨酸或亮氨酸，91位的突变是突变为丙氨酸或苏氨酸，187位的突变是突变为缬氨酸、甲硫氨酸或亮氨酸，352位的突变是突变为赖氨酸、半胱氨酸、丙氨酸或天冬氨酸，432位的突变是突变为亮氨酸或缬氨酸。

更优选地，37位的突变为脯氨酸，73位的突变为异亮氨酸，91位的突变为丙氨酸，187位的突变为缬氨酸，352位的突变为赖氨酸，432位的突变为亮氨酸。

第二方面，本发明还提供一种编码上述色氨酸脱羧酶突变体的基因。

第三方面，本发明提供一种表达载体，所述表达载体包含编码上述色氨酸脱羧酶突变体的基因，能够表达上述色氨酸脱羧酶突变体。

第四方面，本发明提供一种重组基因工程菌，所述重组基因工程菌中包含上述表达载体或其基因组中整合有编码色氨酸脱羧酶突变体的基因。所述重组基因工程菌可将上述表达载体转入宿主细胞中获取。

在具体的实施方式中，所述宿主细胞是细菌或酵母菌；优选地，所述宿主细胞是大肠杆菌(E.coli)、谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、毕赤酵母(Pichia pastoris)和解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)；更优选地，所述宿主细胞是大肠杆菌、酿酒酵母；最优选地，所述宿主细胞是大肠杆菌。

第五方面，本发明提供上述色氨酸脱羧酶突变体或表达载体或基因工程菌在生产色胺或5-羟基色胺中的应用。

第六方面，本发明还提供一种生产色胺或5-羟基色胺的方法，包括以下步骤：将基因工程菌诱导蛋白表达，然后离心收集细胞，后处理，再加入到含有原料色氨酸或5-羟基色氨酸的转化液中反应，最后从转化液中分离得到色胺或5羟基色胺。

进一步地，所述的后处理为用0.9％生理盐水洗涤。

按上述方案，所述转化液为含30～200g/L的色氨酸或5-羟基色氨酸、0.2～0.5g/L的磷酸吡哆醛的水溶液。

按上述方案，所述反应温度为30～40℃。

按上述方案，所述反应过程为摇床震荡，转速为100～300rpm。

按上述方案，所述反应时间为3～24h。

按上述方案，所述的反应体系为密闭条件。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明通过对SEQ ID NO:1所示色氨酸脱羧酶原始序列进行突变，获得了活性明显提升的色氨酸脱羧酶突变体。其用于生成色胺和5-羟基色胺，可显著提升催化效率，降低催化过程微生物细胞用量，降低生产成本，其催化产率较野生型酶最高分别可提升584％、225％，色胺和5-羟基色胺的产量分别高达52g/L、79g/L。

初始反应体系为水，除底物色氨酸或5羟基色氨酸、辅酶磷酸吡哆醛外，不添加任何其它物质，所得产物无杂质，便于分离。

附图说明

图1为pRSFDuet1-TDC质粒图谱。

图2为TDC单突变体催化色氨酸转化为色胺结果图。

图3为TDC单突变体催化5-羟基色氨酸转化为5-羟基色胺结果图。

图4为TDC多重突变体催化色氨酸转化为色胺结果图。

图5为TDC多重突变体催化5-羟基色氨酸转化为5-羟基色胺结果图。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1野生型色氨酸脱羧酶工程菌的构建

(1)以pRSFDuet-1载体为模板，利用引物P1-F和P1-R进行PCR扩增；所述pRSFDuet-1载体为商业化载体，购于Novagen；所述引物P1-F序列为5'-AAGCTTGCGGCCGCATAATGCTT-3'，如SEQ ID No.3所示，引物P1-R序列为5'-GGTATATCTCCTTATTAAAGTTAAACAAAATTATTTCTACAGGGG-3'，如SEQ ID No.4所示；PCR产物回收后得到线性化载体pRSFDuet-1，所述线性化载体片段大小为3757bp；

(2)分别以密码子优化后人工合成的TDC基因为模板，利用引物TDC-F，TDC-R进行PCR扩增，所述扩增产物经回收后得到TDC基因目的片段，片段大小为1476bp，TDC基因核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示，所述引物序列TDC-F为：5'-TTAATAAGGAGATATACCATGAACCGCATGAAAAAC-3'，如SEQ ID No.5所示，TDC-R为：5'-TTATGCGGCCGCAAGCTTTTAGCTACGATCTGCCAGATCG-3'，如SEQ ID No.6所示。

(3)上述PCR反应体系为模板1μL，上下游引物各2μL，PrimeSTAR Max DNA聚合酶25μL，灭菌的双蒸水20μL。

(4)上述PCR扩增程序为98℃预变性5min，98℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环，72℃延伸7min。

(5)利用ClonExpress II一步克隆试剂盒将上述目的片段与性化载体pRSFDuet-1连接，得到重组质粒，将其命名为pRSFDuet1-TDC，经测序验证正确，获得构建成功的重组质粒，质粒图谱如图1所示。

(6)利用电转法将pRSFDuet1-TDC质粒转化到大肠杆菌表达宿主菌BL21(DE3)中，并涂布到含有卡那霉素的LB固体培养基上，LB平板在37℃培养至长出转化子，挑取阳性转化子，获得野生型色氨酸脱羧酶工程菌(WT)。

实施例2单突变型色氨酸脱羧酶工程菌的构建

以已构建的pRSFDuet1-TDC质粒为模板，设计引物进行质粒扩增诱变，获得碱基突变的线性化质粒载体，再将其转化至大肠杆菌BL21(DE3)，经体内修复环化后得到碱基突变的质粒，具体为：

(1)以已构建的pRSFDuet1-TDC质粒为模板，分别使用6对引物进行PCR扩增，各引物序列如表1所示，获得6种突变序列，其突变方式分别为：将TDC第37位氨基酸的精氨酸突变为脯氨酸，73位的缬氨酸突变为异亮氨酸，91位的丝氨酸突变为丙氨酸，187位的半胱氨酸突变为缬氨酸，352位的精氨酸突变为赖氨酸，432位的丙氨酸突变为亮氨酸。所得表达突变体的质粒分别命名为pRSFDuet1-TDC(R37P)、pRSFDuet1-TDC(V73I)、pRSFDuet1-TDC(S91A)、pRSFDuet1-TDC(C187V)、pRSFDuet1-TDC(R352K)和pRSFDuet1-TDC(A432L)；

表1.突变体构建引物序列

(2)上述PCR反应体系为模板1μL，上下游引物各2μL，PrimeSTAR Max DNA聚合酶25μL，灭菌的双蒸水20μL。

(3)上述PCR扩增程序为98℃预变性5min，98℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min 30s，30个循环，72℃延伸7min。

(4)反应结束后，取8.5μLPCR产物，加0.5μL DpnI限制性内切酶，1μL 10×CutSmart，37℃水浴4h。

(5)利用电转法将上述6种Dpn I处理后的线性化质粒转化到大肠杆菌表达宿主菌BL21(DE3)中，并涂布到含有卡那霉素的LB固体培养基上，LB平板在37℃培养至长出转化子，挑取转化子测序，获得单突变型色氨酸脱羧酶工程菌。

实施例3.单突变型色氨酸脱羧酶工程菌催化活性测定

(1)将野生型、单突变型色氨酸脱羧酶工程菌在含有50μg/mL卡那霉素的种子培养基中过夜培养，得到种子液，所述种子培养基(质量百分比)为1％胰蛋白胨、1％氯化钠和0.5％酵母提取物，所述种子液的培养条件为37℃，220rpm。

(2)将上述种子液按2％接种到含有1.2％胰蛋白胨、2.4％酵母提取物、0.4％甘油、0.231％KH

(3)培养3h后，加入终浓度0.5mM的IPTG进行诱导表达，诱导表达条件为25℃、220rpm，诱导时间16h。

(4)蛋白诱导表达结束后，室温下4000rpm离心20min收集菌体，用无菌0.9％生理盐水洗涤菌体，再次离心。

(5)使用一定量的纯水(pH 7.0)悬浮菌体，至重悬液OD

(6)高效液相色谱检测色胺：色谱柱为C18(250mm*4.6mm，5μm)或等效色谱柱，流动相为30wt％的甲醇和70wt％甲酸铵水溶液(20mmol/L，pH 4.0)，流速为1mL/min，进样量为10μL，柱温箱温度为40℃，220波长下检测色胺，外标法确定含量。

(7)高效液相色谱检测5-羟基色胺：色谱柱为C18(250mm*4.6mm，5μm)或等效色谱柱，流动相为5wt％的甲醇和95wt％磷酸二氢钾水溶液(5mmol/L，pH 3.0)，流速为1mL/min，进样量为10μL，柱温箱温度为35℃，220波长下检测5-羟基色胺，外标法确定含量。

结果如图2、图3所示，可以看出，与野生型TDC菌株相比，TDC单突变体菌株催化生产色胺、5-羟基色胺含量均提高。

实施例4.多重突变型色氨酸脱羧酶工程菌的构建

在上述单突变型色氨酸脱羧酶工程菌基础上，本发明进一步构建多重突变型色氨酸脱羧酶工程菌。其中，以活性最高的3种单点突变(R37P，V73I，C187V)组合构建的多重突变型色氨酸脱羧酶工程菌具体结果见下，构建方式同实施例2。

在已有质粒pRSFDuet1-TDC(R37P)基础上，使用引物V73I-F、V73I-R构建双突变质粒pRSFDuet1-TDC(R37P/V73I)；使用引物C187V-F、C187V-R构建双突变质粒pRSFDuet1-TDC(R37P/C187V)；使用引物V73I-F1、C187V-R1构建三突变质粒pRSFDuet1-TDC(R37P/V73I/C187V)。在已有质粒pRSFDuet1-TDC(V73I)基础上，使用引物C187V-F、C187V-R构建双突变质粒pRSFDuet1-TDC(V73I/C187V)，引物V73I-F、V73I-R、C187V-F和C187V-R序列见表1，V73I-F1序列为：5'-ATTGAGCGCCATATTCTGCCGGGTATTACCCATTGGC-3'，C187V-R1序列为：5'-ATTGCTGGTATAAACAACCAGCGGCAGACGACAAC-3'。

上述多重突变体不限于上述位点组合，基于其它位点构建的多重突变型色氨酸脱羧酶工程菌也能起到提高酶活性的效果，具有协同效应。例如：R37P/S91A、R37P/R352K、R37P/V73I/S91A、R37P/S91A/R352K、R37P/V73I/S91A/R352K、R37P/V73I/S91A/C187V/R352K/A432L等。

实施例5.多重突变型色氨酸脱羧酶工程菌催化活性测定

使用实施例4中构建的多重突变体，分别测定各菌株对底物色氨酸、5羟基色氨酸的催化活性，具体方法同实施例3。结果如图4、图5所示，可以看出，与野生型TDC菌株相比，TDC多重突变体菌株催化生产色胺、5-羟基色胺含量均有显著提高，含量分别高达13.48、39.51g/L，较野生型菌株分别最高可提升584％、225％。

实施例6.优化反应条件产色胺、5羟基色胺

对实施例3中的反应条件优化，增加底物色氨酸或5-羟基色氨酸含量、辅酶PLP含量、催化反应时间，增加反应气密性(脱羧反应使底物失去一分子CO

与实施例3反应条件不同的是：步骤(1)使用三重突变体色氨酸脱羧酶工程菌TDC(R37P/V73I/C187V)，步骤(5)为：使用一定量的纯水(pH 7.0)悬浮菌体，至重悬液OD

三重突变体TDC(R37P/V73I/C187V)菌株催化结果如下表所示，色胺、5-羟基色胺含量进一步提高，达25.21g/L、78.94g/L。

表2.优化反应条件后检测结果

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