表达FcγRIIIa和NFAT-Luc报告基因的Jurkat细胞的构建方法及应用

技术领域

本发明专利涉及一种表达FcγRIIIa和NFAT-Luc报告基因的Jurkat细胞的构建方法、构建的细胞及应用，属于生物技术领域。

背景技术

抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用（Antibody-dependent cell-mediatedcytotoxicity, ADCC）是免疫系统对抗病毒感染及肿瘤疾病的一种重要免疫防御机制，是指表达Fc受体的免疫细胞通过识别抗体的Fc段直接杀伤与抗体特异性结合的靶细胞的作用。抗体通过与靶细胞表面抗原特异性结合，招募如自然杀伤（Natural killer, NK）细胞等效应细胞杀死靶细胞。NK细胞表面表达FcγRIIIa蛋白，是一种抗体Fc区域的受体，能识别并结合抗体的Fc端，从而使NK细胞结合到靶细胞周围。一旦Fc受体与抗体的Fc区域结合，NK细胞就会释放细胞因子和细胞毒性颗粒，进入靶细胞触发细胞凋亡。传统的ADCC检测方法是利用外周血单核细胞（Peripheral blood mononuclear cells, PBMC）或自然杀伤（NK ）细胞亚群作为效应细胞进行检测，该方法的效应细胞难于制备，操作繁琐，且应答变异性很大，并容易引起很高的背景读数。

鉴于此，为了解决目前本领域面临的上述问题，基于ADCC这一机制，本发明构建了工程化Jurkat 细胞作为效应细胞用于ADCC效应的检测，可用来检测、评定抗体或靶细胞的功效。本发明构建的Jurkat 细胞株能够稳定表达FcγRIIIa（高亲和V158）受体和由 NFAT应答元件驱动表达的萤火虫萤光素酶。 抗体在 ADCC 作用机制中的生物活性通过 NFAT通路活化产生的萤光素酶进行定量，效应细胞中的萤光素酶活性通过生物发光读数定量，检测的信号值高，且背景很低。本发明能够满足ADCC实验要求，检测结果稳定，准确度高，实验程序操作简便，对于单克隆抗体产品的批次放行和稳定性检测具有很好的应用价值。

发明内容

本发明的目的是提供一种可用于ADCC效应检测的Jurkat细胞株。

本发明提供了一种表达FcγRIIIa和NFAT-Luc报告基因的Jurkat细胞的构建方法，包括如下步骤：

(1) 构建NFAT-Luc的慢病毒表达质粒载体，以及FcγRIIIa 的慢病毒表达质粒载体，其中FcγRIIIa基因序列如SEQ ID No.2所示；

(2) 将步骤(1)中所述的两种慢病毒表达质粒载体配合慢病毒包装质粒分别转染至293v细胞中，获得携带有FcγRIIIa或NFAT-Luc的病毒颗粒；

(3) 用携带FcγRIIIa的病毒颗粒感染Jurkat细胞；

(4) 对流式细胞仪筛选得到的阳性细胞株进行博来霉素加压筛选；

(5)用携带NFAT-Luc的病毒颗粒感染步骤（4）筛选出的Jurkat细胞；

(6)对流式细胞仪筛选得到的阳性细胞株进行嘌呤霉素加压筛选；

(7) 加压筛选后的细胞进行单克隆化，筛选出单克隆阳性细胞株。

优选的，步骤（2）中慢病毒包装质粒为psPAX2和pMD2.G，慢病毒表达质粒载体：psPAX2：pMD2.G的质量比为1:1:1。

优选的，步骤(2)中所述转染的方式为化学转染法，所用转染试剂为阳离子聚合物PEI，具体包括如下步骤；

(1)转染前一天按5E6 cells进行10 cm Dish铺板，培养基为含10% FBS DMEM，接种细胞24 h后，293v细胞的汇合度为75%-85%；

(2)转染前4小时，将细胞培养基换为5 ml的无血清DMEM；

(3)将10 μg质粒DNA 与0.5 mL DMEM混匀后，加入20 μL PEI（PEI:DNA=2:1）转染试剂，涡旋混匀10 秒，室温静置15 min，形成DNA-PEI 复合物；

(4)将转染复合物加入到无血清培养基细胞中，轻轻混匀，于37℃，5% CO2培养箱中培养；

(5)转染结束4 h后换成10 mL含10% FBS DMEM继续培养；

(6)转染48 h后收获病毒上清，离心条件为4℃，3000 g，30 min。

优选的，步骤（3）或（5）具体为：

（1）收集Jurkat细胞，1000 rpm，5 min离心后，加入1-2 mL完全培养基重悬细胞，计数，用完全培养基调整至2E6 cells/mL的细胞工作液，并加入polybrene，使其终浓度为30 μg/mL；

（2）取100 μL的Jurkat细胞工作液加入24孔板中，加入200 μL携带有FcγRIIIa或NFAT-Luc的病毒上清，混匀后置于37℃，5% CO2培养箱中孵育2-3 h后，补充完全培养基至2mL；

（3）将24孔板放入37℃、5% CO2培养箱中继续培养72 h。

优选的，步骤(4)中博来霉素和步骤（6）中嘌呤霉素的浓度分别为250 μg/mL、0.3μg/mL。

上述的表达FcγRIIIa和NFAT-Luc报告基因的Jurkat细胞的构建方法获得的表达FcγRIIIa和NFAT-Luc报告基因的Jurkat细胞。

本发明还公开了上述的表达FcγRIIIa和NFAT-Luc报告基因的Jurkat细胞在检测ADCC效应中的应用。

优选的，其步骤包括：

（1）将抗CD20单克隆抗体样品预稀释到3 μg/mL初始工作浓度，再进行等比例稀释；

（2）将步骤(2)中稀释后的抗CD20单克隆抗体样品加入到一定比例的效应细胞和靶细胞中，于37℃，5% CO2培养箱加湿孵育，所述效应细胞为表达FcγRIIIa和NFAT-Luc报告基因的Jurkat细胞，所述靶细胞为Raji细胞；

（3）加入荧光底物，室温孵育5 min后，酶标仪进行读数。

本发明还公开了一种FcγRIIIa受体，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

本发明还公开了一种FcγRIIIa受体的编码基因，其编码基因序列如SEQ ID NO：2所示。

本发明构建了稳定表达FcγRIIIa（CD16a）受体和由 NFAT 应答元件驱动表达的萤火虫萤光素酶的效应细胞Jurkat/ NFAT/FcγRIIIa，将Raji细胞作为靶细胞，抗体的Fab段识别靶细胞上的靶抗原表位 (CD20)，同时，抗体的Fc段与效应细胞上的CD16a结合，导致ADCC作用机制被激活，转录因子NFAT启动荧光素酶报告基因的表达，加入荧光底物后产生化学发光，根据荧光素酶的表达量与抗体的浓度拟合剂量效应曲线，得到半数有效浓度EC50值，进而得到抗体药物的 ADCC生物学活性。

抗体在 ADCC 作用机制中的生物活性通过 NFAT 通路活化产生的萤光素酶进行定量，效应细胞中的萤光素酶活性通过生物发光读数定量，检测的信号值高，且背景很低。本发明能够满足ADCC实验要求，检测结果稳定，准确度高，实验程序操作简便，对于单克隆抗体产品的批次放行和稳定性检测具有很好的应用价值。

附图说明

图1为流式分析Jurkat/NFAT/FcγRIIIa效应细胞表达情况的结果图。

图2为抗CD20单抗ADCC生物学活性测定中工作浓度范围。

图3为抗CD20单抗ADCC生物学活性测定中效靶比优化的结果图。

图4为抗CD20单抗ADCC生物学活性测定中诱导时间优化的结果图。

图5为抗CD20单抗ADCC生物学活性测定中检测时间优化的结果图。

图6为抗CD20单抗ADCC生物学活性测定中重复性验证的结果图。

图7为抗CD20单抗ADCC生物学活性测定中精密度验证的结果图。

具体实施方式

实施例1构建稳定表达FcγRIIIa（CD16a）和NFAT-Luc报告基因的效应细胞Jurkat/ NFAT/FcγRIIIa

1、实验材料

Raji细胞和Jurkat细胞购自于中国科学院细胞库，293v购自于ATCC，所有细胞均在含有90％(v/v)RPMI1640或DMEM和 10％(v/v)胎牛血清（FBS）的培养基中培养，其中效应细胞Jurkat/ NFAT/FcγRIIIa使用Low IgG FBS；荧光读数采用 Spark 酶标仪购自于TECAN公司；One-Lite™ Luciferase Assay System购自于诺唯赞公司；RPMI1640购自于博士德生物科技；DMEM，FBS购自于Gibco公司；Low IgG FBS购自于Thermo公司；利妥昔单抗购自于MCE公司；Polybrene、PEI、博来霉素、嘌呤霉素来自翌圣生物；慢病毒包装质粒购自英茂生物；pLV-NFAT-ER-Luci来自翌圣生物；质粒小提试剂盒购自OMEGA；抗CD16a抗体购自北京义翘。

2、质粒制备

CD16a的基因由生工合成，克隆到慢病毒包装穿梭质粒pLV-IRES-BleoR中。将慢病毒包装质粒（psPAX2、pMD2.G）、穿梭质粒（pLV-IRES-CD16a-BleoR、pLV-NFAT-ER-Luci）分别转化TOP10感受态，20 mL LB摇菌，采用质粒小提试剂盒抽提质粒，质粒溶于水中，负20℃保存。

3、Jurkat/ NFAT/FcγRIIIa效应细胞的构建

3.1慢病毒包装：转染前24 h按5E6 cells的293v细胞进行10 cm Dish铺板，接种细胞24 h 后，293v细胞的汇合度为75%-85%；转染前4 h，将细胞培养基换为5 mL的无血清DMEM；将10 μg总质粒DNA（pLV-IRES-CD16a-BleoR或pLV-NFAT-ER-Luci：psPAX2：pMD2.G=1:1:1） 与0.5 mL DMEM混匀后，加入20 μL PEI（PEI:DNA=2:1）转染试剂，涡旋混匀10 s，室温静置15 min，形成DNA-PEI 复合物；将转染复合物加入到无血清培养基细胞中，轻轻混匀，于37℃，5% CO

3.2慢病毒（CD16a）感染Jurkat获得Jurkat/FcγRIIIa ：收集Jurkat细胞，1000rpm，5 min离心后，加入1-2 mL完全培养基重悬细胞，计数，用完全培养基调整至2E6cells/mL的细胞工作液，并加入polybrene，使其终浓度为30μg/mL；取100μL的Jurkat细胞工作液加入24孔板中，加入200μL携带有CD16a的病毒上清，混匀后置于37℃，5% CO

3.3博来霉素加压筛选：流式细胞仪检测后，筛选出的阳性细胞在24孔板进行加压，以Jurkat（2E5 cells/孔) 细胞进行250 μg/mL博来霉素连续加压筛选10天。将存活的细胞扩增培养。

3.4单克隆化获得稳定Jurkat/FcγRIIIa：将加压筛选后存活的细胞扩增培养，进行单克隆化，7-10天后挑出长出细胞团的孔扩增培养，FACS检测后筛选出阳性率高的细胞株。

3.5慢病毒（NFAT-Luc）感染Jurkat/FcγRIIIa获得Jurkat/ NFAT/FcγRIIIa：操作步骤同3.2。

3.6嘌呤霉素加压筛选：操作步骤同3.3，其中加压条件为0.3 μg/mL嘌呤霉素加压5天

3.7单克隆化获得稳定Jurkat/ NFAT/FcγRIIIa：操作步骤同3.3。

3.8获得高表达低背景的Jurkat/ NFAT/FcγRIIIa：与Raji细胞共培养，并用利妥昔单抗的梯度稀释溶液处理，以筛选具有高诱导荧光素酶表达和低非诱导背景的阳性克隆，通过流式细胞仪对构建得到的稳定表达NFAT-Luc报告基因和FcγRIIIa的Jurkat细胞的表达情况进行检测，并将其命名为Jurkat/NFAT/ FcγRIIIa细胞系。

4、实验结果

实验结果显示，通过流式细胞分析证明了本发明构建的Jurkat/NFAT/FcγRIIIa高表达FcγRIIIa(见图1)，表明了所述效应细胞的成功构建。

实施例2抗CD20单克隆抗体ADCC生物学活性测定方法的优化

本实施例分别考察了测定方法中利妥昔单抗的工作浓度范围、不同效靶比 (E:T)、不同诱导时间、不同检测时间对测定结果的影响，进行了以下优化实验。

工作浓度范围

将利妥昔单抗预稀释至3 μg/mL，按2.5倍依次稀释13个梯度进行实验，则初始工作浓度为1.2 μg/mL；或是将利妥昔单抗预稀释至3 μg/mL，按3倍依次稀释13个梯度进行实验，则初始工作浓度为1 μg/mL；其中效靶比均为6:1。

结果显示，在0 .315-1200 ng/mL的工作浓度范围内，检测结果值比较明显，且按预稀释至1 μg/mL，1:2梯度稀释9个梯度为最佳(见图2)。

最佳效靶比：

将利妥昔单抗预稀释至1 μg/mL(初始工作浓度1/3 μg/mL)，按3倍稀释9个梯度，固定效应细胞E：75000 cells/孔，按E:T=2:1、4:1、6:1、8:1、10:1摸索最佳效靶比，结果显示效靶比（E:T=2：1）检测信号值最高（见图3）。

最佳诱导时间：

将利妥昔单抗预稀释至1 μg/mL(初始工作浓度1/3 μg/mL)，按3倍稀释9个梯度，E:T=2:1，分别在0.5 h，2 h，3 h，4 h，5 h，6 h，24 h进行读板以摸索最佳诱导时间。

结果显示，0.5 h测得的净信号值可忽略不计，在一定范围内，随着诱导时间的延长信号值越高，则诱导时间在6 h检测信号值最高（见图4）。

最佳检测时间：

将利妥昔单抗预稀释至1 μg/mL(初始工作浓度1/3 μg/mL)，按3倍稀释9个梯度，E:T=2:1，做5个复孔，在5-30 min内每间隔2或4 min读板以摸索最佳检测时间。

结果显示，随着检测时间延长，信号值随之衰减，当检测时长在25 min时，信号值衰减约10%，则5 min为最佳检测时间（见图5）。

因此选择2:1为最佳效靶比，选择6 h为最佳诱导时间，选择5 min为最佳检测时间；

实施例3抗CD20单克隆抗体ADCC生物学活性测定方法的建立

实验方法：

样品制备：ADCC缓冲液为含4% Low IgG FBS的RPMI1640，利妥昔单抗用缓冲液稀释至1 μg/mL，再按照1:2倍梯度稀释，设置9个浓度梯度，每个浓度2-3个复孔，备用；

制备靶细胞Raji悬液：收集生长状态良好的Raji细胞，离心弃上清，用缓冲液重悬细胞后计数，将细胞密度调整为5E5 cells /mL，备用；

制备效应细胞Jurkat/NFAT/FcγRIIIa悬液：收集生长状态良好的Jurkat/NFAT/FcγRIIIa细胞，离心弃上清，用缓冲液重悬细胞后计数，将细胞密度调整为1E6 cells/mL，备用；

细胞铺板：取25uL步骤(2)中稀释后的靶细胞加入到96孔白板中，而后加入25 uL步骤(1)中稀释好的利妥昔单抗，最后加入25uL步骤(2)中的效应细胞，则抗体的起始浓度为1/3 μg/mL；

细胞孵育： 37℃、5％CO2的培养箱中孵育6 h；

读板：细胞板取出置于室温条件下平衡，同时Luciferase Assay System试剂应在解冻后继续在室温下平衡20-30 min，同96孔白板温度保持一致后，每孔加入75 uL荧光底物，室温5 min后，采用多功能酶标仪测定各孔的荧光值。

实施例4方法学的验证

本实施例对本发明所述的方法的重复性和精密度进行了验证。

重复性：

实验方法：由2名实验操作人员分别在两间实验室对样品进行3次重复检测，以评估重复性。

实验结果：结果显示2名实验操作员的重复实验均得到完整的S型剂量效应曲线（见图6），且RSD值均在7%以下（见表1），表明了本发明构建的方法具有良好的重复性。

表1

精密度：

实验方法：将利妥昔单抗稀释至多个初始工作浓度，制备得到3个不同效价水平的样品，相对效价理论值分别为50％、100％、150％，以上样品均重复检测2次。

实验结果：结果显示均得到完整的S型剂量效应曲线，且拟合曲线趋于同一水平（见图7）。