一种二苯醚类除草剂降解菌固定化小球及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于微生物降解领域，具体涉及一种二苯醚类除草剂降解菌固定化小球及其制备方法和应用。

背景技术

随着现代农业的发展，通过施用农药来降低杂草、害虫、病毒等危害是农业生产中的重要方法。二苯醚类除草剂是红壤地区农业生产中的主要除草剂品种，其代表品种氟磺胺草醚被广泛用于防治大豆、花生等油料作物防治苗后田间杂草。由于红壤土质黏重，氟磺胺草醚不易自然分解，对玉米、蔬菜等后茬敏感作物造成药害。此外，二苯醚类除草剂还容易通过纵向淋溶作用和横向迁移作用向地下水和江河湖泊中移动，导致水源的污染，并通过生物体的富集进入食物链，进而威胁人体健康。

微生物修复是有效的污染残留修复手段。传统液体菌剂的存在活菌数低、环境耐受性差、储存运输不便等问题，长期以来限制着降解菌剂的大规模生产及使用。微生物固定化技术弥补了传统液体菌剂的诸多局限性，展现出良好的应用前景。

在固定化方法之中，包埋法将微生物固定在多聚化合物的网格内，但微生物受到一定程度上的限制。吸附法将微生物细胞直接吸附在载体表面对微生物活力影响小，但由于细胞与载体之间的结合力较弱，容易脱落。所以，传统的单一固定化方法无法满足微生物固定化的实际应用需要。因此，如何联合应用多种固定化方法，制备有更好降解效果的固定化菌剂，对于土壤中除草剂的生物修复至关重要。

发明内容

发明目的：针对微生物制剂现有技术存在的问题，本发明提供一种二苯醚类除草剂降解菌固定化小球，它能够弥补液态菌剂的使用缺陷，提高微生物活性，改善其对外部环境的耐受性，同时具有处理效率高、稳定性强、便携可回收等优势，有利于实现土壤除草剂污染的原位修复。

本发明还提二苯醚类除草剂降解菌固定化小球的制备方法和应用。本发明采用吸附-包埋复合方式对降解菌进行固定化，使之同时具备阻滞细胞和传质限制少的优势，进一步保障了固定化菌株在二苯醚类除草剂降解中的实际应用。

技术方案：为了实现上述目的，本发明所述一种二苯醚类除草剂降解菌固定化小球，其特征在于，所述固定化小球采用吸附-包埋复合方式将二苯醚类除草剂降解菌固定，所述包埋剂为活性炭，所述吸附剂为海藻酸钠。

其中，所述二苯醚类除草剂降解菌为菌株Bacillus sp.Za，保藏号为：CCTCCNO：M2014050。

本发明所述二苯醚类除草剂降解菌固定化小球的制备方法，包括如下步骤：

(1)将菌种活化后挑取单菌落于进行培养，离心收集具体重悬菌体，菌悬液待用；

(2)将吸附剂活性炭与步骤(1)重悬后的菌悬液充分混合，加入包埋剂海藻酸钠，混匀，将混合物滴入CaCl

其中，步骤(1)所述菌悬液OD

作为优选，步骤(1)所述菌悬液OD

进一步地，步骤(1)将菌株Bacillus sp.Za新鲜菌液接入液体LB培养基中，30℃、180rpm培养12h至对数生长期，5000rpm、10min离心收集菌体，以无菌水洗涤3次，适量无菌水重悬菌体，菌悬液浓缩至OD600＝1.5待用。

其中，步骤(2)所述将吸附剂活性炭与步骤(1)重悬后的菌悬液充分混合，加入包埋剂海藻酸钠，混匀；整体混合物体系中活性炭添加浓度范围为质量分数2.5％-7.5％，海藻酸钠添加的浓度范围为质量分数1％-3％，菌株菌悬液添加浓度范围为质量分数5％-15％。

作为优选，所述活性炭、海藻酸钠和菌悬液在固定化小球制备时添加的浓度分别为质量分数5％、1％、10％。

其中，步骤(2)中将混合物滴入CaCl

其中，步骤(2)中低温交联，交联时间为4-12h。

作为优选，所述交联温度为4℃。

作为优选，所述固定化小球制备时，所述氯化钙添加的浓度为质量分数3％，交联时间为12h。

作为优选，所述固定化小球制备方法为吸附剂与菌株Za菌悬液充分混合，加入包埋剂，期间放入37℃摇床混匀。将混合物逐滴滴入一定质量分数的CaCl

进一步地，利用扫描电子显微镜观察固定化小球的微观结构，将吸附剂和吸附包埋小球的表面进行对比。固定化小球以3％的接种量添加至50mg/L氟磺胺草醚的无机盐培养基中，检验其降解效果。

本发明所述的二苯醚类除草剂降解菌固定化小球的在降解土壤残留二苯醚类除草剂中的应用。

其中，所述固定化小球应用时，温度为19-33℃，pH为6.0-8.0，贮藏期为15-45d。

其中，所述二苯醚类除草剂为氟磺胺草醚。

作为优选，固定化小球最优应用条件为温度26℃，pH7.0，贮藏时间30d。

其中，菌株Za-gfp固定化小球以质量分数5％投放至红壤中，置于光照培养箱，25℃光照条件下培养16h，22℃黑暗条件下培养8h，在激光共聚焦显微镜下检测菌株Za-gfp在红壤中5d、15d、30d的定殖情况。

其中，通过平板稀释涂布法计算红壤中Za-gfp数量。

目前在固定化方法之中，包埋法将微生物固定在多聚化合物的网格内，方法简便，条件温和，同时确保微生物的生存能力，但微生物受到一定程度上的限制。吸附法是利用细胞对特定载体的亲和性，将微生物细胞直接吸附在载体表面的一种固定化方案。吸附法对微生物活力影响小，但由于细胞与载体之间的结合力较弱，容易脱落。本发明通过特定方法联合应用两种固定化方法，并用于特定菌株Za固定化降解土壤中残留二苯醚类除草剂，旨在为氟磺胺草醚微生物修复的工程化应用提供数据支撑。

有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下优点：

本发明首次以二苯醚类除草剂高效降解菌株Bacillus sp.Za为基础，设计出一种采用吸附-包埋复合方式对菌株Za固定化的方法。本发明通过试验进行筛选优化，兼具成本考虑和应用效果，得到固定化小球最佳吸附剂、包埋剂及其配比，最佳的氯化钙浓度和交联时间，以及最优应用条件。本发明中的固定化小球制备方法可以能够弥补液态菌剂耐毒性弱、易流失等使用缺陷，提高微生物活性和环境适应性，同时具有处理效率高、稳定性强等优势，有利于拓展菌株Za的应用条件，实现土壤除草剂污染的原位修复。

本发明的菌株Za固定化小球，在制备时采用特定的制备条件，活性炭添加浓度为质量分数5％，海藻酸钠活添加浓度为质量分数1％，菌悬液添加浓度为质量分数10％，氯化钙添加浓度为质量分数3％，交联时间范围为12h。固定化小球最优应用条件为温度26℃，pH7.0，贮藏时间30d。在扫描电子显微镜下观察，固定化小球菌体紧密附着，孔网致密均一。在激光共聚焦显微镜下观察，固定化小球在红壤中能够迅速释放菌体并稳定定殖。

本发明成果对推进二苯醚类除草剂残留土壤微生物修复的应用具有积极意义。

附图说明

图1为菌株Za固定化小球的扫描电镜照片(A：活性炭；B：吸附菌体后的活性炭；C：吸附-包埋固定化小球)；

图2为菌株Za固定化小球的降解验证实验；

图3为菌株Za-gfp的定殖实验激光共聚焦显微镜照片；

图4为红壤中固定化小球的定殖动态。

具体实施方式

以下结合附图和实施例对本发明作进一步说明。

实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

本发明中氟磺胺草醚原药购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，供试菌株为Bacillus sp.Za，2014年2月27日保藏于中国典型培养物保藏中心，菌种保藏号为：CCTCCNO：M2014050，申请人在先申请(CN104560814A)中已经提供保藏证明，由南京农业大学提供。

其中，活性炭、硅藻土、玉米秸秆、明胶、聚乙烯醇、海藻酸钠购自上海麦克林生化科技有限公司。乙腈、甲醇、乙酸等有机试剂购买自南京晚晴化玻仪器有限公司，其它试剂购自江苏辉亚生物科技有限公司。

本发明中无机盐培养基(MSM)：NH

LB培养基：酵母浸出物5.0g/L，蛋白胨10.0g/L，NaCl 10.0g/L，pH 7.0，固体培养基加入1.5％-2.0％的琼脂。

氟磺胺草醚残留的测定方法：

HPLC检测条件：高效液相色谱仪器为Thermo Scientific Ultimate 3000，色谱柱为Thermo Scientific AcclaimTM 120 C18(5μm

实施例1

Za固定化小球最佳吸附、包埋剂的筛选

为了确定固定化小球最佳吸附、包埋剂，进行单因素实验。实验设置2个因素(吸附剂、包埋剂)，每个因素设置3个水平。以固定化小球的成型状态、制备难易程度、机械强度和传质性能为考察指标，筛选最优吸附剂和包埋剂。

在吸附剂选用活性炭的条件下，选用包埋剂分别为明胶、聚乙烯醇、海藻酸钠，制备不同类型的固定化小球。

在吸附剂选用硅藻土的条件下，选用包埋剂分别为明胶、聚乙烯醇、海藻酸钠，制备不同类型的固定化小球。

在吸附剂选用玉米秸秆的条件下，选用包埋剂分别为明胶、聚乙烯醇、海藻酸钠，制备不同类型的固定化小球。

按照以下步骤制备固定化小球：

其中Za菌种活化后挑取单菌落于液体LB试管培养基中培养至对数期，以体积比1％接种量接入液体LB培养基三角瓶中，置于30℃、180rpm恒温摇床中培养12h，5000rpm、10min离心收集菌体，以无菌水洗涤3次，适量无菌水重悬菌体，菌悬液浓缩至OD

将吸附剂(活性炭、硅藻土、玉米秸秆)按照终浓度2.5％的质量分数与Za菌悬液充分混合，在37℃摇床150rpm混匀半小时。继续加入各包埋剂(明胶、聚乙烯醇、海藻酸钠)至质量分数为2.5％，再次在37℃摇床150rpm混匀半小时。用2.5mL注射器吸取混合物，逐滴滴入CaCl

固定化小球物理指标测定方法：

(1)小球粒径：随机选取10颗固定化小球排列，游标卡尺测量总长，实验设置三个重复，计算平均粒径。

(2)机械强度：随机选取20颗固定化小球置于125mL锥形瓶，加入50mL去离子水，置于涡旋仪震荡1h，观察完好小球占原小球总数的比率，表示小球的强度系数。

(3)传质性能：随机选取20颗固定化小球，投放于50mL自制红墨水(50mL水中加0.1mL红墨水)中，前期每隔1min剖开任意小球观察红墨水浸染情况，后期逐渐缩短时间间隔观察剖面，记录剖面被红墨水完全渗透时间。

表1吸附、包埋剂筛选的单因素试验结果

由表1可知，从固定化小球的物理性能、降解效果及材料成本考虑，活性炭-海藻酸钠是较为适宜的固定化方法。活性炭的采购成本适中，能够与菌悬液快速混合均匀，制备简单，大小适中。海藻酸钠的成球率好，机械强度大，传质性能也表现良好。制得的固定化小球平均粒径约3.38mm，无拖尾、溃破等不良现象，机械强度系数为100％，多次取放不易破损，传质速度为2min，在空气或水中均易保存。

实施例2

菌株Za固定化方案的优化

根据实施例1的结果，选取吸附剂质量分数、包埋剂质量分数、菌液质量分数三个影响因素，每个因素选取3个水平，进行三因素三水平L9(3

选取(A)活性炭作为吸附剂，设置加入体系后其质量分数分别为2.5％、5％、7.5％，作为三个水平；(B)海藻酸钠作为包埋剂，设置加入体系后质量分数分别设置为1％、2％、3％，作为三个水平；体系中OD

表2固定化条件正交表

由表2可知，根据R值可以看出，各因素对底物降解率的影响主次顺序为：海藻酸钠质量分数＞活性炭质量分数＞菌液质量分数。最优水平为A

实施例3

氯化钙浓度及交联时间的优化

根据实施例2的结果，选取最适吸附-包埋比制备固定化小球，其他条件按实施例2一致情况下设置氯化钙浓度分别为1％、3％、5％，交联时间分别为4h、8h、12h，大小重量相似固定化小球按50颗/100mL到50mg/L氟磺胺草醚的无机盐培养基中，30℃，180rpm培养48h，利用HPLC检测降解效果。分别探究氯化钙浓度和交联时间对小球降解效率的影响，以确定最佳固定化条件，结果如表3所示。

表3交联浓度及交联时间表

由表3可知，氯化钙浓度为3％，交联时间为12h时，底物降解效率最高。至此，可以确定二苯醚类除草剂降解菌Bacillus sp.Za的最优固定化条件为：吸附剂活性炭质量分数5％，包埋剂海藻酸钠质量分数1％，菌液质量分数10％，氯化钙浓度3％，交联时间12h，该条件下制得的固定化菌株的氟磺胺草醚降解率为79.95％。

实施例4

固定化小球的微观结构表征

根据实施例3最优参数制备菌株Za固定化小球，利用扫描电子显微镜(SEM，日立S-3000N)观察其微观结构，通过吸附剂和吸附包埋小球的表面对比进一步阐述固定化菌株的可行性。

SEM观察前作如下处理：(1)样品用0.1M磷酸缓冲液清洗3遍后，浸泡于2.5％的戊二醇固定液中，保存于冰箱(4℃)进行预固定。(2)样品逐次浸泡于30％、50％、100％的乙醇溶液中进行逐级脱水，每次10分钟，放置于冰箱冻层(-20℃左右)过夜。(3)样品取出后置于烘箱烘干约12h，将样品粘附在具有双面胶带的样品台上，最后放置在扫描电子显微镜下观察。

吸附剂活性炭的表面微观结构如图1(A)所示，对于微生物细胞的固定化，载体的结构直接影响固定化微生物细胞的生物活性，活性炭微观视野下凹凸不平、粗糙多孔，为细胞的吸附、着生提供了天然的场所。活性炭吸附菌体(即实施例3的最优的方法，活性炭与Za菌悬液充分混合12h)后的微观结构如图1(B)所示，与菌体充分混合后，活性炭上吸附大量杆状菌体，活性炭对于菌体有一定的保护作用。经吸附-包埋固定化处理后交联得到的小球剖面结构如图1(C)所示，经海藻酸钠包埋后，小球内部结构和菌体分布更加紧实密集，这种结构不仅可以保护小球内部环境稳定，也有助于内部微生物有效获取溶解氧和营养物质，是保证固定化小球较高降解率的重要因素。

实施例5

固定化小球降解效果的验证

按照实施例3最优参数制备固定化小球，将其与相应质量分数的活性炭吸附法和海藻酸钠包埋法制备的小球作对比。其中，各个制备不同在于：按照实施例1对菌株Za活化并制备菌悬液，使其OD

活性炭吸附法小球制备时，将活性炭以5％的质量分数与Za菌悬液在37℃摇床150rpm充分混合半小时，无菌纱布过滤取出小球，用无菌水洗涤3次备用。海藻酸钠包埋法小球制备时，将海藻酸钠以1％的质量分数与Za菌悬液在37℃摇床150rpm充分混合半小时，用2.5mL注射器吸取混合物，逐滴滴入CaCl

实验设置以下处理：(1)Za菌悬液+50mg/L氟磺胺草醚；(2)5％活性炭吸附法制备小球+50mg/L氟磺胺草醚；(3)1％海藻酸钠包埋法制备小球+50mg/L氟磺胺草醚；(4)5％活性炭和1％海藻酸钠吸附包埋法制备小球(实施例3最优参数制备固定化小球)+50mg/L氟磺胺草醚。其中，处理(2)、(3)、(4)中投入量小球的含菌量与处理(1)中加入的游离菌液量相同。每隔12h取样测定氟磺胺草醚残留量，验证最优固定化方案下小球的降解效果。于30℃、180rpm培养，每隔12h取样，利用HPLC测定小球对氟磺胺草醚的降解效率，进行固定化小球降解效果的验证。

结果如图2所示，添加外源菌株Za均能够对氟磺胺草醚产生降解作用，固定化菌株的降解效果整体优于游离菌。其中，在降解过程的前12h，吸附法比包埋法小球降解更多的氟磺胺草醚，24h后包埋法降解效果更好，推测原因在于包埋法小球内的菌体需要一定时间通过包埋剂。所筛选的最优固定化条件下的吸附包埋法制备的小球在60h内降解效果始终优于其它处理，60h达到80.20％；并且降解速度快，36h就超过了包埋或者吸附法60h的效果，处理效率高。

实施例6

固定化小球最优应用条件的优化

按照实施例3最优参数制备固定化小球，选取温度、pH、贮藏期三个影响因素，每个因素选取3个水平，进行三因素三水平L9(3

设置温度(A)分别为19℃、26℃、33℃，作为三个水平；pH(B)分别为6.0、7.0、8.0，作为三个水平；贮藏期(C)分别为15d、30d、45d，作为三个水平。制备的固定化小球按50颗/100mL施加到50mg/L氟磺胺草醚的无机盐培养基中，在不同条件下培养48h，利用HPLC检测降解效果，实验设置3次重复，结果如表4所示。

表4最优应用条件正交表

如表4所示，根据R值可以看出，各因素对底物降解率的影响主次顺序为：温度＞pH＞贮藏期，当温度为26℃，pH为7.0，贮藏时间为30d时，底物降解率为77.34％。以氟磺胺草醚降解效率为考察指标，结合影响因素的显著程度，综合确定固定化小球的最优应用条件，即：26℃，pH＝7.0，贮藏时间30d，同时说明本发明的固定化小球稳定性强。

实施例7

固定化小球的定殖实验

以Za-gfp(本实验构建，含有博来霉素抗性基因和gfp基因，可以稳定定殖于土壤和作物根系表面形成生物膜)为供试菌株，构建方法参考：Zhao G,Tian Y,Yu H,Li J,MaoD,Faisal RM and Huang X(2022).Development of solid agents of the diphenylether herbicide degrading bacterium Bacillus sp.Za based on a mixed organicfertilizer carrier.Front.Microbiol.13:1075930.doi:10.3389/fmicb.2022.1075930。

按照实施例3最优条件制备菌株Za-gfp固定化小球，按照实施例1对菌株Za-gfp活化并制备菌悬液，菌悬液浓缩至OD600＝1.5待用，将其分别投放至红壤中。

其中，供试土壤为红壤，采自江西省赣州市瑞金市(25.84′N,115.90′E)。土壤性状如下：pH 6.45，有机质15.43g/kg干土，全氮1.79g/kg干土，全磷0.69g/kg干土，全钾17.43g/kg干土，碱解氮12.79mg/kg干土，碱解磷22.5mg/kg干土，速效钾42mg/kg干土。

实验设置以下处理：(1)红壤+50mg/kg氟磺胺草醚+质量分数5％游离菌株Za-gfp；(2)红壤+50mg/kg氟磺胺草醚+固定化Za-gfp。其中，处理(2)中投入量小球的含菌量与处理(1)中加入的游离菌液量相同。实验设置三组重复，将处理组置于光照培养箱(25℃光照条件下培养16h，22℃黑暗条件下培养8h)，每5d定时取样10g，共取30d。取5d、15d、30d的土壤收集液制片，倒置于激光共聚焦显微镜(Leica TCS SP3)下观察。激发光波长为488nm，收集信号范围为480-525nm，检测菌株Za-gfp在红壤中的定殖情况。平板稀释涂布法计算红壤中Za-gfp数量。

5d、15d、30d样品置于激光共聚焦显微镜下观察结果如图3所示。加入菌株Za-gfp处理的红壤收集液呈现明显的绿色荧光，说明固定化小球中的活菌可以得到有效释放。自第5d起，菌株Za已经初步从固定化小球内通过凝胶表面扩散至外界土壤环境，荧光量较为微弱；自15d起，细菌通过内外物质交换达到了较高的生物活性，活菌迅速释放生长并稳定定殖于土壤，荧光范围大、强度高，定殖时长达到30d以上。

如图4所示，添加游离菌株的处理组在接种后能够检测到细菌定殖数量稳定增长，在15d时达到最高值，此后开始呈下降趋势。添加固定化小球的处理组在实验前期经历了约10d的适应期，呈缓慢增长趋势，但总体数目低于游离菌，20d后开始超过游离菌，25d时逐渐平稳，30d时细菌定殖数量达到3.80×10