栖植物潘隆尼亚碱湖杆菌、包含其的组合物、制备与应用

技术领域

本发明涉及环境微生物技术领域，尤其涉及一种栖植物潘隆尼亚碱湖杆菌、包含其的组合物、制备与应用。

背景技术

多溴联苯醚(PBDES)因其优良的阻燃性能、稳定的物化性质、价廉易得而被广泛应用于石油化工、电子器件等工业中。PBDES化学性质稳定、亲脂性强、不溶于水、对暴露于此类污染物的生物体具有内分泌干扰效应和神经毒性。属PBDES类的化合物众多，但在商业生产中主要以十溴联苯醚(BDE-209)为主，BDE-209已成为全球范围内使用量最大的溴系阻燃剂。据不完全统计，我国平均每年使用约2000-4000万公斤商用BDE-209，主要集中在电子垃圾拆解地及周边区域。

PBDES由于使用量庞大、使用时间悠久，通过全球活动在大气、水体、沉积物或土壤广泛分布。生物体通过接触、摄食等方式使得PBDES进入食物链，最终危害人体健康。PBDES急性毒性较低，但经过食物链的富集作用后最终对生物体产生毒性效应，主要集中在甲状腺毒性、神经毒性、生殖发育毒性等。PBDES是一种内分泌干扰物，影响甲状腺激素平衡、干扰免疫系统正常工作。电子垃圾拆解场地中PBDES污染已严重危害人类生存和健康发展，亟待修复处理。

目前对PBDES处理去除技术主要包括生物降解法、光降解法、零价铁还原降解法和多种方法联合处理等，均存在降解效率较低的问题。其中，生物降解法具有绿色无污染等优点，但目前为止，单一微生物耐受BDE-209浓度低，降解有机物效率普遍较低。

发明内容

本发明的主要目的是提供一种栖植物潘隆尼亚碱湖杆菌、包含其的组合物、制备与应用，旨在解决现有技术栖植物潘隆尼亚碱湖杆菌对锰的氧化能力差，十溴联苯醚降解效率较低等问题。

为实现上述目的，本发明提供一种栖植物潘隆尼亚碱湖杆菌，所述栖植物潘隆尼亚碱湖杆菌，命名为MnO-3，属于潘隆尼亚碱湖杆菌属(Pannonibacter)，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏日期为2023年4月27日，保藏编号为CGMCC No.27230。

本发明还提供了一种如上所述的栖植物潘隆尼亚碱湖杆菌对锰的氧化的应用。

本发明还提供了一种锰氧化物/栖植物潘隆尼亚碱湖杆菌组合物，包括无定型态锰氧化物和如上所述的栖植物潘隆尼亚碱湖杆菌；其中，所述无定型态锰氧化物与所述栖植物潘隆尼亚碱湖杆菌聚合成块状。

本发明还提供了一种如上所述的组合物的制备方法，包括：

每100mL锰氧化菌离子培养基以1～10％的接种量接种如上所述的栖植物潘隆尼亚碱湖杆菌，于25～35℃下振荡培养5～10d，得所述锰氧化物/栖植物潘隆尼亚碱湖杆菌组合物；其中，所述锰氧化菌离子培养基中包括0.1～4mmol/LMn

进一步地，所述锰氧化菌离子培养基具体包括1g/L酵母提取物，1g/L酸水解酪蛋白，1g/L葡萄糖，0.222g/L CaCl

进一步地，所述微量元素溶液包括10mg/L CuSO

本发明还提供了一种如上所述的栖植物潘隆尼亚碱湖杆菌在处理有机物废水中的应用；所述有机物废水中包括十溴联苯醚。

本发明还提供了一种如上所述的组合物在处理有机物废水中的应用；所述有机物废水中包括十溴联苯醚。

本发明达到的有益效果：

本发明筛选得到的栖植物潘隆尼亚碱湖杆菌对有机物十溴联苯醚降解效率较高，耐受十溴联苯醚浓度高，对环境适应性较高；且其锰氧化能力强，具有较高的研究价值。

本发明所提供的锰氧化物/栖植物潘隆尼亚碱湖杆菌组合物的制备方法简单易操作、成本低、绿色无污染。且应用该组合物降解十溴联苯醚效率较高，有利于在降解有机物领域大规模应用。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图示出的结构获得其他的附图。

图1为本发明实施例2中锰氧化物/栖植物潘隆尼亚碱湖杆菌组合物的不同放大倍数SEM图；其中，(a)为放大6000倍的SEM图(b)为放大13000倍的SEM图；

图2为本发明实施例2中锰氧化物/栖植物潘隆尼亚碱湖杆菌组合物的TEM图；其中，(a)为组合物的TEM图(比例尺，2μm)，(b)为(a)的局部放大TEM图(比例尺，500nm)；

图3为本发明实施例实施例1中栖植物潘隆尼亚碱湖杆菌的系统发育分析树；

图4为本发明实施例2中锰氧化物/栖植物潘隆尼亚碱湖杆菌组合物的XRD图；

图5为本发明实施例2中锰氧化物/栖植物潘隆尼亚碱湖杆菌组合物的HRTEM图；

图6为本发明实施例2中锰氧化物/栖植物潘隆尼亚碱湖杆菌组合物的XPS图；

图7为本发明实施例3中栖植物潘隆尼亚碱湖杆菌不同pH下的生长曲线和pH变化图；其中，(a)为其生长曲线图；(b)为其pH变化图；

图8为本发明实施例3中栖植物潘隆尼亚碱湖杆菌在不同pH下的剩余Mn(II)浓度图；

图9为本发明实施例3中栖植物潘隆尼亚碱湖杆菌在不同接菌量下的生长曲线和剩余Mn(II)浓度图；其中，(a)为其生长曲线图；(b)为其剩余Mn(Ⅱ)浓度图；

图10为本发明实施例3中栖植物潘隆尼亚碱湖杆菌在不同Mn

图11为本发明实施例4中锰氧化物/栖植物潘隆尼亚碱湖杆菌组合物(MnO-3+Mn)实验组、栖植物潘隆尼亚碱湖杆菌(MnO-3)实验组、空白对照(CK)组对5mg/L十溴联苯醚的降解率对比图和Mn(II)去除率对比图；其中，(a)为其降解率对比图；(b)为其去除率对比图。

本发明目的的实现、功能特点及优点将结合实施方式，参照附图做进一步说明。

具体实施方式

下面将结合本发明实施方式中的附图，对本发明实施方式中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施方式仅仅是本发明的一部分实施方式，而不是全部的实施方式。基于本发明中的实施方式，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本发明保护的范围。

需要说明，在不冲突的情况下，以下实施例及实施例中的特征可以相互组合。还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。

除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。本领域技术人员应当知道的是，作为对本申请文件的一种说明，在不影响对本申请技术方案实际理解的情况下，“TEM”可以表示为透射电子显微镜，“XRD”可以表示为X射线衍射仪，“HRTEM”可以表示为高分辨透射电子显微镜”，“XPS”可以表示为X射线光电子能谱仪，“Intensity/(a.u.)”可以表示为强度，“2θ/degree”可以表示为衍射角，“Intensity(a.u.)”可以表示为强度，“Bindingenergy(ev)”可以表示为结合能，“satellite”可以表示为卫星峰，“OD

当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件，或者按照各制造商所建议的条件。下列实施例中所需要的材料或试剂，如无特殊说明均为市场购得。

为了解决现有技术栖植物潘隆尼亚碱湖杆菌对锰的氧化能力差，十溴联苯醚降解效率较低等问题，本发明提供了一种栖植物潘隆尼亚碱湖杆菌，栖植物潘隆尼亚碱湖杆菌，命名为MnO-3，属于潘隆尼亚碱湖杆菌属(Pannonibacter)，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏日期为2023年4月27日，保藏编号为CGMCCNo.27230。

具体地，可以采集湖南省长沙市湘潭锰矿场的土壤样本。取该土壤样本静置后的上清液，加入到含MnSO

本发明筛选得到的栖植物潘隆尼亚碱湖杆菌对有机物十溴联苯醚降解效率较高，耐受十溴联苯醚浓度高，对环境适应性较高；且其锰氧化能力强，具有较高的研究价值。

本发明还提供了一种如上的栖植物潘隆尼亚碱湖杆菌对锰的氧化的应用。具体地，可以在pH值为5～8的100mL锰氧化菌离子培养基上以1～10％的接种量接种筛选出的栖植物潘隆尼亚碱湖杆菌，采用电感耦合等离子体发射光谱仪(ICP-OES)测定上清液剩余Mn

本发明还提供了一种锰氧化物/栖植物潘隆尼亚碱湖杆菌组合物，包括无定型态锰氧化物和如上的栖植物潘隆尼亚碱湖杆菌；其中，无定型态锰氧化物与栖植物潘隆尼亚碱湖杆菌聚合成块状。

本发明还提供了一种如上的组合物的制备方法，包括：

每100mL锰氧化菌离子培养基以1～10％的接种量接种如上的栖植物潘隆尼亚碱湖杆菌，于25～35℃下振荡培养5～10d，得锰氧化物/栖植物潘隆尼亚碱湖杆菌组合物；其中，锰氧化菌离子培养基中包括0.1～4mmol/L Mn

具体地，当接种量<1％时，微生物生长较慢，生物成因锰氧化物生成速率慢；当接种量>10％时，溶氧不足，引入代谢废物较多，影响氧化速率。当锰氧化菌离子培养基中Mn

进一步地，锰氧化菌离子培养基具体包括1g/L酵母提取物，1g/L酸水解酪蛋白，1g/L葡萄糖，0.222g/L CaCl

本发明所提供的锰氧化物/栖植物潘隆尼亚碱湖杆菌组合物的制备方法简单易操作、成本低、绿色无污染。

进一步地，微量元素溶液包括10mg/L CuSO

本发明还提供了一种如上的栖植物潘隆尼亚碱湖杆菌在处理有机物废水中的应用；有机物废水中包括十溴联苯醚。本发明筛选得到的栖植物潘隆尼亚碱湖杆菌对有机物十溴联苯醚降解效率较高，耐受十溴联苯醚浓度高，对环境适应性较高。

本发明还提供了一种如上的组合物在处理有机物废水中的应用；有机物废水中包括十溴联苯醚。相比其他研究中的细菌降解十溴联苯醚的浓度，该组合物对5mg/L的十溴联苯醚降解率达到了50％以上，说明该组合物对环境适应性良好，去除降解其他有机污染物的潜力巨大，可在有机物污染领域方面广泛应用。

为对本发明作进一步的理解，现举例说明：

实施例1

栖植物潘隆尼亚碱湖杆菌的筛选、分离与纯化

1、LB液体培养基的配制：

称取酵母提取物5g，胰蛋白胨10g，氯化钠10g，加入蒸馏水1000ml，调节pH为7，分装于250ml锥形瓶中100ml，于高压灭菌锅121℃下灭菌20min，使用0.22μm无菌滤头过滤后加入3ml 100mmol/L的MnSO

2、固体培养基配制：

将酵母提取物5g，胰蛋白胨10g，氯化钠10g和琼脂15g溶于1000ml蒸馏水中，调节pH为7，于高压灭菌锅下灭菌20min，使用0.22μm无菌滤头过滤加入3ml 100mmol/L的MnSO

3、栖植物潘隆尼亚碱湖杆菌的筛选和分离：

从湖南省湘潭锰矿场中采集土壤，静置后取上清污泥液，按1％的接种量加入到步骤1、中的LB液体培养基中，在30℃、150rpm的恒温摇床上振荡培养7d后，在含有3mmol/LMnSO

其中，LBB指示剂的配制方法如下：称取0.04g的LBB粉末，将其溶解于0.25ml的冰乙酸水溶液(45mmol/L)，加入去离子水并定容至100ml，于4℃避光保存。

4、栖植物潘隆尼亚碱湖杆菌的纯化

将步骤3中对LBB指示剂显蓝色的培养液稀释涂布分离于步骤2、中的固体培养基中，置于30℃恒温培养箱中恒温培养，进行纯化，将纯化得到的菌株与50％甘油按1∶1混匀后保藏在-80℃的冰箱中。

实施例2

锰氧化物/栖植物潘隆尼亚碱湖杆菌组合物的制备、表征和菌的分子鉴定

1、锰氧化物/栖植物潘隆尼亚碱湖杆菌组合物的制备

(1)锰氧化菌离子培养基配制：

参照淡水系统分离得到的锰氧化菌适配培养基—Leptothrix培养基，在此基础上作一定程度的修改，即:称取酵母提取物1g/L，酸水解酪蛋白1g/L，葡萄糖1g/L，CaCl

(2)锰氧化物/栖植物潘隆尼亚碱湖杆菌组合物的生成

选取250mL容量瓶，加入100mL步骤(1)中配制的锰氧化物成矿培养基。按1％的接种量加入实施例1中得到的栖植物潘隆尼亚碱湖杆菌至该锰氧化菌离子培养基中，放置于30℃、150rpm恒温摇床中振荡培养7d后，8000rpm离心3min后，弃去上清液，去离子水洗涤3次，所得沉淀即为锰氧化物/栖植物潘隆尼亚碱湖杆菌组合物。

2、表征分析

上述步骤1、得到的锰氧化物/栖植物潘隆尼亚碱湖杆菌组合物的SEM图如图1所示，其中，图1(a)为放大6000倍的SEM图，图1(b)为放大13000倍的SEM图。该锰氧化物/栖植物潘隆尼亚碱湖杆菌组合物的TEM图如图2所示，其中，图2(a)为组合物的TEM图(比例尺，2μm)，图2(b)为图2(a)的局部放大TEM图(比例尺，500nm)。

据图1和图2观察可知，该栖植物潘隆尼亚碱湖杆菌菌株整体呈杆状，长度700nm左右，直径312nm左右。锰氧化物/栖植物潘隆尼亚碱湖杆菌组合物中，栖植物潘隆尼亚碱湖杆菌与锰氧化物矿物颗粒聚合在一起形成较大的块状。且该锰氧化物/栖植物潘隆尼亚碱湖杆菌组合物的表面凹凸不平，可提供更多的附着位点。

将该锰氧化物/栖植物潘隆尼亚碱湖杆菌组合物进行XRD以及XPS分析，其XRD图、HRTEM图和XPS图分别如图4、图5、图6所示。从图4和图5可知，锰氧化物/栖植物潘隆尼亚碱湖杆菌组合物中的锰氧化物呈无定型状态，XRD无衍射峰，衍射条纹混乱无序。而且，无晶型的生物锰氧化物相比晶型明显的化学锰氧化物具有更强的反应活性。从图6的XPS图分析可得，该锰氧化物高价锰(Ⅲ、Ⅳ)含量为54.53％，高于Mn(Ⅱ)45.46％，氧化能力较强。

3、分子鉴定和系统发育进化树比对：

对实施例1中分离出来的栖植物潘隆尼亚碱湖杆菌进行DNA提取和测序，该过程全程由深圳微科盟科技集团有限公司完成。将测序得到的16S rRNA结果通过NCBI(美国国立生物技术信息中心)的Blast程序与已有16S rRNA核酸序列进行相似性对比。采用Mega11.0软件进行系统发育进化树的分析与绘制，其系统发育进化树见图3。

序列结果显示，该株锰氧化菌与Pannonibacter phragmitetus相似性最高，鉴定其属于潘隆尼亚碱湖杆菌属，并命名为MnO-3。

实施例3

栖植物潘隆尼亚碱湖杆菌的生理特性

1、栖植物潘隆尼亚碱湖杆菌(MnO-3)在不同pH下的锰氧化能力

选取250ml锥形瓶，参照实施例2中步骤(1)的方式配制100ml锰氧化菌离子培养基，分别调节pH为5、6、7、8。按5％的接种量加入MnO-3于锰氧化菌离子培养基中，于30℃、150rpm恒温摇床中振荡培养；定时取样，8000rpm离心3min后，0.22μm滤头过滤。电感耦合等离子体发射光谱仪(ICP-OES)测定上清液剩余Mn

pH为5、6、7、8下的MnO-3生长曲线图和pH变化图如图7所示；其中，图7(a)为其生长曲线图；图7(b)为其pH变化图。从图7中可以看出，不同pH对MnO-3的生长活性几乎没有影响，在经历12h时刻的pH值降低之后，随着时间的推移最终pH值都达到了8.7左右。

在不同pH下的的剩余Mn(II)浓度图如图8所示。分析图8结果可知，在pH＝7的条件下，Mn(Ⅱ)的去除效果最好，达到了80％的去除率。

2、MnO-3在不同接菌量下的锰氧化能力

选取250ml锥形瓶，参照实施例2中步骤(1)的方式配制100ml锰氧化菌离子培养基，调节pH值为7，分别按照1％、2％、5％、10％的接菌量加入实施例1筛选的栖植物潘隆尼亚碱湖杆菌于该锰氧化菌离子培养基中，于30℃、150rpm恒温摇床中振荡培养；定时取样，8000rpm离心3min后，0.22μm滤头过滤。电感耦合等离子体发射光谱仪(ICP-OES)测定上清液中剩余Mn

不同接菌量下的生长曲线和剩余Mn(Ⅱ)浓度图结果如图9所示；其中，图9(a)为其生长曲线图；图9(b)为其剩余Mn(Ⅱ)浓度图。由图9可知，MnO-3在不同接菌量下都在10h左右达到OD600值为1，不同接菌量对微生物(栖植物潘隆尼亚碱湖杆菌)的生长活性几乎没有影响。但是，不同接菌量对Mn(Ⅱ)的去除率影响显著，在10％接菌量下的Mn(Ⅱ)去除效果最好，达到了84.4％。

3、MnO-3在不同Mn

选取250ml锥形瓶，参照实施例2中步骤(1)的方式，仅改变其中Mn

不同Mn

实施例4

栖植物潘隆尼亚碱湖杆菌、锰氧化物/栖植物潘隆尼亚碱湖杆菌组合物对有机物十溴联苯醚的氧化降解实验

选取250ml锥形瓶，参照实施例2中步骤(1)的方式，改变其中Mn

选取250ml锥形瓶，参照实施例2中步骤(1)的锰氧化菌离子培养基的配制方式，不添加Mn

选取250ml锥形瓶，参照实施例2中步骤(1)的方式，改变其中Mn

分别对上述三组锥形瓶定时取样，取样后对样品进行预处理，以满足十溴联苯醚测定条件。即：样品以8000rpm的速度离心3min，上清液经0.22μm滤头过滤后，以体积比为1：1的正己烷和二氯甲烷作为萃取剂，样品与萃取剂1：1体积比萃取10min，重复三次，合并有机相。在超高效液相色谱(Acquity UPLC H-class)，流动相为甲醇：水＝95：5，流速0.3mL/min，进样量10μL，检测波长233nm，保留时间5min。

各组对5mg/L十溴联苯醚的降解率和Mn(Ⅱ)去除率如图11所示；其中图11(a)为其降解率对比图；图11(b)为其去除率对比图。从图11中可以看出，培养7d后，MnO-3+Mn实验组的降解效果最好，CK组尚未出现降解效果。直到培养至11d，在Mn

综上所述，本发明的上述技术方案中，以上仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是在本发明的技术构思下，利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构变换，或直接/间接运用在其他相关的技术领域均包括在本发明的专利保护范围。