一种组合模块及其在提高固氮微生物抗逆能力中的应用

技术领域

本发明涉及合成生物学领域，具体地，涉及一种组合模块、一种重组表达载体、一种转化体和一种提高农作物耐高温和耐干旱的特性的方法。

背景技术

植物根际的复杂环境是影响固氮微生物在农业中广泛应用的主要限制因素。研究表明，高温、盐碱和干旱等逆境条件限制了固氮微生物的田间生存能力和固氮活性。因此在固氮微生物底盘中构建抗逆基因模块对于提升菌株的耐高温、抗盐碱和耐干旱能力具有重要的农业应用价值。

利用定向进化技术、基因工程技术和生物过程技术等手段虽然能够提高微生物的抗逆性。例如，CN104059937A公开了一个来源于苜蓿的蛋白质及其编码基因的新用途，并提供了一种新用途：利用MtWRKY76的编码核酸分子培育结瘤能力高和/或耐逆性高的转基因结瘤植物的方法。但是上述方法存在耗时长、成本昂贵、通用性差和智能化程度低等缺陷。利用合成生物学的手段，将外源抗逆元件进行整合，构建人工抗逆组合模块，是提高固氮微生物的抗逆特性、实现其在农业广泛应用的新策略和新途径。目前已公开的通过合成生物学方法获得的固氮菌虽然能够有效提高植物的固氮效果但是对于逆境条件的耐受表现较差或仅对单一条件具有耐受能力。

因此，需要利用合成生物学手段在固氮微生物底盘中构建能够提高固氮微生物抗逆能力的人工组合模块，用于高效抗逆固氮体系的构建。

发明内容

本发明的目的是利用合成生物学手段在固氮微生物底盘中构建能够提高固氮微生物抗逆能力的人工组合模块，用于高效抗逆固氮体系的构建。

为了实现上述目的，本发明提供了一种组合模块及其在提高固氮微生物抗逆能力中的应用，具体地，提供了一种组合模块、一种重组表达载体、一种转化体和一种提高农作物耐高温和耐干旱的特性的方法。

本发明第一方面提供了一种组合模块，该组合模块在从上游到下游的方向上依次包括组成型启动子元件Pc、选自假单胞菌属的RNA聚合酶σ因子

可选地，所述组合模块的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

可选地，所述组成型启动子元件Pc的核苷酸序列为SEQ ID NO：1中第1-99位的核苷酸所示；

所述功能元件

所述功能元件

本发明还提供了一种重组表达载体，该重组表达载体插入有所述组合模块，并形成表达胁迫耐受蛋白的表达框。

本发明另一方面提供了该组合模块在提高固氮微生物抗逆能力中的应用，该应用将所述组合模块导入固氮微生物，得到重组菌株。

本发明还提供了一种转化体，所述转化体中导入有所述重组表达载体。

可选地，所述转化体的宿主细胞为固氮菌。

可选地，所述固氮菌包括：固氮施氏假单胞菌A1501（

本发明还提供了一种提高农作物耐高温和耐干旱的特性的方法，将所述转化体施用给农作物。

可选地，所述农作物包含水稻、玉米和大豆中的至少一种。

通过上述技术方案，本发明通过生物合成方法，得到了Pc-

本发明的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。

附图说明

附图是用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本发明，但并不构成对本发明的限制。在附图中：

图1为人工Pc-

图2为重组表达载体Pc-

图3为底盘固氮菌株和重组工程菌株在高温条件下的存活能力测定结果图。

图4为底盘固氮菌株和重组工程菌株在干旱条件下的存活能力测定结果图。

具体实施方式

以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。

凡未注明具体实验条件的，均为按照本领域技术人员熟知的常规条件，例如“Sambrook”等分子克隆：参考实验室手册(New York: Cold Spring Harbor LaboratoryPress, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。本发明所述的“上游、下游”是针对基因的表达方向而言的上、下游。

本发明第一方面提供了一种组合模块，该组合模块在从上游到下游的方向上依次包括组成型启动子元件Pc、选自假单胞菌属的RNA聚合酶σ因子

在本优选的实施方式中，所述

在一种优选的实施方式中，所述组合模块的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。优选地，所述组合模块为Pc-

在一种优选的实施方式中，所述组成型启动子元件Pc的核苷酸序列为SEQ ID NO：1中第1-99位的核苷酸所示；

所述功能元件

所述功能元件

在本优选的实施方式中，所述人工组合模块由以下元件构成：

（1）由大小分别为600bp和897bp的

（2）启动所述抗逆模块表达的组成型启动子元件Pc，其片段大小为99 bp。

本发明还提供了一种重组表达载体，该重组表达载体插入有所述组合模块，并形成表达胁迫耐受蛋白的表达框。优选地，所述表达载体与组合模块的连接方式为无缝克隆，所述表达载体末端和所述组合模块的引物末端应具有15-20个同源碱基，由此得到的PCR产物两端便分别带上了15-20个与载体序列同源性的碱基组成的同源臂，依靠碱基间作用力互补配对成环，无需酶连即可直接用于转化宿主菌，进入宿主菌中的重组质粒依靠自身酶系将缺口修复，重组表达载体的构建示意图如图1所示，所述组合模块的阳性菌落引物扩增结果如图2所示。

在本优选的实施方式中，优选地，所述表达载体为pLAFR3，得到的重组载体为pLA-Pc-

本发明另一方面提供了一种组合模块在提高固氮微生物抗逆能力中的应用，该应用将所述组合模块导入固氮微生物，得到重组菌株。优选地，所述固氮微生物为植物根际环境中参与固氮的细菌，所述植物包括水稻、玉米、大豆。

本发明还提供了一种转化体，所述转化体中导入有所述重组表达载体。

在一种优选的实施方式中，所述转化体的宿主细胞为固氮菌。

在一种优选的实施方式中，所述固氮菌包括：固氮施氏假单胞菌A1501（

在上述优选的实施方式中，获得3个固氮重组工程菌株

本发明还提供了一种提高农作物耐高温和耐干旱的特性的方法，将所述转化体施用给农作物。

在一种优选的实施方式中，所述农作物包含水稻、玉米和大豆中的至少一种。在本优选的实施方式中，通过测定重组菌株在高温胁迫和干旱胁迫下的存活能力，比较了高温和干旱条件下底盘固氮微生物与重组固氮工程菌的存活能力。结果证明，与单抗逆模块相比，抗逆组合模块的转入能够显著提高底盘固氮微生物在逆境条件下的生存率，存活能力大约提高了2个数量级以上，如图3和图4所示。

以下通过实施例进一步详细说明本发明，但本发明并不因此受到任何限制。

以下实施例中所用到的原材料均可通过商购途径获得。

实施例1

构建含Pc-

本实施例包括以下方法：

1）通过人工化学合成的方法合成一个基因片段全长为1565bp 的序列

2）将广宿主表达载体pLAFR3 利用

3）将表达载体通过三亲结合或电激的方式分别转入三种不同的固氮微生物底盘（固氮施氏假单胞菌

在本实施例中，利用人工化学合成的方法获得了人工抗逆模块Pc-

实施例2

重组菌株在高温胁迫下的存活能力测定。

本实施例包括以下方法：

1）挑取固氮施氏假单胞菌

2）将过夜培养好的菌液以1%的接种量分别转接到新鲜的20mL LB，Buik's及YT液体培养基中扩大培养，培养至对数初期，OD

通过本实施例，证明了与单抗逆模块相比，组合抗逆模块能显著提高底盘固氮菌在高温条件下的存活能力，高温条件下诱导表达的人工抗逆组合模块Pc-

实施例3

重组菌株在干旱胁迫下的存活能力测定。

1）挑取固氮施氏假单胞菌

2）将过夜培养好的菌液以1%的接种量分别转接到新鲜的20mL LB，Buik's及YT液体培养基中扩大培养，分别取1 mL OD

通过本实施例，证明了与单抗逆模块相比，组合抗逆模块能显著提高底盘固氮菌在干旱条件下的存活能力，干旱条件下诱导表达的人工抗逆组合模块Pc-

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。