一管式APOE基因分型检测试剂盒及其检测方法

技术领域

本发明涉及生物医学检验技术领域，具体涉及一管式APOE基因分型检测试剂盒及一管式APOE基因分型检测方法。

背景技术

载脂蛋白E(apolipoprotein E，ApoE)是血浆中最重要的载脂蛋白之一，由299个氨基酸残基构成，分子量约为34KD，主要在肝脏合成、分泌和代谢，参与脂质运输、存储及代谢。它主要扮演胆固醇转运体的角色，是胆固醇在细胞内重新分配和在细胞间调动的关键调节因子。哺乳动物体内约有3/4的ApoE由肝脏实质细胞产生，其余由脾、脑、肺、肾、卵巢、肾上腺及肌肉的细胞或组织产生。ApoE基因位于19号染色体，由ApoE2(Cys112Cys158)、ApoE3(Cys112Arg158)和 ApoE4(Arg158Arg112)3个等位基因构成，ApoE 526C>T、ApoEA388T>C是ApoE基因主要的两种单核苷酸多态性，即526C>T（rs7412）和388T>C（rs429358），可以形成3种单倍型，分别是E2（388T-526T）、E3（388T-526C）和E4（388C-526C），共构成6种不同的基因型：3种纯合子（E2/E2、E3/E3、E4/E4）和3种杂合子（E2/E3、E2/E4、E3/E4），ApoE是一个多态性蛋白，有三个常见的异构体，即E2、E3、E4。 ApoE有3种蛋白表现型，主要表现型为E2、E3、E4 。近年来研究结果表明，ApoE基因多态性与多种疾病有关。ApoE的E4变异能导致血液胆固醇水平升高，是早发性冠心病的独立危险因素，也是动脉粥样硬化及晚发型家族性与散发型阿尔茨海默病的风险基因。中国人中E4携带者患冠心病的风险比E3/3纯合基因型高出96%。在各基因型的独立分析比较中，基因型为E2/4、E3/4、E4/4的人群都被证实比E3/3更易于患冠心病。E4基因与血浆胆固醇代谢紊乱密切相关，且可以作为动脉粥样硬化患者病情与预后判断的标准。相关研究发现，ApoE升高与动脉粥样硬化的早期形成密切相关。一项有关中国汉族人群ApoE基因多态性的研究显示，与E3/E3基因型携带者比较，E4/E4基因型携带者发生脑梗死的风险可增加2.0～2.5倍。E2具有神经保护作用，而携带E4的人群患阿尔茨海默病的风险显著增加。不同基因型，适合完全不同的降血脂治疗药物，ApoE各基因型对他汀类药物诱导的低密度脂蛋白胆固醇的降低有显著的统计学差异。分子直扩又称Direct PCR技术，直接使用未纯化的样本进行PCR扩增。该过程无需核酸纯化步骤，只需微量的原始样本作为PCR反应的模板，为DNA扩增带来前所未有的便捷，节约了大量时间和成本。在该项技术出现之前，样品的预处理是科研人员难以避免并头疼的一项工作，如组织样本的研磨、核酸的分离和纯化步骤多、时间长，不仅容易造成样本交叉污染、降解，还会增加实验的成本。

目前，临床使用的ApoE基因分型检测方法操作繁琐，判读方法复杂，不能为临床提供简单、精准的检测服务，针对现有技术，本单位发明人一直在研究通过提高灵敏度和特异性来简单而准确地诊断因ApoE基因多态性的方法。

发明内容

为解决现有技术的问题，本发明提供了一管式APOE基因分型检测试剂盒及其检测方法，实现对ApoE 526C>T和ApoE A388T>C的基因多态性快速检测，为临床提供更为简单又精准的检测服务。

本发明提供的技术方案如下：

本发明提供了一管式APOE基因分型检测试剂盒， 试剂盒包括用于检测ApoE 526C>T位点、ApoE A388T>C位点基因多态性的APOE 检测直扩反应液，样本稀释液，阳性质控品和阴性质控品； 所述的APOE 检测直扩反应液包括ApoE 526C>T正、反向引物，ApoE 526C>T探针，ApoE A388T>C正、反向引物，ApoE A388T>C探针，内参GAPDH正、反向引物，内参GAPDH探针；还包括PCR缓冲液，甜菜碱，香兰素，溴代十六烷基三甲胺,硼酸钠，MgCl

本发明所述方法中的Taq酶可以为本领域的常用Taq DNA聚合酶。

本发明所述的APOE 检测直扩反应液中的PCR缓冲液、MgCl

所述的APOE 检测直扩反应液包括：PCR缓冲液，MgCl

所述的样本稀释液包括：烯唑醇0.1~0.2mg/mL，茶皂素0.1~0.5mg/mL，丁香酚0.2~0.4mg/mL和无菌水。

所述的ApoE 526C>T正、反向引物的碱基序列分别为GGCCAGAGCACCGAGGA和GCTGCCCATCTCCTCCATC；所述ApoE 526C>T探针包括ApoE 526C探针和ApoE 526T探针，ApoE526C探针的碱基序列为ACCTGCAGAAGCGCC，ApoE 526T探针的碱基序列为ACCTGCAGAAGTGCC；

所述ApoE A388T>C正、反向引物的碱基序列分别为CACGGCTGTCCAAGGAGC和TCTGCAGGTCATCGGCATC；所述ApoE A388T>C探针包括ApoE A388T探针、ApoE A388C探针，ApoE A388T探针的碱基序列为ATGGAGGACGTGTGCG，ApoE A388C探针的碱基序列为ATGGAGGACGTGCGCG；

所述内参GAPDH正、反向引物的碱基序列分别为GAGAAGGCTGGGGCTCATTT和AGTGATGGCATGGACTGTGG，所述内参GAPDH探针的碱基序列为CCTCTGCTGATGCC。

所述的ApoE 526C探针、ApoE 526T探针、ApoE A388T探针、ApoE A388C探针、内参GAPDH探针的两端分别标记有不同的荧光报告基团和荧光淬灭基团；荧光报告基团选自FAM、HEX、ROX、JOE、VIC、TET、NED、FITC、CY3或CY5；荧光淬灭基团选自BHQ1、BHQ2、BHQ3、TAMRA、Eclipse、MGB。

本发明一个优选实施方式，所述ApoE 526C探针5’端荧光报告基团为FAM，3’端淬灭基团为MGB，ApoE 526T探针5’端荧光报告基团为VIC，3’端淬灭基团为MGB；ApoE A388T探针5’端荧光报告基团为ROX，3’端淬灭基团为MGB，ApoE A388C探针5’端荧光报告基团为JOE；内参基因荧光探针5’端荧光报告基团为CY5，3’端淬灭基团为MGB。

本发明所述的样本稀释液包含烯唑醇，茶皂素和丁香酚能更好的稀释样本细胞，消除细胞间粘连。

本发明所述APOE检测直扩反应液中还包括甜菜碱，香兰素和溴代十六烷基三甲胺。该反应液能更好的裂解样本细胞释放出更多的稳定的DNA ，和可提高DNA小沟中鸟嘌呤和胞嘧啶的水合作用，影响DNA分子结构，改变DNA灵活性，帮助DNA聚合酶沿着DNA模板延伸，进而提高扩增效率。

本发明采用了荧光定量PCR技术，对人ApoE 526C>T、ApoE A388T>C基因多态性检测，通过对样本进行处理后，采用特异性引物和荧光探针对核酸进行扩增，以实现ApoE526C>T和ApoE A388T>C基因快速检测，为临床提供更为简单又精准的检测服务。

本发明所述的ApoE基因基因NCBI数据库编号为C_000019.10，GAPDH基因NCBI数据库编号分别为和NC_000012.12。

更进一步，本发明还提供了一种APOE基因分型检测方法，其特征在于包括以下步骤：

S1. 采集检测样本：采集人口腔脱落细胞样本或人外周血样本；

S2. 在检测样本中加入200μL样本稀释液；

S3. 将稀释后的检测样本与本发明APOE基因分型检测试剂盒中的APOE 检测直扩反应液混合构成APOE 检测直扩反应体系：以稀释后的样本为检测模板，利用APOE 检测直扩反应液中的引物和探针组合进行PCR 扩增反应，针对ApoE 526C>T和ApoE A388T>C两个目标基因，选取了GAPDH作为内参基因，根据多通道的荧光探针标记实现对两个目标基因和内参基因的同时检测；

S4.对扩增产物进行荧光检测，并根据荧光曲线和Ct值直接对测试样本中ApoE526C>T和ApoE A388T>C两个目标基因的多态性进行判读，准确区分ApoE基因的E2/E2、E3/E3、E4/E4、E2/E3、E2/E4及E3/E4六种表型。

在上述步骤S3中，所述检测模板在APOE 检测直扩反应体系中的占比为10%~25%（体积百分比）。

本发明的优点：

1.本发明所述的样本稀释液包含烯唑醇，茶皂素和丁香酚能更好的稀释样本细胞，消除细胞间粘连。

2.本发明所述APOE检测直扩反应液中还包括甜菜碱，香兰素和1mM溴代十六烷基三甲胺。该反应液能更好的裂解样本细胞释放出更多的稳定的DNA ，和可提高DNA小沟中鸟嘌呤和胞嘧啶的水合作用，影响DNA分子结构，改变DNA灵活性，帮助DNA聚合酶沿着DNA模板延伸，进而提高扩增效率；

3.本发明适用样本类型有人口腔脱落细胞样本或人外周血样本。不同于其他扩增试剂盒的是，样本前处理不需提取核酸，操作简便快捷；

4.本发明利用人口腔脱落细胞或人外周血细胞稀释后直接加入到荧光定量PCR扩增体系中，利用优化的等位基因特异性PCR引物探针，通过定量PCR扩增曲线能灵敏地区分APOE基因型。该试剂盒采取了一管式qPCR反应，这不仅极大的节省了测试成本，提升了检测效率，节约了样本用量以及能够展现清晰的判读结果。而且本试剂盒由于准确、快速、成本低廉的特点可快速而准确地区分ApoE基因的E2/E2、E3/E3、E4/E4、E2/E3、E2/E4及E3/E4六种表型。

本发明提供的一管式APOE基因分型检测试剂盒及检测方法具有高灵敏度及高特异性，而且操作简便，为临床医生提供更有价值的参考，从而更好的服务临床、服务大众。

附图说明

图1为本发明试剂盒的整体结构示意图；

附图标记：1.APOE 检测直扩反应液，2.样本稀释液，3.阳性质控品，4.阴性质控品；

图2为本发明实施例2中APOE基因（E2/E2）检测PCR扩增曲线；

图3为本发明实施例2中ApoE基因（E3/E3）检测PCR扩增曲线；

图4为本发明实施例2中ApoE基因（E4/E4）检测PCR扩增曲线；

图5为本发明实施例2中ApoE基因（E2/E3）检测PCR扩增曲线；

图6为本发明实施例2中ApoE基因（E2/E4）检测PCR扩增曲线；

图7为本发明实施例2中ApoE基因（E3/E4）检测PCR扩增曲线。

具体实施方式

实施例1----提供一管式APOE基因分型检测试剂盒的制备。

如图1所示，本发明提供的一管式APOE基因分型检测试剂盒，包括用于检测ApoE526C>T位点、ApoE A388T>C位点基因多态性的APOE 检测直扩反应液，样本稀释液， 阳性质控品和阴性质控品；作为一种优先实施方式，本发明试剂盒中检测直扩反应液为400ul，样本稀释液为6mL，阳性质控品50ul，阴性质控品为50ul。

APOE 检测直扩反应液的制备：

按表1所示分别合成针对ApoE 526C>T和ApoE A388T>C两个位点的引物和探针；APOE 检测直扩反应液包括ApoE 526C>T正向引物、ApoE 526C>T反向引物、ApoE 526C>T探针、ApoE A388T>C正向引物、ApoE A388T>C反向引物、ApoE A388T>C探针、内参GAPDH正向引物、内参GAPDH反向引物、内参GAPDH探针，还包括PCR缓冲液，甜菜碱，香兰素，溴代十六烷基三甲胺,硼酸钠，MgCl

所述ApoE 526C>T探针包括ApoE 526C探针、ApoE 526T探针，所述ApoE A388T>C探针包括ApoE A388T探针、ApoE A388C探针；所述的ApoE 526C探针、ApoE 526T探针、ApoEA388T探针、ApoE A388C探针、内参GAPDH探针的两端分别标记有不同的荧光报告基团和荧光淬灭基团；荧光报告基团选自FAM、HEX、ROX、JOE、VIC、TET、NED、FITC、CY3或CY5；荧光淬灭基团选自BHQ1、BHQ2、BHQ3、TAMRA、Eclipse、MGB。

本发明ApoE 检测直扩反应液的一个优选实施例为：所述ApoE 526C探针5’端荧光报告基团为FAM，3’端淬灭基团为MGB，ApoE 526T探针5’端荧光报告基团为VIC，3’端淬灭基团为MGB；ApoE A388T探针5’端荧光报告基团为ROX，3’端淬灭基团为MGB，ApoE A388C探针5’端荧光报告基团为JOE，3’端淬灭基团为MGB；内参基因荧光探针5’端荧光报告基团为CY5，3’端淬灭基团为MGB。

表1 所述基因特异性引物探针及内参基因引物探针的核苷酸序列如下所示

本发明样本稀释液包括烯唑醇，茶皂素，丁香酚和无菌水。

本发明阳性质控品包括ApoE 526C>T野生型和突变型阳性质粒，ApoE A388T>C野生型和突变型阳性质粒，以及内参基因阳性质粒的混合质粒；

本发明阴性质控品为无菌水。

具体的试剂盒组成见表2。

表2试剂盒组分

实施例2——本发明试剂盒的使用

S1. 采集检测样本：采集人口腔拭子样本或人外周血样本；

S2. 在检测样本中加入200μL样本稀释液；

向人口腔拭子样本中或取100μL人外周全血样本加入样本稀释液200μL,制成检测模板；

S3. 将稀释后的检测样本与本发明APOE基因分型检测试剂盒中的APOE 检测直扩反应液混合，两者构成APOE 检测直扩反应体系：以稀释后的样本为检测模板，利用APOE 检测直扩反应液中的引物和探针组合进行PCR 扩增反应，针对ApoE 526C>T和ApoE A388T>C两个目标基因，选取了GAPDH作为内参基因，根据多通道的荧光探针标记实现对两个目标基因和内参基因的同时检测；

在上述步骤S3中，所述检测模板在APOE 检测直扩反应体系中的占比为10%~25%（体积百分比）。

本发明APOE 检测直扩反应具体操作如下：

（1）准备工作：

准备本发明试剂盒中的ApoE 检测直扩反应液，稀释后的样本，两者构成APOE 检测直扩反应体系。

备用的ApoE 检测直扩反应液由实施例1制备，即ApoE 检测直扩反应液中ApoE 检测直扩反应液中ApoE 526C探针5’端荧光报告基团为FAM， ApoE 526T探针5’端荧光报告基团为VIC；ApoE A388T探针5’端荧光报告基团为ROX，ApoE A388C探针5’端荧光报告基团为JOE；内参基因荧光探针5’端荧光报告基团为CY5。

（2）加样：

向八连排中分别加入2~5μL待检测模、15μL ApoE 检测直扩反应液，用纯化水补足体积至20μL，终体积为20μL每管（参见表3），盖紧管盖，瞬时低速离心，在PCR仪上进行检测。

表3.ApoE 检测直扩反应体系

（3）PCR扩增

设置PCR扩增程序温度、时间及扩增循环参数。注：不选ROX校正，淬灭基团选None，设置完毕，保存文件，运行反应程序。具体参见表4

在PCR扩增程序中，如表4所示的步骤2（扩增），在60°C荧光采集时，荧光检测通道的选择如下：FAM（APOE526C)、VIC(APOE526T)、ROX(APOE388T)、JOE(APOE388C)、CY5(内参GAPDH)。荧光检测通道的选择与ApoE 检测直扩反应液中各探针的荧光报告基团相对应。

表4参数设定

S4.对扩增产物进行荧光检测，并根据荧光曲线和Ct值直接对测试样本中ApoE526C>T和ApoE A388T>C两个目标基因的多态性进行判读，准确区分ApoE基因的E2/E2、E3/E3、E4/E4、E2/E3、E2/E4及E3/E4六种表型。

使用本发明实施例1试剂盒对20例人口腔脱落细胞样本进行一管式APOE基因分型检测，ApoE 检测直扩反应液中包括引物和探针组合，分别为ApoE 526C>T(F/R/P1/P2)、ApoE A388T>C(F/R/P1/P2)、GAPDH(F/R/P)，具体设定参见表1。ApoE 检测直扩反应液中ApoE 526C探针5’端荧光报告基团为FAM， ApoE 526T探针5’端荧光报告基团为VIC；ApoEA388T探针5’端荧光报告基团为ROX，ApoE A388C探针5’端荧光报告基团为JOE；内参基因荧光探针5’端荧光报告基团为CY5。使用本ApoE 检测直扩反应液与检测模板进行PCR扩增反应时，ApoE基因的E2/E2、E3/E3、E4/E4、E2/E3、E2/E4及E3/E4六种表型的PCR扩增曲线分别如图2至图7所示。

图2是典型的人口腔脱落细胞样本APOE基因（E2/E2）检测PCR扩增曲线，图2表明在表型E2/E2样本中ApoE 526C>T的VIC探针、A388T>C的ROX探针、GAPDH的CY5探针Ct值均≤35。

图3是是典型的人口腔脱落细胞样本APOE基因（E3/E3）检测PCR扩增曲线，图3表明在表型E3/E3样本中ApoE 526C>T的FAM探针、A388T>C的ROX探针、GAPDH的CY5探针Ct值均≤35。

图4是是典型的人口腔脱落细胞样本APOE基因（E4/E4）检测PCR扩增曲线，图4表明在表型E4/E4样本中ApoE 526C>T的FAM探针、A388T>C的JOE探针、GAPDH的CY5探针Ct值均≤35。

图5是是典型的人口腔脱落细胞样本APOE基因（E2/E3）检测PCR扩增曲线，

图5表明在表型E2/E3样本中ApoE 526C>T的FAM探针和VIC探针、A388T>C的ROX探针、GAPDH的CY5探针Ct值均≤35。

图6是是典型的人口腔脱落细胞样本APOE基因（E2/E4）检测PCR扩增曲线，

图6表明在表型E2/E4样本中ApoE 526C>T的FAM探针和VIC探针、A388T>C的ROX探针和JOE探针、GAPDH的CY5探针Ct值均≤35。

图7是是典型的人口腔脱落细胞样本APOE基因（E3/E4）检测PCR扩增曲线，

图7表明在表型E3/E4样本中ApoE 526C>T的FAM探针、A388T>C的ROX探针和JOE探针、GAPDH的CY5探针Ct值均≤35。

实施例3—— 本发明检测试剂盒准确性验证

在本发明实施2中，对20例人口腔脱落细胞样本进行一管式APOE基因分型检测，检测结果如图2~图7所示：

图2是典型的人口腔脱落细胞样本APOE基因（E2/E2）检测PCR扩增曲线。

图3是是典型的人口腔脱落细胞样本APOE基因（E3/E3）检测PCR扩增曲线。图4是是典型的人口腔脱落细胞样本APOE基因（E4/E4）检测PCR扩增曲线。图5是是典型的人口腔脱落细胞样本APOE基因（E2/E3）检测PCR扩增曲线。图6是是典型的人口腔脱落细胞样本APOE基因（E2/E4）检测PCR扩增曲线。图7是是典型的人口腔脱落细胞样本APOE基因（E3/E4）检测PCR扩增曲线。

将使用本发明一管式APOE基因分型检测试剂盒进行APOE基因检测结果与一代测序检测结果进行比较。

一代测序检测结果如表5所示：

表5.一代测序检测结果

通过实验数据表明，本发明一管式APOE基因分型检测试剂盒的检测灵敏性、特异性和准确性分别为100％、100％和100%。

综上所述，本发明提供的一管式APOE基因分型检测试剂盒及检测方法具有高灵敏度及高特异性，而且操作简便，为临床医生提供更有价值的参考，从而更好的服务临床、服务大众。