一种变应性鼻炎动物模型的建立方法

技术领域

本公开属于生物模型构建领域，具体涉及一种变应性鼻炎动物模型的建立方法。

背景技术

目前利用实验动物研究过敏性疾病发病机制的动物模型已经较为成熟，造模动物的选择上主要有小鼠、豚鼠、家兔等实验动物，而利用树鼩建立变应性鼻炎的动物模型未见报道。树鼩作为近十几年新兴的疾病动物模型，相比大鼠、小鼠等成熟的模型动物，目前树鼩作为实验动物研究时间较短，运用于各项疾病研究均处于初步阶段。树鼩是一种新型低等非人灵长类实验动物，兼具体型小、生殖与发育周期短、易饲养、价格低、寿命长、孕期短、多胎等诸多优势；树鼩作为实验动物在生命和医学领域的应用已有30多年历史树鼩，与灵长类动物具有更高同源性，过去虽被认为是低等灵长类动物，但中国科学院昆明动物研究所研究发现树鼩全基因组、转录组及蛋白组与灵长类甚至人类之间存在高度的相似性，其在生理解剖、神经发育及心理应激模式等方面亦与人类相近，其已在抑郁症、乙型肝炎、乳腺癌、糖尿病等疾病模型研究被证实，获得了科研实验人员的普遍认可。综上，运用动物构建变应性鼻炎动物模型可以为生物医学研究提供了一种新的方法和载体。

发明内容

针对现有技术的不足，本公开的目的在于提供一种变应性鼻炎动物模型的建立方法，解决了现有技术中变应性鼻炎动物模型建立困难的问题。

本公开的目的可以通过以下技术方案实现：

一种建立变应性鼻炎动物模型的方法，包括以下步骤：

S1：将待试验树鼩分为若干实验组；

S2：对实验组于第1、3、5、7、9、11、13天进行腹腔注射液卵清蛋白及氢氧化铝佐剂混合液0.5ml；

S3：于第16天开始，连续10天用5％卵清蛋白分别滴双侧鼻腔各10ul；

S4：末次滴鼻结束后利用录像机对树鼩进行录像，观察树鼩的鼻部症状并进行行为学评分。

进一步地，所述方法设有对照组，对照组于第1、3、5、7、9、11、13天进行腹腔注射对照组用0.9％生理盐水；间隔3天后，连续10天用0.9％生理盐水分别滴双侧鼻腔各10ul。

进一步地，所述待试验树鼩实验前单笼饲养14天，室内控制温度21-25℃，湿度为30-50％，自然光照，笼具清理1次/日。

进一步地，所述试验树鼩通过投喂昆明动物研究所研发的树鼩专用饲料40g/日，新鲜苹果20g/日，面包虫4-5条/日，自由饮水喂养。

进一步地，所述试验树鼩选用成年树鼩，体重100-150g。

进一步地，末次滴鼻结束后24h处死树鼩，检测血清中OVA特异性IgE、总IgE；HE染色检测树鼩鼻黏膜组织变化，迪夫染色观察鼻腔灌洗液中嗜酸性粒细胞浸润情况。

进一步地，所述S2的具体操作步骤如下：取9mg卵清蛋白溶于盛有7.5ml生理盐水的15ml离心管中,涡旋混匀；另取900mg氢氧化铝佐剂溶于盛有7.5ml生理盐水的15ml离心管中，涡旋混匀；最后将氢氧化铝佐剂缓慢加入卵清蛋白OVA悬液中，现配现用，用时混匀，每次取0.5ml于第1、3、5、7、9、11、13天对实验组树鼩进行腹腔注射，对照组则用0.9％氯化钠注射液0.5ml进行腹腔注射。

进一步地，所述S3的具体操作步骤如下：于第16天开始，取100mg卵清蛋白，溶于2ml生理盐水得到5％卵清蛋白，每次取10ul滴鼻，连续10天，每次每侧10ul，对照组则用0.9％氯化钠注射液10ul滴鼻。

本公开的有益效果：

1、本发明采用主流的卵清蛋白为变应原造模，研究成功建立了一种与人类致敏相比，具有较高相似性的动物模型以检测和分离并鉴定变应原、寻找可能参与变应性鼻炎病理生理过程的细胞、分子和信号通路等，从而揭示其发病机制；

2、本发明通过建立动物模型，可以更深入地了解变应性鼻炎的发病机制，检测和分离并鉴定变应原、寻找可能参与变应性鼻炎病理生理过程的细胞、分子和信号通路等，从而揭示其发病机制；

3、本发明通过建立变应性鼻炎动物模型，可以对新药物的治疗效果进行预测和评估，可以在动物模型中验证针刺、脉冲电磁场、中药等治疗变应性鼻炎的有效性，并探索亚组、剂型、用药方案等问题；

4、变应性鼻炎与其他过敏性疾病(如过敏性哮喘、食物过敏等)存在许多关联，并且它们共享一些致病机制，通过建立变应性鼻炎动物模型，可以对这些相关联疾病机制进行研究，从而更好地控制和治疗这些疾病；

5、本发明通过建立树鼩模型方便深入探究变应性鼻炎病理机制和药物研发提供了可靠和有效的探索和手段，为未来生物医学研究提供了一种新的方法和思路。

附图说明

为了更清楚地说明本公开实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是本公开实施例整体技术路线图；

图2是本公开实施例树鼩症状学评分对比图；

图3A为末次激发24h后血清卵清蛋白特异性IgE蛋白浓度差异图，图3B末次激发24h后血清总IgE的蛋白浓度差异图；*指实验组与对照组统计学分析P<0.05；**指实验组与对照组统计学分析P<0.01；

图4为鼻黏膜HE染色图，A Control组(200x)，B Control组(400x)，C Control组(200x)，D Control组(400x)，E AR组灌洗液涂片(200x)，F AR组灌洗液涂片(400x)，G AR组灌洗液涂片(200x)，H AR组灌洗液涂片(400x)。

图5鼻腔灌洗液迪夫染色图，A Control组灌洗液涂片(200x)，B Control组灌洗液涂片(400x)，C AR组灌洗液涂片(200x)，D AR组灌洗液涂片(400x)；

图6本公开实施例实验组与对照组树鼩体重变化情况对比图；

图7本公开实施例鼻背黏膜擦伤图；

图8本公开实施例流涕到鼻腔外图。

具体实施方式

下面将结合本公开实施例中的附图，对本公开实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本公开一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本公开中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本公开保护的范围。

如图1-图6所示，一种通过卵清蛋白致敏树鼩的变应性鼻炎的方法，为深入探究变应性鼻炎的研究机制提供合适的动物模型。

本实施例采用了10只普通级成年滇西亚种树鼩，平均年龄1岁±3个月，体重126.9±21.9g，雌雄不限。购于昆明医科大学实验动物中心，生产许可证编号：SCXK(滇)K2020-0004，饲养于广西医科大学实验动物中心普通级动物房(使用许可证编号：SCXK(桂)2020-0004)。所有动物在实验前均进行了适应性饲养2周，饲养条件为：温度21-25℃，湿度30-50％，12h/12h昼夜周期，自由进食和饮水。所有动物实验均遵循《中国实验动物管理条例》和《中国实验动物福利指南》的规定，并经过广西医科大学实验动物动物伦理委员会的审批(批准号：202303150)。

对树鼩随机分配为实验组、对照组两组，每组各5只，并对动物进行编号。实验组于第1、3、5、7、9、11、13天进行腹腔注射液卵清蛋白及氢氧化铝佐剂混合液0.5ml，间隔3天后，连续10天用5％卵清蛋白分别滴双侧鼻腔各10ul诱发过敏症状；对照组用0.9％生理盐水，方法与实验组相同。

具体操作步骤如下：

(1)基础致敏阶段：取9mg卵清蛋白溶于盛有7.5ml生理盐水的15ml离心管中,涡旋混匀；另取900mg氢氧化铝佐剂溶于盛有7.5ml生理盐水的15ml离心管中，涡旋混匀；最后将氢氧化铝佐剂缓慢加入卵清蛋白OVA悬液中，现配现用，用时混匀。每次取0.5ml于第1、3、5、7、9、11、13天对实验组树鼩进行腹腔注射。对照组则用0.9％氯化钠注射液0.5ml进行腹腔注射。

(2)局部加强阶段：于第16天开始，取100mg卵清蛋白，溶于2ml生理盐水得到5％卵清蛋白，每次取10ul(相当于500ug OVA)滴鼻，连续10天，每次每侧10ul。对照组则用0.9％氯化钠注射液10ul滴鼻。

(3)末次滴鼻结束后利用录像机对树鼩进行录像10min，观察树鼩挠鼻子次数、打喷嚏次数、呼吸频率及流鼻涕的情况，并将其行为表现量化，以叠加法记录总分(表1)，行为学总分大于5分即视为造模成功。

表1变应性鼻炎主观指标评分

Table 1 Subjective index score of allergic rhinitis

(4)末次滴鼻结束后24h处死树鼩，采集血清，检测血清中OVA特异性IgE、总IgE。

具体方法如下：

末次滴鼻24h后，先通过股静脉穿刺尽可能抽取外周循环血液，之后采用1％戊巴比妥钠(60mg/kg)麻醉树鼩，采用5ml注射器抽取心脏全血。

将采集到的全血置于一次性使用真空采血管中的全血室温放置2小时，然后水平离心机进行离心，4℃4000rpm离心10min。离心后小心吸取上清液，转移至1.5mlEP管，做好标记后放入-80℃冰箱保存。

ELISA法分别检测血清中OVA-sIgE、总IgE蛋白浓度。

①树鼩血清卵清蛋白特异性IgE检测(捕获法)

实验原理：卵清蛋白特异性IgE采用捕获酶联联免疫吸附剂测定技术。

将人卵清蛋白特异性抗IgE抗体预先包被在96孔板上，将待测血清和标准品加入孔中，用洗涤缓冲液洗去未结合的耦联物。然后加入HRP标记的OVA，如果样品中有任何OVAsIgE,他将形成抗人IgE-OVAsIgE-HRP-OVA复合物。再将TMB底物溶液添加到每个孔中显色(蓝色)。通过添加硫酸溶液终止酶-底物反应，并通过分光光度法在450nm的波长处测量OD值。使用曲线方程软件，将样品的OD450值与标准曲线进行对比，确定样品中待测因子的浓度。

准备试剂与耗材：人抗卵清蛋白特异性抗IgE抗体预包被96孔板，洗板缓冲液，样品稀释液，样品血清，标准品，覆膜，HRP标记OVA工作液，抗原稀释缓冲液，TMB底物液溶液，终止液，不同量程移液器，巴氏吸管，1.5ml的离心管，吸水纸。

样品以及标准品的稀释：25℃预热电热恒温水浴锅，将分装于-80℃冰箱中的树鼩血清取出，迅速置于25℃水浴加热融化，将所有试剂盒样品置于室温静置20分钟。之后将1ml样品稀释液加到标准品管中，室温下放置10分钟，然后充分混匀。血清依据预实验结果分别取50ul血清样本和样品稀释液混匀。另取7个EP管，分别标记为1/2、1/4、1/8、1/16、1/32、1/64和blank。在每个试管中加入0.3ml的样品稀释液。取0.3ml零管中的标准品溶液加到第一个EP管中，充分混合。再将第一个EP管中混合好的标准品溶液取0.3ml转移到第二个EP管中，充分混合。将第二管中混合好的标准品溶液取0.3ml转移到第三管中，充分混合，依此类推。Blank EP管中仅有样品稀释液。标准品在2小时内使用完。

加样前洗板：取准备好的试剂盒，所有试剂用前短暂离心至管底，加样前提前配置洗涤缓冲液，取15ml浓缩洗涤液加入去离子水稀释至375ml中。先用洗涤缓冲液冲洗板两次，每次2min。之后将96孔板中的溶液倒出，在吸水纸上中度力拍打。

正式加样：将稀释好的样本和标准品吸取100ul加到加样板中，96孔板第一和第二列为标准品孔，样本也分一式两份测量避免技术学误差，将溶液加入96孔板底部，反向移液提高加样准度，避免接触管壁和起泡，轻轻盖上覆膜(不要严封)，37℃电热恒温培养箱孵育90min。

洗板：取出96孔板，取下覆膜，用巴士吸管在加样板中加入洗板缓冲液不少于350ul，静置1min，之后直接倾倒溶液重复3次，防止非特异蛋白质干扰。最后一次倾倒溶液后，在吸水纸上中度力拍打干液体。

HRP标记OVA工作液配置与添加：计算所需工作液的总体积，0.1ml/孔×孔数。准备多两孔防止液体损耗。用抗原稀释缓冲液按1:100的比例稀释HRP标记的OVA，充分混合(即每孔按照将1ulHRP标记的OVA加入到99ul抗原稀释缓冲液中)。每孔加100ulHRP标记OVA工作液。盖上新的覆膜，37℃电热恒温培养箱孵育30分钟。

再次洗板：取出96孔板，取下覆膜，使用洗板缓冲液洗板5次，每次静置2分钟，最后一次倾倒溶液后，在吸水纸上中度力拍打干液体。确保洗去未结合的HRP标记OVA工作液。同时提前将TMB底物溶液37℃电热恒温培养箱平衡30min。

加TMB底物溶液:避光下每孔加入90ul TMB底物溶液，加覆膜，锡箔纸避光，在37℃下于暗箱中孵育8分钟。(当标准孔中出现明显的蓝色梯度时，可以终止反应。)

加终止液:避光下向每孔中添加50ul终止液。颜色将由蓝色立即变为黄色。添加终止液的操作顺序与添加TMB底物溶液的操作顺序相同。

OD值的测量:加入终止溶液后，立即在酶标仪的450nm吸光处进行吸光度测定，读取OD450数值。

血清中卵清蛋白特异性IgE蛋白浓度计算：将标准曲线绘制为标准品溶液的每个梯度的OD450值(Y轴)与标准品溶液各自对应的浓度(X轴)的关系。使用Curve Expert 1.4专业软件进行标准曲线的绘制，将样本的OD值代入标准曲线，即可计算得到血清中卵清蛋白特异性IgE蛋白浓度。注:待测样品被稀释过2倍，则标准曲线中计算得到的浓度需乘以2倍数，得到稀释前的浓度。

②树鼩血清总IgE检测(双抗体夹心法)

实验原理：血清总IgE采用双抗体夹心ELISA检测法。将人抗总IgE抗体预先包被在96孔板上，依次将标准品、待测样品和生物素偶联检测抗体加入孔中，用洗涤液洗去未结合的成分。加入HRP-链霉亲和素(SABC)，用洗涤液洗去未结合的偶联物。再将TMB底物溶液添加到每个孔中进行显色(蓝色)。通过添加硫酸溶液终止酶-底物反应，并通过分光光度法在450nm的波长处测量OD值。使用曲线方程软件，将样品的OD450值与标准曲线进行比对，确定样品中待测因子的浓度。

准备试剂与耗材：人抗总IgE抗体预包被96孔板，洗板缓冲液，样品稀释液，样品血清，标准品，覆膜，生物素标记抗体工作液，抗原稀释缓冲液，SABC，SABC稀释液，TMB底物液溶液，终止液，不同量程移液器，巴氏吸管，1.5ml的离心管，吸水纸。

样品以及标准品的稀释：25℃预热电热恒温水浴锅，将分装于-80℃冰箱中的树鼩血清取出，迅速置于25℃水浴加热融化，将所有试剂盒样品置于室温静置20分钟。之后将1ml样品稀释液加到标准品管中，室温下放置10分钟，然后充分混匀。血清依据预实验结果分别取50ul血清样本和样品稀释液混匀。另取7个EP管，分别标记为1/2、1/4、1/8、1/16、1/32、1/64和blank。在每个试管中加入0.3ml的样品稀释液。取0.3ml零管中的标准品溶液加到第一个EP管中，充分混合。再将第一个EP管中混合好的标准品溶液取0.3ml转移到第二个EP管中，充分混合。将第二管中混合好的标准品溶液取0.3ml转移到第三管中，充分混合，依此类推。Blank EP管中仅有样品稀释液。标准品在2小时内使用完。

加样前洗板：取准备好的试剂盒，所有试剂用前短暂离心至管底，加样前提前配置洗涤缓冲液，取15ml浓缩洗涤液加入去离子水稀释至375ml中。先用洗涤缓冲液冲洗板两次，每次2min。之后将96孔板中的溶液倒出，在吸水纸上中度力拍打。

正式加样：将稀释好的样本和标准品吸取100ul加到加样板中，96孔板第一和第二列为标准品孔，样本也分一式两份测量避免技术学误差，将溶液加入96孔板底部，反向移液提高加样准度，避免接触管壁和起泡，轻轻盖上覆膜(不要严封)，37℃电热恒温培养箱孵育90min。

洗板：取出96孔板，取下覆膜，用巴士吸管在加样板中加入洗板缓冲液不少于350ul，静置1min，之后直接倾倒溶液重复2次，防止非特异蛋白质干扰。最后一次倾倒溶液后，在吸水纸上中度力拍打干液体。

生物素标记抗体工作液配置与添加：计算所需工作液的总体积，0.1ml/孔×孔数。准备多两孔防止液体损耗。用抗原稀释缓冲液按1:100的比例稀释生物素标记抗体，充分混合(即每孔按照将1ul生物素标记抗体加入到99ul抗体稀释缓冲液中)。每孔加100ul生物素标记抗体工作液。盖上新的覆膜，37℃电热恒温培养箱孵育60分钟。

再次洗板：取出96孔板，取下覆膜，使用洗板缓冲液洗板3次，每次静置1分钟，最后一次倾倒溶液后，在吸水纸上中度力拍打干液体。确保洗去未结合的生物素标记抗体工作液。

HRP-链霉亲和素偶联物(SABC)配置与添加：计算所需工作液的总体积，0.1ml/孔×孔数。准备多两孔防止液体损耗。用SABC稀释液按1:100的比例稀释SABC，充分混合(即每孔按照将1ul SABC加入到99ul SABC稀释液中)。每孔加100ul SABC工作液。盖上新的覆膜，37℃电热恒温培养箱孵育30分钟。

再次洗板：取出96孔板，取下覆膜，使用洗板缓冲液洗板3次，每次静置1分钟，最后一次倾倒溶液后，在吸水纸上中度力拍打干液体。确保洗去未结合的生物素标记抗体工作液。同时提前将TMB底物溶液37℃电热恒温培养箱平衡30min。

加TMB底物溶液:避光下每孔加入90ul TMB底物溶液，加覆膜，锡箔纸避光，在37℃下于暗箱中孵育8分钟。(当标准孔中出现明显的蓝色梯度时，可以终止反应。)

加终止液:避光下向每孔中添加50ul终止液。颜色将由蓝色立即变为黄色。添加终止液的操作顺序与添加TMB底物溶液的操作顺序相同。

OD值的测量:加入终止溶液后，立即在酶标仪的450nm吸光处进行吸光度测定，读取OD450数值。

血清中总IgE蛋白浓度计算：将标准曲线绘制为标准品溶液的每个梯度的OD 450值(Y轴)与标准品溶液各自对应的浓度(X轴)的关系。使用Curve Expert 1.4专业软件进行标准曲线的绘制，将样本的OD值代入标准曲线，即可计算得到血清中总IgE蛋白浓度。注:待测样品被稀释过2倍，则标准曲线中计算得到的浓度需乘以2倍数，得到稀释前的浓度。

(5)取树鼩鼻黏膜组织，通过HE染色检测树鼩鼻黏膜组织变化。具体方法如下：

用1％戊巴比妥腹腔注射深度麻醉后处死树鼩，分离头部，去除下颌。

用眼科剪及镊子钝性分离树鼩头部皮肤组织，暴露树鼩头骨，沿鼻孔撬开鼻骨，暴露鼻腔结构，显微镜下操作，用显微镊经鼻骨窗口完整分离鼻腔外侧壁及鼻中隔侧黏膜组织。

取下鼻腔黏膜后放入盛有4％多聚甲醛固定液室温固定过夜。

取出固定好的鼻腔黏膜组织，放入包埋盒中流水冲洗4-6小时，之后置于全自动组织脱水机梯度脱水，在50％→70％→80％→90％→100％(I)→100％(II)不同浓度酒精下依次脱水，各个浓度浸泡1小时，之后在二甲苯(I)→二甲苯(II)内，各浸泡30min透明。

脱水后将组织转移至液体石蜡中浸泡，然后将浸泡过石蜡后的组织放入包埋机中包埋，包埋好的组织蜡块放入-20℃冰箱冰冻备用。

切片将冰箱冷却至少30min的包埋蜡块从包埋器中取出，将蜡块修剪后置于包埋机冷却台冷却备用，将蜡块固定于手动轮转式切片机，行连续切片，片厚约4μm，将切片放于45℃预热的石蜡切片裱片机上，待组织切片平整展开后用黏附型载玻片45°斜行插入捞起，之后平插入塑料染色架中，晾干过夜。

烤片：将放置塑料染色架的切片放入65℃电热恒温干燥箱中烤片约2-3h，使石蜡充分溶化。脱蜡：依次将包埋好的组织切片浸泡在装有二甲苯的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ四个缸内进行脱蜡，脱蜡时间为每缸8min。水化：脱蜡结束后将组织切片放于浓度为100％(I)→100％(II)→95％→90％→80％→70％的四个酒精缸内依次进行水化，时间为前两缸8min，中间两缸5min，最后两缸2min，最后将结束后将切片置于超纯水中10min以上。

苏木素染色：组织切片滴加苏木素染液，完全覆盖标本，染色80秒。

冲洗：用流动的自来水将多余的苏木素染液冲洗干净，冲洗10秒。

分化：将切片浸泡于分化液中分化，直至细胞核及核内染色质清晰为止，时间为30秒。

返蓝：用流动的自来水冲洗切片后，1-2s。

伊红染色：滴加伊红染色液染色，时间约为4-5s。

冲洗：用流动的自来水冲洗10s后浸泡于自来水中1-2min。

脱水：将切片放置于不同浓度梯度的酒精缸内进行脱水，酒精浓度依次为70％→80％→90％→95％→100％(I)→100％(II)，每缸浸泡时间为2min。

透明：将切片转移至装有二甲苯的I、II缸内透明，每缸浸泡时间为2min。封片：用一次性使用无菌巴士吸管吸取中性树脂滴2滴在载玻片上，用盖玻片覆盖进行封片，避免气泡产生。镜下观察：显微镜下观察组织切片，可见细胞核呈蓝色，而细胞质呈粉红色或红色。

(5)迪夫快速染色观察鼻腔灌洗液中嗜酸性粒细胞的浸润情况。具体方法如下：

用1％戊巴比妥深度麻醉后处死树鼩，分离头部，去除下颌，暴露鼻咽部及后鼻孔，将树鼩头部倒置，鼻尖下方，鼻尖处放置0.5ml离心管。

用动静脉插管插入后鼻孔，用1ml注射器抽取预冷的PBS液0.3ml，从静脉导管缓慢注入PBS液，充分灌洗鼻腔，在鼻尖处用0.5ml离心管收集灌洗液，离心4℃3000rpm 10min。

取一块洁净的玻片，酒精消毒、晾干，在玻璃片上涂抹少量油脂，使其充分润滑，用枪头吸取离心管下层悬浮液，滴在预处理的玻璃片上，利用吸头涂布均匀，待玻璃片自然干燥后，放入95％酒精中固定15分钟，取出晾干，备用。

取出晾干备用的鼻腔灌洗液涂片，使用迪夫快速Ⅰ染色液染色10s(上下提动玻片2-3次，注意玻片均匀浸泡于液体中)。使用迪夫快速Ⅱ染色液染色20s(上下提动玻片2-3次，注意玻片均匀浸泡于液体中)。水洗数秒后立即趁湿在显微镜下观察。将观察后认为可使用的玻片用二甲苯透明，乙醇脱水，中性树胶封片、保存。

本实施例的结果如下：

如图2所示，在实验开始前、实验开始后第一周、第二周、第三周，将树鼩放入固定袋后置于电子秤称重，用得出的数值计算实验组和对照组的体重平均值，用折线图显示实验组和对照组树鼩体重变化情况。结果表明，实验组中动物在卵清蛋白腹腔注射致敏阶段，树鼩体重有短暂下降现象，考虑可能与卵清蛋白致敏导致树鼩代谢紊乱及免疫反应有关。在后期体重能逐渐上升，说明实验动物体重下降只是暂时的，同时说明实验过程各项操作符合伦理及规范要求，可以保证实验的可靠性及安全性。相对而言，对照组实验动物体重变化不大。

如前所述，在末次滴鼻刺激10分钟后，观察并记录每一只树鼩的鼻部症状：挠鼻、喷嚏、呼吸频率、流鼻涕。发现有树鼩出现用鼻部反复撞击饲养笼、摩擦地面表示树鼩鼻腔瘙痒，更因此导致鼻腔周围黏膜擦伤(见图7)。保定袋固定树鼩时，发现树鼩有大量鼻涕流出到鼻腔外，保定袋头部接触树鼩鼻部数分钟后可致使其湿润(见图8)。实验过程中，所有动物没有出现非正常死亡。实验组树鼩均有出现挠鼻、喷嚏、呼吸加快、流涕等类似变应性鼻炎症状，与实验组相比，对照组树鼩均未见明显挠鼻症状，仅见有偶发喷嚏、呼吸频率加快症状。

依据上述的鼻部行为症状学观察，对NC组、AR组树鼩各项症状记录后叠加量化，记录总分，总分大于等于5分视为造模成功。结果如表2、图3所示。以上结果表明，OVA造模能够引起AR组树鼩产生变应性鼻炎症状。

表2树鼩末次滴鼻激发后10分钟内的症状评分

Table 2 Symptom score within 10 minutes after the last nasal droptrigger in tree shrew

表注：与对照组比较，***P<0.001

OVA-sIgE和总IgE作为一种免疫球蛋白，其浓度与由OVA引起的树鼩变应性鼻炎症状成正比。结果如表3、如图4所示，经过卵清蛋白刺激过敏后，检测末次鼻腔激发24h后树鼩外周血中OVA-sIgE以及总IgE的浓度与对照组相比，实验组树鼩血清学检测见OVA-IgE、总IgE水平显著升高。

表3树鼩血清总IgE和卵清蛋白特异性IgE(OVA-sIgE)表达

Table 3 Serum levels of ovalbumin-specific IgE and total IgE in treeshrew

为了探索OVA造模是否会影响树鼩鼻黏膜的形态结构，本实验在造模完成后收集鼻黏膜标本，采用HE染色观察比较致敏后与未致敏树鼩鼻黏膜的病理形态变化及嗜酸粒细胞的浸润情况，于高倍镜(400x或1000x)下观察，镜下嗜酸粒细胞胞核为深蓝色，胞质为粉色，结果如上。从图7看出，对照组树鼩鼻黏膜结构完整清晰，上皮层连续、完整、纤毛排列整齐、清晰，无充血、水肿、上皮缺损，无明显炎细胞浸润以及腺体增生。AR组树鼩鼻黏膜表面纤毛大量脱落，出现杯状细胞和腺体增生，基底膜暴露或脱落，黏膜层增厚，固有层可见明显炎性细胞浸润。以上结果表明，卵清蛋白能诱发树鼩鼻黏膜产生较重的炎症。

用迪夫染色观察鼻腔灌洗液中嗜酸性粒细胞浸润情况，观察鼻黏膜局部炎症浸润情况，如图5所示。从图5可以看出AR组鼻腔灌洗液中炎症细胞和嗜酸性粒细胞较Control组明显增多，说明卵清蛋白能诱导变应性鼻炎鼻腔发生炎症细胞浸润。以上结果说明使用OVA建立变应性鼻炎模型是成功的，这与之前研究相符，该动物实验模型可用于后续作用机制实验的研究。

经过对变应性鼻炎树鼩模型的研究发现，本实施例通过卵清蛋白刺激过敏后，与对照组相比，实验组树鼩出现了典型的挠鼻、喷嚏、呼吸加快、流涕等症状，血清中OVA特异性IgE和总IgE水平显著升高，鼻黏膜上皮层增厚，纤毛减少或消失，基底膜增厚，黏液腺增生，血管扩张充血，炎症细胞和嗜酸性粒细胞浸润明显，鼻腔灌洗液中总细胞数和嗜酸性粒细胞百分比显著增加。这些结果表明，本实施例成功建立了一种通过卵清蛋白致敏树鼩的变应性鼻炎的方法，为深入探究变应性鼻炎的研究机制提供了合适的动物模型。

本申请提出的模型具有稳定性和复制性，能良好的反应变应性鼻炎的各项表现，造模时间短，步骤简单，并能够准确模拟人类过敏性鼻炎的临床症状和生物学机制。基于以上结论，以树鼩为模型建立的过敏性鼻炎模型为未来生物医学研究提供了一种新的方法和思路。

工作原理：

本次发明采用主流的卵清蛋白为变应原造模，研究成功建立了一种与人类致敏相比，具有较高相似性的动物模型，其在行为学、免疫学及鼻腔黏膜组织病理学等多个方面出现类似人类变应性鼻炎的表现及特点。经过对变应性鼻炎树鼩模型的研究发现，该模型具有稳定性和复制性，能良好的反应变应性鼻炎的各项表现，造模时间短，步骤简单，并能够准确模拟人类过敏性鼻炎的临床症状和生物学机制。变应性鼻炎与其他过敏性疾病(如过敏性哮喘、食物过敏等)存在许多关联，并且它们共享一些致病机制。通过建立变应性鼻炎动物模型，可以对这些相关联疾病机制进行研究，从而更好地控制和治疗这些疾病。最后，树鼩模型的建立成功为以后深入探究变应性鼻炎病理机制和药物研发提供了可靠和有效的探索和手段，为未来生物医学研究提供了一种新的方法和思路。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“示例”、“具体示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。