一种刚地弓形虫自噬相关蛋白8单克隆抗体及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体是一种刚地弓形虫自噬相关蛋白8单克隆抗体及其制备方法和应用。

背景技术

刚地弓形虫（

自噬（Autophagy）是从酵母到哺乳动物的真核生物间保守的细胞内降解过程。自噬的主要功能之一是在正常生长条件下维持基础细胞稳态，另一方面，自噬对于几乎所有真核生物在不同应激条件下的应激管理至关重要。自噬体的形成需要自噬相关蛋白（autophagy related proteins，Atg）及其复合体在不同阶段发挥作用，而Atg8在自噬体的扩张、闭合以及与溶酶体的融合形成自噬溶酶体的过程中发挥核心作用。目前研究表明，弓形虫自噬相关蛋白8（TgAtg8，TGGT1_254120）至少具有双重作用：（1）TgAtg8可以在饥饿诱导条件下参与自噬体形成；（2）在虫体正常分裂增殖过程中，TgAtg8可以定位在顶质体外膜，参与维持顶质体内稳态。因此，可以从TgAtg8发挥作用的两条途径中寻找新的药物靶点。

目前，对于TgAtg8蛋白的研究通常有两种方式，一种是通过构建在TgAtg8蛋白N端或C端连接标签蛋白的真核表达载体，转染至弓形虫中，通过标签抗体去间接识别TgAtg8在虫体的定位、蛋白表达以及蛋白间的相互作用等，另一种则是通过制备抗TgAtg8抗体直接识别内源性TgAtg8蛋白。前者可实现短期内对蛋白进行研究，但存在一些问题，例如标签蛋白可能影响TgAtg8在细胞内的定位以及蛋白间的相互作用等，同时该过表达TgAtg8蛋白的方式在某种程度上或影响内源性蛋白的表达和功能，而后者可弥补前者的不足。

本申请人课题组前期制备了兔TgAtg8多克隆抗体｛刚地弓形虫自噬相关蛋白8（TgAtg8）多克隆抗体制备及初步应用[J].中国寄生虫学与寄生虫病杂志, 2014, 32(2):9-130-134｝存在一些不足，例如抗体的特异性较差——在进行蛋白免疫印迹（WesternBlot，WB）以及间接免疫荧光法（Indirectimmunofluorescence，IFA）实验时分别出现杂带较多、荧光背景较高等问题，因此本发明人不断探索改进方案，希望找到一种杂带较少、荧光背景较低的抗体。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有技术存在的缺点和不足，而提供一种刚地弓形虫自噬相关蛋白8单克隆抗体及其制备方法和应用，本发明所采取的技术方案如下：

第一方面，提供一种刚地弓形虫自噬相关蛋白8单克隆抗体，包括第一抗原结合区和第二抗原结合区，所述第一抗原结合区包括第一轻链可变区VL-1和第一重链可变区VH-1，第二抗原结合区包括第二轻链可变区VL-1和第二重链可变区VH-2，

所述第一轻链可变区VL-1的CDR1、CDR2、CDR3分别如SEQ ID NO：1的第27-37位、第55-57位、第94-102位所示，

所述第一重链可变区VH-1的CDR1、CDR2、CDR3分别如SEQ ID NO：2的第26-33位、第51-58位、第97-106位所示；

所述第二轻链可变区VL-2的CDR1、CDR2、CDR3分别如SEQ ID NO：3的第27-36位、第54-56位、第93-101位所示，

所述第二重链可变区VH-2的CDR1、CDR2、CDR3分别如SEQ ID NO：4的第26-33位、第51-58位、第97-108位所示。

所述第一抗原结合区的第一轻链可变区VL-1的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，第一重链可变区VH-1的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示；

所述第二抗原结合区的第二轻链可变区VL-2的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示，第二重链可变区VH-2的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。

第二方面，上述的刚地弓形虫自噬相关蛋白8单克隆抗体的制备方法中，选用免疫后血清效价高特异性好的小鼠的细胞与骨髓瘤细胞融合，并培养筛选得到阳性杂交瘤细胞。

第三方面，还包括上述刚地弓形虫自噬相关蛋白8单克隆抗体在制备检测试剂盒中的应用，尤其是检测刚地弓形虫自噬相关蛋白8的试剂盒中的应用。

本发明的有益效果如下：本发明制备了鼠抗TgAtg8单克隆抗体，与兔多克隆抗体相比杂带更少、荧光背景更低，有利于后续对TgAtg8蛋白的深入研究。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，根据这些附图获得其他的附图仍属于本发明的范畴。

图1为 His-TgAtg8融合蛋白的诱导表达、纯化及鉴定，其中A为原核表达蛋白His-TgAtg8融合蛋白的SDS-PAGE验证结果；B为His抗体识别原核表达蛋白His-TgAtg8融合蛋白的WB验证结果；C为His-TgAtg8融合蛋白纯化后的SDS-PAGE验证结果；

图2为单克隆细胞上清抗体效价检测和亚型鉴定，其中A为单克隆细胞上清抗体效价检测结果；B为单克隆细胞培养上清抗体亚型鉴定结果；

图3为鼠单克隆抗体TgAtg8识别内源性TgAtg8蛋白，其中A为单克隆抗体识别His-TgAtg8的WB检测结果；B为单克隆抗体识别内源性TgAtg8蛋白的WB检测结果；C为单克隆抗体识别胞内虫体TgAtg8蛋白的IFA结果；D为单克隆抗体识别胞外虫体TgAtg8蛋白的IFA结果，标尺为5μm。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步地详细描述。

在本发明中，以原核表达、纯化的His-TgAtg8蛋白免疫BALB/c小鼠，经4次免疫后采取小鼠血清，以间接ELISA法与WB分别监测抗体效价及特异性；选择抗体效价较高、特异性较好的小鼠，取脾细胞与sp2/0骨髓瘤细胞进行细胞融合，将经HAT培养基筛选得到的阳性杂交瘤细胞以有限稀释法进行亚克隆；采用间接ELISA、WB和间接免疫荧光法IFA检测纯化的单克隆抗体效价和亚型、特异性和定位；将纯化单克隆抗体对应的杂交瘤细胞株进行抗体测序。

实施方法介绍：

1重组蛋白His-TgAtg8的诱导表达、纯化和鉴定

37℃过夜培养pCOLDⅢ-TgAtg8菌液，按照1:100比例重新接种于新的100mL的LB液体培养液中扩大培养，加入1mM IPTG诱导剂低温（16℃）诱导20-24 h，收集菌体，10mL预冷的PBS缓冲液重悬100 mL菌液沉淀，冰浴超声裂解，11000rpm，4℃离心15min收集上清。

小鼠免疫与杂交瘤细胞的筛选鉴定

取5只BALB/c小鼠，将纯化后的His-TgAtg8蛋白（100μl）与免疫佐剂（100μl）1:1混合乳化，于背部2点、腹部1点，各注射1/3体积（避免注射到小鼠左侧脾脏部位），第1次免疫抗原剂量为0.1mg/只，之后免疫为0.05mg/只，每隔两周免疫1次，共免疫4次。取免疫后小鼠血清进行抗体效价及特异性检测（WB检测免疫后血清是否识别弓形虫内源性TgAtg8蛋白），选取血清效价高特异性好的小鼠，在细胞融合前3天，取0.015mg His-TgAtg8蛋白进行腹腔注射加强免疫。小鼠安乐死后，取脾脏分离脾细胞后与骨髓瘤细胞SP2/0，在50%聚乙二醇的诱导下进行融合，通过含次黄嘌呤-氨基蝶呤-胸苷（hypoxanthine-aminopterin-thymidine，HAT）培养基筛选得到阳性杂交瘤细胞，将阳性杂交瘤细胞通过有限稀释法亚克隆得到单克隆细胞株，每次亚克隆期间，收集细胞上清作为一抗，进行2-3次间接ELISA筛选，得到能特异识别His-TgAtg8蛋白的阳性杂交瘤细胞株。

单克隆抗体的效价检测、亚型鉴定和纯化

（1）抗体效价检测

收集阳性杂交瘤细胞株的培养上清，以SP2/0细胞培养上清作为阴性对照，间接ELISA法检测A

（2）抗体亚型鉴定

间接ELISA法对单克隆抗体亚型进行鉴定。

（3）抗体纯化

（4）抗体测序

4单克隆抗体识别内源性TgAtg8

（1）WB检测抗体特异性

提取虫体总蛋白行SDS-PAGE电泳后，分别以免疫前鼠血清、纯化后的鼠抗TgAtg8单克隆抗体（1:1000）作为一抗，以课题组前期制备的兔抗TgAtg8多克隆抗体为阳性对照，羊抗鼠HRP-IgG（1:5000）、羊抗兔HRP-IgG（1:5000）作为二抗，WB检测抗体特异性。以重组His-TgAtg8蛋白为阳性对照，HFF细胞总蛋白为阴性对照。

（2）IFA检测单抗识别内源性TgAtg8

提前一天接种铺有爬片的HFF细胞（3.5×10

实施例：TgAtg8鼠单克隆抗体的制备

1重组蛋白His-TgAtg8的诱导表达、纯化和鉴定

为制备鼠单克隆抗体，首先获取抗原。原核表达His-TgAtg8蛋白，如图1A所示，诱导后沉淀及上清在15kDa左右均出现反应带，表明目的蛋白成功诱导表达；取诱导后超声裂解后上清进行纯化，以不同浓度咪唑洗脱液进行梯度洗脱，后对洗脱蛋白进行WB检测，anti-His为一抗，如图1B所示，His抗体能特异性识别目的蛋白；依据梯度洗脱WB结果，选择500mM咪唑洗脱液对后期纯化的结合蛋白进行洗脱，如图1C所示，得到纯度较高目的蛋白。综上，His-TgAtg8蛋白成功表达，可用于后续实施步骤。

单克隆细胞上清抗体效价检测、亚型鉴定及序列检测

ELISA检测结果显示，小鼠的血清抗体效价随着免疫次数的增加而逐渐升高，第四次免疫结束后小鼠血清抗体效价达1:128000。经过筛选得到三株阳性单克隆杂交瘤细胞，分别为15-A12-D2-B1、16-F9-F5、6-B9-E11-C1，取单克隆细胞培养上清进行抗体效价检测，各组取最高效价（1:128000）的OD值作图，结果显示（图2A），三株细胞培养上清抗体效价均达1:128000；结合细胞上清识别弓形虫内源性TgAtg8蛋白的WB检测，6-B9-E11-C1细胞株上清未能识别虫体内源性TgAtg8，15-A12-D2-B1、16-F9-F5细胞株均能识别虫体内源性TgAtg8但后者特异性最好，因此选取16-F9-F5细胞株培养上清进行抗体亚型鉴定以及后续抗体纯化以及抗体测序；间接ELISA结果显示，细胞分泌的抗体为IgG1亚型（图2B），抗体序列如表1所示。

效果验证

为检测纯化的单克隆TgAtg8是否能识别弓形虫内源性TgAtg8蛋白，提取弓形虫全虫蛋白进行WB检测，结果显示（图3A、3B），单抗能特异性识别内源性TgAtg8（免疫前鼠血清为阴性对照，TgAtg8兔多抗为阳性对照，His-TgAtg8作为阳性对照）；胞内及胞外虫体IFA结果显示（3C、3D），单抗能特异性识别TgAtg8并与顶质体存在共定位。

以上所揭露的仅为本发明较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，因此依本发明权利要求所作的等同变化，仍属本发明所涵盖的范围。