紫杉氰糖苷类化合物及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及医药技术领域，特别是一种紫杉氰糖苷类化合物及其制备方法和应用。

背景技术

因凝血因素导致的心、脑血管等疾病已经成为严重危害公众健康的常见病。目前应用于临床治疗的抗凝血药物主要是肝素和香豆素类，但其有诱发血小板症等副作用。所以，研发更有效和更安全的新型抗血小板药物仍具有重要意义。活血化瘀类中药具有良好的抗血栓活性，已被广泛应用于临床。并且从中药中筛选出良好的抗血栓物质，进行药物研发，已经引起国内外的普遍关注。许多中药复方、有效成分及单体已被证实具有较好的抗血栓作用，而且其药源丰富、价格低廉、毒副作用小，是一类有很大开发潜力的抗血栓药物。

高粱根为禾本科高粱属植物高粱Sorghum vulgare Pers.的根，也是一味传统的中草药。在《本草纲目》(明代·李时珍.本草纲目[M].北京：中国国际广播出版社，1994：1626)、《中药大辞典》(南京中医药大学.中药大辞典.下册[M].上海：上海科学技术出版社，2006：2685)、《中华本草》(国家中医药管理局《中华本草》编委会.中华本草[M].上海：上海科技出版社，1999：426.)等中医药典籍中均有记载。其性味甘、平、无毒；可平喘，利尿，止血；治疗咳嗽喘澜，胃气疼痛，血崩，产后出血等。但关于高粱根的抗血栓应用较少，阻碍了其作为中药资源的深度开发。

综上所述，肝素和香豆素类抗血栓药物毒副作用大，因而研发更有效和更安全的新型抗血栓药物具有重要意义。目前，关于高粱根的抗血栓应用研究较少，阻碍了其作为中药资源的深度开发。

发明内容

本发明的目的，在于提供了一种紫杉氰糖苷类化合物及其制备方法和应用。本发明的紫杉氰糖苷类化合物可应用于制备预防和治疗血栓性疾病的药物，药效好，毒副作用小，本发明还提供了一种从高粱根中提取紫杉氰糖苷类化合物的方法及其衍生物的制备方法，为血栓性疾病用药提供了新的选择，拓宽了高粱根的应用。

本发明的技术方案：紫杉氰糖苷类化合物，为具有如下式I所示的化合物及其药学上可接受的盐或水合物，

其中，R

前述的紫杉氰糖苷类化合物，为具有如下式I-1所示的化合物及其药学上可接受的盐或水合物，

前述的紫杉氰糖苷类化合物中，所述式I-1的化合物于高粱根中分离得到，所述高粱根为贵州茅台酒股份有限公司种植的酒用高粱品种红缨子糯高粱的根。

前述的紫杉氰糖苷类化合物的制备方法，所述R

前述的紫杉氰糖苷类化合物的制备方法，包括以下步骤，

a、取高粱籽粒成熟后的高粱根，洗净，干燥后，机械粉碎，得高粱根粗粉，即A品；

b、取A品加8-12倍95％的乙醇，浸泡16-32h，回流提取1-3次，每次1-3h，合并滤液，浓缩至无醇味，得B品；

c、将B品加1-3倍水分散，加入3-5倍的乙酸乙酯，静置分层后，除去上层萃取液，保留水层；水层重复乙酸乙酯萃取操作1-3次后，取水层，即得C品；

d、将C品加3-5倍的正丁醇萃取1-3次，合并滤液，浓缩成浸膏，真空干燥，得高粱根醇提正丁醇萃取部位BES，即D品；

e、取D品，经MCI凝胶柱分段，以0％-95％的乙醇溶液进行梯度洗脱，收集30％的乙醇溶液洗脱流分，经200-300目或300-400目的硅胶柱层析，以50:1-3:1的乙酸乙酯-甲醇梯度洗脱，分瓶收集洗脱液，每瓶洗脱液经薄层板点样，以15:1的乙酸乙酯-甲醇展开，取Rf值为0.3-0.5的洗脱段，经Sephadex LH-20柱层析，以1:1的氯仿-甲醇洗脱，分瓶收集洗脱液，每瓶洗脱液经薄层板点样，以氯仿-甲醇5：1展开，取Rf值为0.4-0.6的洗脱段，再经200-300目或300-400目常压硅胶柱色谱层析，以10:1的氯仿-甲醇洗脱，得式I-1所示紫杉氰糖苷化合物。

前述的紫杉氰糖苷类化合物的制备方法中，所述步骤e为，取D品，经MCI凝胶柱分段，以0％，30％，60％，95％的乙醇溶液进行梯度洗脱，收集30％的乙醇溶液洗脱流分，经200-300目或300-400目的硅胶柱层析，以50:1、30:1、20:1、10:1、3:1的乙酸乙酯-甲醇梯度洗脱，以每100mL一瓶收集洗脱液，每瓶洗脱液经薄层板点样，以15:1的乙酸乙酯-甲醇展开，取Rf值为0.3-0.5的洗脱段，经Sephadex LH-20柱层析，以1:1的氯仿-甲醇洗脱，以每20mL一瓶收集洗脱液，每瓶洗脱液经薄层板点样，以氯仿-甲醇5:1展开，取Rf值为0.4-0.6的洗脱段，再经200-300目或300-400目常压硅胶柱色谱层析，以10:1的氯仿-甲醇洗脱，得式I-1所示紫杉氰糖苷化合物。

前述的紫杉氰糖苷类化合物在制备预防和治疗血栓性疾病的药物中的应用。

前述的紫杉氰糖苷类化合物在制备预防和治疗血栓性疾病的药物中的应用中，所述紫杉氰糖苷类化合物单独使用或者以药物组合物的形式使用，所述药物组合物含有0.1-99％的所述化合物，其余为药用载体或赋形剂。

前述的紫杉氰糖苷类化合物在制备预防和治疗血栓性疾病的药物中的应用中，所述的药用载体或赋形剂为固体、半固体和液体稀释剂、填料以及其他药物辅剂中的一种或多种。

前述的紫杉氰糖苷类化合物在制备预防和治疗血栓性疾病的药物中的应用中，所述的药物组合物的剂型为，临床上可接受的注射剂、混悬剂、乳剂、溶液剂、糖浆剂、片剂、胶囊剂、颗粒剂，冲剂、喷剂、气雾剂。

前述的紫杉氰糖苷类化合物在制备预防和治疗血栓性疾病的药物中的应用中，所述的药物组合物的给药途径为，静脉注射、静脉滴注、肌肉注射、腹腔注射、皮下注射口服、舌下给药或粘膜透析。

前述的紫杉氰糖苷类化合物在制备预防和治疗血栓性疾病的药物中的应用中，所述紫杉氰糖苷类化合物以每日3-6μg/kg的体重服用量使用。

与现有技术比较，本发明提供了一种紫杉氰糖苷类化合物，可应用于制备预防和治疗血栓性疾病的药物，且具有药效好、毒副作用小的优点。本发明还提供了一种从高粱根中提取紫杉氰糖苷类化合物的方法及其衍生物的制备方法。本发明高粱根中提取的紫杉氰糖苷类化合物是首次从高粱根中提取分离出来。本发明为中风等血栓性疾病用药提供了新的选择，拓宽了高粱根的应用。

附图说明

图1为紫杉氰糖苷类化合物(I-1)的

图2为紫杉氰糖苷类化合物(I-1)的

图3为不同浓度的紫杉氰糖苷(I-1)及其和衍生物I-2对二磷酸腺苷(ADP)诱导的血小板聚集的影响；

图4为不同浓度的紫杉氰糖苷(I-1)及其和衍生物I-2对胶原蛋白诱导的血小板聚集的影响；

图5为不同浓度的紫杉氰糖苷(I-1)及其和衍生物I-2对凝血酶诱导的血小板聚集影响。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步的说明，但并不作为对本发明限制的依据。

实施例1。紫杉氰糖苷类化合物

1.为具有如下式I所示的化合物及其药学上可接受的盐或水合物，

其中，R

作为优选，所述R

2.为具有如下式I-1所示的化合物及其药学上可接受的盐或水合物，

实施例2。紫杉氰糖苷类化合物的制备方法

1.紫杉氰糖苷类化合物(I-1)从贵州茅台酒股份有限公司在桐梓地区种植的酒用高粱品种红缨子糯高粱的根中分离得到，具体如下：

主要仪器

实验材料与试剂

实验所用试剂为分析纯和色谱纯，以及工业纯重蒸处理使用，显色剂为5％浓硫酸溶液以及碘蒸气显色。

制备方法：

a、取高粱籽粒成熟后的高粱根，洗净，干燥后，机械粉碎，得高粱根粗粉，即A品；

b、取A品加10倍95％的乙醇，浸泡24h，回流提取3次，每次2h，合并滤液，浓缩至无醇味，得B品；

c、将B品加2倍水分散，加入4倍的乙酸乙酯，静置分层后，除去上层萃取液，保留水层；水层重复乙酸乙酯萃取操作3次后，取水层，即得C品；

d、将C品加4倍的正丁醇萃取3次，合并滤液，浓缩成浸膏，真空干燥，得高粱根醇提正丁醇萃取部位BES，即D品；

e、取D品，经MCI凝胶柱分段，以0％，30％，60％，95％的乙醇溶液进行梯度洗脱，收集30％的乙醇溶液洗脱流分，经200-300目或300-400目的硅胶柱层析，以50:1、30:1、20:1、10:1、3:1(体积比)的乙酸乙酯-甲醇梯度洗脱，以每100mL一瓶收集洗脱液，每瓶洗脱液经薄层板点样，以15:1(体积比)的乙酸乙酯-甲醇展开，取Rf值为0.3-0.5的洗脱段，经Sephadex LH-20柱层析，以1:1(体积比)的氯仿-甲醇洗脱，以每20mL一瓶收集洗脱液，每瓶洗脱液经薄层板点样，以氯仿-甲醇5:1(体积比)展开，取Rf值为0.4-0.6的洗脱段，再经200-300目或300-400目常压硅胶柱色谱层析，以10:1(体积比)的氯仿-甲醇洗脱，得式I-1所示紫杉氰糖苷化合物。

结构鉴定

EI、ESI、一维和二维核磁共振谱均由省部共建药用植物功效与利用国家重点实验室(贵州省中国科学院天然产物化学重点实验室)分析测试与品质评价中心测定。

白色粉末；分子式C

2.式I中，R

中间体全乙酰糖b的制备：于三通反应瓶中加入二氯甲烷、葡萄糖a、N-甲基吗啉、DMAP，降温至0-5℃，缓慢加入乙酸酐，加入完毕后继续反应2h，反应结束后向反应瓶中加入水，搅拌沉淀，过滤洗涤沉淀，真空干燥得到乙酰化葡萄糖。

中间体α-溴代全乙酰糖c的制备：于圆底烧瓶中加入全乙酰化葡萄糖b，乙酸溶解，置于低温反应器上，待温度降至0℃时滴入溴化氢乙酸溶液，保温反应4h，反应结束加入水终止反应，乙酸乙酯萃取，分离纯化的α-溴代全乙酰糖c。

中间体乙酰化紫杉氰糖苷e的制备：将紫杉氰d溶于乙腈中，加入催化剂氰化汞和二溴化汞，室温反应21h，反应结束后加入水，乙酸乙酯萃取，分离纯化可得相应产物。

紫杉氰糖苷衍生物Ⅰ-2的制备：于圆底烧瓶中加入溶剂甲醇，再加入中间体乙酰化紫杉氰糖苷e并使其溶解，滴入甲醇钠，氮气保护下室温搅拌反应4h，反应结束后加入水终止反应，乙酸乙酯萃取，分离纯化得紫杉氰糖苷衍生物Ⅰ-2。

实施例3。紫杉氰糖苷(I-1)及其和衍生物I-2抗凝血作用的药效学试验

1.样品溶液的制备

精确称取紫杉氰糖苷(I-1)及其和衍生物I-2，DMSO超声完全溶解，生理盐水稀释成浓度为高(200μg/mL)、中(100μg/mL)、低(50μg/mL)的1％DMSO溶液的测试样品。以1％DMSO为空白对照，密封保存于4℃，备用。

2.紫杉氰糖苷(I-1)及其和衍生物I-2对二磷酸腺苷(ADP)诱导的血小板聚集的影响

精确称取0.6408g的ADP溶于5mL的生理盐水中，浓度为30

3.紫杉氰糖苷(I-1)及其和衍生物I-2对胶原蛋白诱导的血小板聚集的影响

将胶原蛋白用稀释液配置为500μL/mL，稀释一倍后，分装，4℃保存备用。考察不同浓度样品对胶原蛋白诱导血小板聚集影响。采集PRP，分别取270μL依次置于比浊杯内。每管PRP中加入高(200μg/mL)、中(100μg/mL)、低(50μg/mL)剂量的紫杉氰糖苷样品(I-1)及其和衍生物I-2各30μL，孵育5min，加入胶原蛋白诱导剂5μL，检测各组PRP在5min内的最大聚集率。紫杉氰糖苷对胶原蛋白诱导的血小板聚集的影响结果见图4。

4.紫杉氰糖苷(I-1)及其和衍生物I-2对凝血酶诱导的血小板聚集影响

将1000U的凝血酶溶解到1mL生理盐水中，得到1000U/mL凝血酶母液，-20冻存，取0.1mL 1000U/mL的凝血酶溶液稀释成100U/ml。再将100U/mL凝血酶稀释为5U/mL，分装，冻存备用。采集PRP，分别取270μL依次置于比浊杯内。每管PRP中加入高(200μg/mL)、中(100μg/mL)、低(50μg/mL)剂量组的紫杉氰糖苷样品(I-1)及其和衍生物I-2各30μL，孵育5min，加入凝血酶诱导剂5μL，检测各组PRP在5min内的最大聚集率。紫杉氰糖苷对凝血酶诱导的血小板聚集影响结果见图5。

5.血小板聚集率测定

采用比浊法，洁净试杯中分别加入搅拌子、270μL PRP和紫杉氰糖苷不同浓度样品30μL，放入预温区37℃预温5min。将PPP试杯放入测试区对血小板聚集仪调零，然后将预温后的试杯放入测试区，按仪器步骤加入诱导剂，反应结束后读取血小板最大聚集率。空白对照组加入等量的溶解样品溶液，按下述公式计算药物对血小板聚集的抑制率：血小板聚集率抑制率＝(对照组的最大聚集率－给药组的最大聚集率)/对照组的最大聚集率×100％。

6.试验结果

图3结果表明，紫杉氰糖苷及其衍生物(I-2)的中(100μM)、高(200μM)剂量组，与空白对照比较，均具有显著抑制ADP诱导的血小板聚集活性(P<0.05或P<0.01)。图4结果表明，紫杉氰糖苷及其衍生物浓度为100μM时具有显著抑制胶原蛋白诱导血小板聚集活性(P<0.05或P<0.01)，紫杉氰糖苷活性更优于其衍生物(I-2)。从图5可看出，与空白对照组比较，高(200μM)、中(100μM)、低(50μM)组紫杉氰糖苷具有极显著抑制凝血酶诱导的血小板聚集作用，差异具有统计学意义(P<0.001)，且浓度为100μM时抑制率为63.32±8.46％；其衍生物(I-2)在高、中、低三个剂量也表现出显著的抑制活性(P<0.05或P<0.01)。

紫杉氰糖苷类化合物对二磷酸腺苷、胶原蛋白以及凝血酶诱导的血小板聚集均有显著抑制作用，尤其是对凝血酶诱导的血小板聚集试验中，表现出极显著的抗血小板聚集活性。

实施例4。紫杉氰糖苷类化合物在制备预防和治疗血栓性疾病的药物中的应用。

1.片剂：取实施例2中制备的紫杉氰糖苷类化合物(I-1)，加入制备片剂的相应辅料，制备成0.3g每片的片剂，每片含紫杉氰糖苷类化合物(I-1)50μg，用于预防和治疗因凝血导致的心、脑血管疾病及其他血栓性疾病，以每日3-6μg/kg的剂量口服，每日1-3次。

2.取实施例2中制备的紫杉氰糖苷类化合物(I-1)，加入制备注射用液针剂的相应辅料，制备成10mL每支的注射用液针剂，每支含紫杉氰糖苷类化合物(I-1)50μg，用于预防和治疗因凝血导致的心、脑血管疾病及其他血栓性疾病，以每日3-6μg/kg的剂量注射，每日1-3次。

3.糖浆剂：取实施例2中制备的紫杉氰糖苷类化合物(I-1)，加入制备糖浆剂的相应辅料，制备成100mL每瓶的糖浆剂，每mL含紫杉氰糖苷类化合物(I-1)0.5μg，用于预防和治疗因凝血导致的心、脑血管疾病及其他血栓性疾病，以每日3-6μg/kg的剂量口服，每日1-3次。

当然，本发明还可有其它多种实施例，在不背离本发明精神及其实质的情况下，熟悉本领域的技术人员当可根据本发明作出各种相应的改变和变形，但这些相应的改变和变形都应属于本发明所附的权利要求的保护范围。