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一种黄姑鱼性染色体特异分子标记、检测引物和试剂盒,及其用途

文献发布时间:2023-06-19 09:24:30


一种黄姑鱼性染色体特异分子标记、检测引物和试剂盒,及其用途

技术领域

本发明涉及分子标记领域,尤其涉及一种黄姑鱼性染色体特异分子标记、检测引物和试剂盒,及其用途。

背景技术

鱼类是我国主要的水产养殖对象之一,大多数鱼类品种都具有雌雄二态性,且生长速率及个体大小均存在性别差异,如罗非鱼和黄颡鱼等雄性个体比雌性个体生长快40%以上,而半滑舌鳎和牙鲆等品种其雌性个体比雄性个体生长快40%-100%。性染色体特异分子标记开发有助于早期开展这些鱼类品种的遗传性别鉴定和性别控制育种,同时鱼类缺乏异形性染色体,性染色体特异分子标记的开发对开展鱼类性染色体研究具有重要的科学意义。

黄姑鱼为我国重要的海水养殖对象之一,是一种具有较高开发价值的优质经济鱼类。黄姑鱼具有明显的性别二态性,雌性个体的生长速率远快于雄性个体,15月龄黄姑鱼雌性个体的体重是雄性个体的1.31倍,开展黄姑鱼的全雌化养殖能够在不增加养殖规模的前提下大幅度提高产量,同时解析黄姑鱼的性别决定分子机理能够充实性别决定机制领域的理论研究。

综上所述,开发一种经济、快捷、准确的黄姑鱼遗传性别鉴定方法对于开展性别控制育种及遗传性别的科学研究都具有重要的意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种识别与鉴定黄姑鱼性染色体的分子标记,有助于快速、简便、准确鉴别黄姑鱼遗传性别,为顺利开展黄姑鱼的性别控制育种工作、发展单性养殖建立基础。

为实现上述目的,本发明提供一种黄姑鱼性染色体特异分子标记,其特征在于,所述分子标记的核苷酸序列为SEQ ID NO:1所示序列,其存在于黄姑鱼的X染色体上,但在Y染色体上缺失。

本发明提供一种用于检测所述分子标记的引物对,其特征在于,所述引物对为SEQID NO:2-3所示的核苷酸序列。

进一步,利用所述引物对SEQ ID NO:2-3对待检测黄姑鱼基因组DNA进行PCR扩增,并检测扩增片段的长度,当出现扩增产物且所述扩增片段仅为879bp时,所述待测黄姑鱼只含有X染色体,具有SEQ ID NO:1所示核苷酸序列,为遗传性别为雌性的黄姑鱼;当出现所述扩增片段且所述扩增片段为879bp和441bp时,所述待测黄姑鱼含有缺失SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的Y染色体,为遗传性别为雄性的黄姑鱼。

本发明还提供用于检测所述分子标记的试剂盒,其特征在于,包括所述引物对。

本发明还保护分子标记,引物对,或所述试剂盒,在黄姑鱼育种中的用途。

本发明还提供一种鉴别黄姑鱼性别的方法,其特征在于,对待测黄姑鱼进行所述分子标记的检测,以便确定所述待测黄姑鱼的遗传性别。

进一步,所述方法包括:

利用所述引物对,或试剂盒,对待测黄姑鱼基因组DNA进行PCR扩增;

检测扩增片段的长度,以及

基于所述扩展片段的长度,确定所述待测黄姑鱼的遗传性别,

其中,当所述扩增片段只有879bp扩增片段时,所述待测黄姑鱼只含有X染色体,具有SEQ ID NO:1所示核苷酸序列,为遗传性别为雌性的黄姑鱼;当所述扩增片段为879bp和441bp时,所述待测黄姑鱼含有缺失SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的Y染色体,为遗传性别为雄性的黄姑鱼。

进一步,利用琼脂糖凝胶电泳或聚丙烯酰胺凝胶电泳,检测所述扩增片段的长度。

本发明还提供一种黄姑鱼辅助育种方法,其特征在于,所述方法包括:通过以上方法,检测所述分子标记,以便确定待测黄姑鱼的遗传性别。

本发明的有益效果是:可以简便、快速、稳定地鉴别出黄姑鱼各个群体中不同个体的遗传性别,包括黄姑鱼养殖群体以及东海野生群体和南海野生群体。将该DNA分子标记应用于生产实践可以有效地识别与鉴定各种发育阶段黄姑鱼的遗传性别,有助于黄姑鱼正常雄鱼、正常雌鱼、伪雄鱼(生理性雄鱼)、伪雌鱼(生理性雌鱼)以及超雄鱼的识别,进而推进黄姑鱼单性育种技术的发展,进一步提高养殖效益,增加黄姑鱼养殖的经济收益。本发明开发的分子标记也将有益于黄姑鱼性别决定分子机理等相关科学研究的开展。

附图说明

图1为黄姑鱼性染色体X和Y在这一区域的序列差异比对分析图。

图2为应用YD-SEX-F/R引物对黄姑鱼养殖群体中的8尾雄鱼和8尾雌鱼进行遗传性别鉴定电泳结果图。

图3为应用YD-SEX-F/R引物对黄姑鱼东海野生群体中的8尾雄鱼和8尾雌鱼进行遗传性别鉴定电泳结果图。

图4为应用YD-SEX-F/R引物对黄姑鱼南海野生群体中的8尾雄鱼和8尾雌鱼进行遗传性别鉴定电泳结果图。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例,所述实施例的示例在附图中示出,其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的,旨在用于解释本发明,而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件者,按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1、黄姑鱼性染色体特异分子标记

利用黄姑鱼转录组和基因组数据,对黄姑鱼基因组中相关基因雌雄差异进行比较分析,发现其雌鱼与雄鱼基因结构存在稳定的差异。

现有的研究结果表明黄姑鱼为XY型性染色体系统,基因组序列比对分析结果显示,黄姑鱼基因组中X染色体和Y染色体上存在438bp的插入缺失见图1。从图1可以看出,X染色体上有438bp的插入片段,Y染色体上则存在438bp的缺失。

实施例2:黄姑鱼养殖群体中的8尾雄鱼和8尾雌鱼检测

剪取待测黄姑鱼的部分鳍条,放入95%的酒精溶液中,-20℃保存用于提取基因组DNA鉴定其遗传性别,同时解剖其性腺观察每个个体的生理性别并记录。性别鉴定结果由扩增条带大小来判定。

检测步骤:

(1)分别取待测黄姑鱼的部分组织或细胞,提取基因组DNA;

(2)以步骤(1)提取的基因组DNA为模板,用YD-SEX-F/R引物(即SEQ ID NO:2和3)进行PCR扩增;

YD-SEX-F:CACTTCTTGAGACCAGATTGTACAG SEQ ID NO:2;

YD-SEX-R:ACCTTGAAGTATTTCCGTGACAG SEQ ID NO:3。

PCR扩增体系:

PCR扩增反应程序为:95℃以上5-10min;95℃左右变性30s,59℃退火30s,72℃延伸40s,30~35个循环后接着72℃延伸5~10min;最后10℃保存。

(3)利用琼脂糖凝胶电泳方法检测步骤(2)的PCR反应产物,根据凝胶成像中条带的数量与大小来判断所测个体的遗传性别。

结果见图2,从图2中可以看出,在所有待检测的黄姑鱼雄性个体中都扩增出一条X染色体上的特异条带879bp和一条Y染色体上的特异条带441bp,而雌性个体只有X染色体上的条带879bp。与实际情况完全一致。

除去以上的验证,申请人也对100多尾用于全基因组关联分析的黄姑鱼遗传性别进行了鉴定,均与实际情况一致。

实施例3:黄姑鱼东海野生群体中的8尾雄鱼和8尾雌鱼检测

剪取待测黄姑鱼的部分鳍条,放入95%的酒精溶液中,-20℃保存用于提取基因组DNA鉴定其遗传性别,同时解剖其性腺观察每个个体的生理性别并记录。性别鉴定结果由扩增条带大小来判定。

检测步骤同实施例1。

结果见图3,从图3中可以看出,在所有待检测的黄姑鱼雄性个体中都扩增出一条X染色体上的特异条带879bp和一条Y染色体上的特异条带441bp,而雌性个体只有X染色体上的条带879bp。与实际情况完全一致。

实施例4:黄姑鱼南海野生群体中的8尾雄鱼和8尾雌鱼检测

剪取待测黄姑鱼的部分鳍条,放入95%的酒精溶液中,-20℃保存用于提取基因组DNA鉴定其遗传性别,同时解剖其性腺观察每个个体的生理性别并记录。性别鉴定结果由扩增条带大小来判定。检测步骤同实施例1。

结果见图4,从图4中可以看出,在所有待检测的黄姑鱼雄性个体中都扩增出一条X染色体上的特异条带879bp和一条Y染色体上的特异条带441bp,而雌性个体只有X染色体上的条带879bp。与实际情况完全一致。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例,可以理解的是,上述实施例是示例性的,不能理解为对本发明的限制,本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

SEQUENCE LISTING

<110> 集美大学

<120> 一种黄姑鱼性染色体特异分子标记、检测引物和试剂盒,及其用途

<130> JMDXL-20026-CNI

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 438

<212> DNA

<213> 黄姑鱼

<400> 1

tcacggttgt caggggcgac cggctgcctc tgccttgtcc ttctgtagct gctgctgccc 60

tgtgtacagc acaggggaga aagtgtcaca ggattggttt tccttgagct gcctctgcct 120

ccatgaatca tgccatccca taatagatca aatctgctcg gatcccaccg tgacacctcc 180

tggtggagag tgatggctgc tcgatacaga cggaaggcgc ggaagagtac agtacaagct 240

caagagtgaa gagggaaact tgaaaaactt tggatatgtg catacctgat gatgtcactt 300

tcttaaattt catatgatgc caccaagttt tacacacagt acctaatttg tatttgtact 360

ttgcaatctt tgcaagatca gattatacaa gatcagattg ccttcaagga attgtgggac 420

ggcatcacaa atatttgt 438

<210> 2

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

cacttcttga gaccagattg tacag 25

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 3

accttgaagt atttccgtga cag 23

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06120112156403