一种治疗仔猪腹泻的中药复方制剂的质量控制方法

技术领域

本发明属于药物分析技术领域，涉及一种治疗仔猪腹泻的中药复方制剂的质量控制方法。

背景技术

仔猪腹泻是严重的仔猪疾病，是引起仔猪死亡的重要原因。由腹泻引起的仔猪死亡数占仔猪死亡总数的39.8％，主要表现为水样腹泻，可引起仔猪死亡，耐过存活仔猪生长缓慢、发育停滞、饲料报酬降低，给养殖场(户)造成巨大的经济损失，严重威胁养猪业健康发展。

本复方制剂主要用于治疗仔猪腹泻，其药味多、成分复杂，产品质量较难控制，而对本复方制剂的质量控制方法，现有文献未见报道。

发明内容

为了克服上述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种治疗仔猪腹泻的中药复方制剂的质量控制方法，能够有效的控制产品的质量，满足生产的要求、保证生产的药物安全、可靠和疗效准确，建立该中药复方制剂的质量标准，从而指导该兽用药品生产。

为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案予以实现：

本发明公开了一种治疗仔猪腹泻的中药复方制剂的质量控制方法，该治疗仔猪腹泻的中药复方制剂由苦参、白头翁、石榴皮、仙鹤草、肉桂和木香制成包括如下操作：

以苦参碱和槐定碱为对照品，采用薄层色谱法对该中药复方制剂中的苦参进行定性鉴别；

以白头翁皂苷B4为对照品，采用薄层色谱法对该中药复方制剂中的白头翁进行定性鉴别；以及：

采用高效液相色谱法对该中药复方制剂中的苦参碱和氧化苦参碱两个活性成分进行含量测定。

进一步地，所述苦参、白头翁、石榴皮、仙鹤草、肉桂和木香的质量比为(2.81-3.23)：(2.89-3.02)：(2.92-3.08)：(1.91-2.03)：(1.95-2.13)：(0.98-1.04)

优选地，采用薄层色谱法对苦参进行定性鉴别，具体步骤如下：

1)制备供试品溶液

取治疗仔猪腹泻的中药复方制剂4g，加入20mL热水使其溶化，静置至室温，然后离心，取上清液，加入浓氨试液1mL，采用三氯甲烷提取2次，每次25mL，合并三氯甲烷提取液，蒸干得到残渣，加入1mL三氯甲烷溶解残渣，获得供试品溶液；

2)制备对照品溶液

分别取对照品苦参碱和槐定碱，分别加乙醇制成1mL含0.2mg的溶液，作为对照品溶液；

3)选择固定相，点样，然后置于展开系统中进行展开，观察结果；

其中，固定相选择硅胶G板，展开剂是将甲苯：丙酮：甲醇按8：3：0.5的体积比配制而成的混合液；点样量为5μl，展开距离为8～10cm；

展开系统为氨蒸气饱和系统，待展开后取出、晾干、喷以碘化铋日光下显色、检视；结果显示：供试品色谱中，在与对照品色谱相应位置上显相同颜色的斑点。

优选地，采用薄层色谱法对白头翁进行定性鉴别，具体步骤如下：

1)制备供试品溶液

取本品10g，置锥形瓶中，加热水30ml使溶化，放至室温，离心，取上清液，用水饱和的正丁醇振摇提取2次，每次30ml，合并正丁醇提取液，用氨试液振摇提取2次，每次30ml，弃去氨试液，正丁醇液再用水振摇提取2次，每次30ml，正丁醇液蒸干，残渣加甲醇2ml使溶解，加中性氧化铝(100～200目，3g)拌匀，用40％甲醇50ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液；

2)制备对照品溶液

取白头翁皂苷B4对照品，加甲醇制成每1ml含0.5mg的溶液，作为对照品溶液；

3)选择固定相，点样，然后置于展开系统中进行展开，观察结果；

其中，固定相选择硅胶G板，展开剂是将正丁醇：醋酸：水按4：1：1的体积比配制而成混合液的上层液，展开剂；对照品溶液、供试品溶液及阴性样品液各5μL，展开距离为14cm；

展开系统为取出，晾干，10％硫酸乙醇溶液，加热至斑点显色清晰，置日光下检视，结果显示：供试品色谱中，在与对照品色谱Rf值0.4的位置上有相同颜色的斑点。

优选地，所述热水温度为70～80℃。

优选地，采用高效液相色谱法对苦参碱和氧化苦参碱进行含量测定，具体步骤如下：

1)制备供试品溶液

按计量配比，取治疗仔猪腹泻的中药复方制剂中6味药材，混匀，研细，取2g，置于25mL容量瓶中，加入浓氨试液1mL湿润，然后加入10mL甲醇振摇使其分散，再加入10mL三氯甲烷超声处理30min，冷却，加入甲醇定容至25mL，然后摇匀、过滤，取滤液，制得供试品溶液；

2)制备对照品溶液

精密称取对照品苦参碱和氧化苦参碱，分别加入甲醇溶解，再用流动相分别稀释制得每1mL含有0.04mg苦参碱的苦参碱对照品溶液，以及每1mL含有0.17mg氧化苦参碱的氧化苦参碱对照品溶液；

3)分别吸取供试品溶液和对照品溶液注入液相色谱仪，进行测定；

其中，液相色谱条件如下：

色谱柱选择以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的C18柱；

梯度洗脱流动相为磷酸二氢钾缓冲液：甲醇：乙腈＝96:2:2的混合液；

检测波长为220nm；

流速为1.0ml/min；

上样量为10μl

理论塔板数为：以氧化苦参碱计应不低于2000。

优选地，磷酸二氢钾缓冲液的配制方法如下：取磷酸二氢钾2.72g，加水1000ml使溶解，加三乙胺1ml，用磷酸调节pH值至3.5。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明公开的治疗仔猪腹泻的中药复方制剂的质量控制方法，由于该中药复方制剂中苦参、白头翁作为君药，因此该方法对其进行质量控制时，首先以苦参、白头翁薄层鉴别作为质量标准，其次选取苦参中的苦参碱和氧化苦参碱的含量多少来判定质量，能够对其物质群整体予以控制，从整体上有效的表征其质量。

通过本发明的质量控制方法能够很好地控制这种中药复方制剂的质量，使产品生产工艺稳定，保证其质量的稳定、均一、可控。此外，该质量控制方法还具有简便性、专属性、可操作性强、重复性好等优点，方法中设置的检测项目科学、建立的检测方法可靠、规定断标准合理，充分地反映了该产品质量控制的关键点，既保证了产品质量，又提高了产品生产质量的可控性。

附图说明

图1为《中国兽药典》收录的苦参薄层色谱结果照片；

图2为本发明优化的质量控制方法的苦参薄层色谱结果照片；

图3为《中国兽药典》收录的白头翁薄层结果照片；

图4为本发明优化的质量控制方法的白头翁薄层色谱结果照片；

图5为《中国兽药典》公布的苦参碱和氧化苦参碱的液相色谱图谱；

图6为本发明优化的质量控制方法的苦参碱和氧化苦参碱的液相色谱图谱。

具体实施方式

为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。

需要说明的是，本发明的说明书和权利要求书及上述附图中的术语“第一”、“第二”等是用于区别类似的对象，而不必用于描述特定的顺序或先后次序。应该理解这样使用的数据在适当情况下可以互换，以便这里描述的本发明的实施例能够以除了在这里图示或描述的那些以外的顺序实施。此外，术语“包括”和“具有”以及他们的任何变形，意图在于覆盖不排他的包含，例如，包含了一系列步骤或单元的过程、方法、系统、产品或设备不必限于清楚地列出的那些步骤或单元，而是可包括没有清楚地列出的或对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或单元。

下面结合附图对本发明做进一步详细描述：

本申请涉及的治疗仔猪腹泻的中药复方制剂中由苦参、白头翁、石榴皮、仙鹤草、肉桂和木香六种原料药组成，

所述苦参、白头翁、石榴皮、仙鹤草、肉桂和木香的质量比为(2.81-3.23)：(2.89-3.02)：(2.92-3.08)：(1.91-2.03)：(1.95-2.13)：(0.98-1.04)。

方中苦参苦、寒，归心、肝、胃、大肠、膀胱经，功能清热燥湿，杀虫去积，利水；白头翁苦，寒，归胃、大肠经，功能清热解毒，凉血止痢；两药合用，清热、燥湿卓著，共为君药。石榴皮酸、涩、温，归大肠经，功能涩肠止泻，止血，驱虫；仙鹤草苦、涩、平，归心、肝经，功能收敛止血，止痢，解毒；发挥涩肠、止泻之功，共为臣药。肉桂辛、甘、大热，归肾、脾、心、肝经，功能补火助阳，温中除寒，佐制苦参、白头翁苦寒之性；木香辛、苦、温，归脾、胃、大肠、三焦、胆经，功能行气止痛，健脾消食，“脾宜升则健，胃宜降则和”佐以木香，助脾胃气机之升降，发挥缓急止痛之效。两者共为佐药。诸药合用，共奏清热燥湿，涩肠止泻，散寒止痛之功。

其制备方法如下：将苦参、白头翁、石榴皮、仙鹤草、肉桂、木香进行组配后制备成颗粒，取肉桂、木香加8倍量水，浸泡3小时，蒸馏4小时提取挥发油，备用；药液另器收集。药渣与其余4味药材加水煎煮两次，每次2小时，第一次加10倍量水，第二次加9倍量水，合并煎液与蒸馏后药液，滤过，滤液70℃浓缩至相对密度约为1.15(55℃)的浸膏，加蔗糖适量一步制粒，喷入上述挥发油，混匀，制成1000g，即得。

1、具体实施例

对上述中药复方制剂进行质量控制，本发明的方法如下：

1)以苦参碱、槐定碱对照品，采用薄层色谱法对该复方制剂中苦参进行定性鉴别；

2)以白头翁皂苷B4为对照品，采用薄层色谱法对该复方制剂中白头翁进行定性鉴别；

3)采用高效液相色谱法对该中药复方制剂中苦参碱和氧化苦参碱两个活性成分(或指标成分)进行含量测定。

优选地，步骤1)关于苦参的薄层色谱鉴别方法，具体操作如下：

供试品溶液的制备：取本品4g，置具塞锥形瓶中，加热水20ml使溶化，放至室温，离心，分取上清液，加浓氨试液1ml，用三氯甲烷提取2次，每次25ml，合并三氯甲烷液，蒸干，残渣加三氯甲烷1ml使溶解，作为供试品溶液。对照品溶液的制备：取苦参碱及槐定碱对照品，分别加乙醇制成每1ml含0.2mg的溶液，作为对照品溶液。固定相：硅胶G板展开剂：甲苯-丙酮-甲醇(8∶3∶0.5)。点样量：对照品溶液、供试品各5μl。展开距离：8～10cm。检视系统：置氨蒸气饱和的展开缸中，展开，取出，晾干，喷以碘化铋钾试液，日光下检视。结果：供试品色谱中，在与对照品色谱相应位置上显相同颜色的斑点

优选地，步骤2)关于白头翁的薄层色谱鉴别方法，具体操作如下：

供试品溶液的制备：取本品10g，置锥形瓶中，加热水30ml使溶化，放至室温，离心，取上清液，用水饱和的正丁醇振摇提取2次，每次30ml，合并正丁醇提取液，用氨试液振摇提取2次，每次30ml，弃去氨试液，正丁醇液再用水振摇提取2次，每次30ml，正丁醇液蒸干，残渣加甲醇2ml使溶解，加中性氧化铝(100～200目，3g)拌匀，用40％甲醇50ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液。对照品溶液的制备：取白头翁皂苷B

优选地，步骤3)中关于苦参碱和氧化苦参碱两个活性成分采用高效液相色谱法进行定量检测，具体操作如下：

供试品溶液的制备：取本品适量，混匀，研细，取约2g，精密称定，置25ml量瓶中，加浓氨试液1ml使湿润，加甲醇10ml振摇使分散，再加三氯甲烷10ml，超声处理(功率300W，频率40kHz)30分钟，放冷，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。对照品溶液的制备：精密称取苦参碱对照品、氧化苦参碱对照品适量，分别加甲醇溶解，用流动相稀释制成每1ml含苦参碱0.04mg，氧化苦参碱0.17mg的溶液，即得。

系统适用性试验：色谱柱为以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的C18柱；采用梯度洗脱流动相为0.02mol/L磷酸二氢钾缓冲液(取磷酸二氢钾2.72g，加水1000ml使溶解，加三乙胺1ml，用磷酸调节pH值至3.5)-甲醇-乙腈(96∶2∶2).检测波长：220nm流速：1.0ml/min，理论塔板数：以氧化苦参碱计应不低于2000。测定：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

2、定性测试实验及测试结果

1)苦参的定性检测

《中国兽药典》中关于苦参药材的薄层鉴别，发现该复方制剂供试品溶液与对照品溶液色谱斑点未能有效分离，且两种展开剂进行二次展开，所需要工作量加大，操作相对麻烦，且甲苯毒性大，故不适合治疗仔猪腹泻中药复方制剂中苦参的薄层鉴别。《新编中药志》、《中药大辞典》和《中药薄层色谱图》中关于苦参的薄层鉴别，供试品制备需放置过夜，耗时过长。《改进的苦参薄层色谱鉴别方法》中有关苦参的薄层鉴别，供试品制备需放置过夜，耗时过长，展开剂中甲苯毒性大，危害较大、且要进行二次展开，操作繁琐。《黄柏止痒洗剂中黄柏、苦参的薄层色谱鉴别》中苦参薄层鉴别，展开剂中甲苯、丙酮毒性大，危害较大。《苦参洗液的薄层色谱鉴别》中苦参薄层鉴别，展开剂操作步骤繁琐，三氯甲烷用量大、占比过高，危害较大。故以上方法不适合治疗仔猪腹泻中药复方制剂中苦参的薄层鉴别。

具体以《中国兽药典》中记载的方法作为对比例进行分析，具体如下：

关于苦参的薄层检测，《中国兽药典》中记载的方法和结果参照图1所示，图1中，薄层板上序号1-9分别代表如下表1所示：

表1

从图1的薄层色谱结果可以看出，采用现有技术公开的上述方法，苦参碱和槐定碱对照品色谱斑点未能有效分离；供试品色谱中，在与苦参碱和槐定碱对照色谱的位置上显一个相同颜色的斑点，且两种展开剂进行二次展开，所需要工作量加大，操作相对麻烦。

而采用本发明优化后的方法进行薄层色谱，结果参见图2，图2中薄层板上序号1-6分别代表如下表2所示：

表2

从图2的薄层色谱结果可以看出，采用本发明的方法，供试品色谱中，在与对照品色谱相应位置上显相同颜色的斑点。阴性样品在与对照药材相应位置上未见相同颜色的斑点。三批供试品色谱斑点清晰，阴性未见干扰。

2)白头翁定性检测

关于白头翁的薄层检测，《中国兽药典》中记载的方法和结果参照图3所示，图1中，薄层板上序号1-5分别代表如下表3所示：

表3

从图3的薄层色谱结果可以看出，采用现有技术公开的上述方法，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，未能有明显的斑点分离出，背景干扰严重。阴性样品亦有严重干扰现象。

而采用本发明优化后的方法进行薄层色谱，结果参见图4，图4中薄层板上序号1-7分别代表如下表4所示：

表4

从图4的薄层色谱结果可以看出，采用本发明的方法，供试品色谱中，在与对照品色谱Rf值0.4的位置上有相同颜色的斑点，并与前后其他成分斑点能有效分离；以上述条件进行三批样品重复试验，结果三批供试品色谱斑点清晰，阴性未见干扰。

3、苦参碱和氧化苦参碱的定量检测

参见图5，为参照《中国兽药典》苦参检测方法进行含量检测的结果，实验结果表明，该方法分离效果差，峰型不对成，有干扰峰存在。不适用治疗仔猪腹泻中药复方制剂中苦参含量检测。

参见图6，为本发明优化苦参碱和氧化苦参碱的含量检测方法的结果，实验结果表明，该方法分离效果良好，峰型对称，峰型无干扰。该方法适用治疗仔猪腹泻中药复方制剂中苦参含量检测。

以上内容仅为说明本发明的技术思想，不能以此限定本发明的保护范围，凡是按照本发明提出的技术思想，在技术方案基础上所做的任何改动，均落入本发明权利要求书的保护范围之内。