一种秸秆微生物处理剂及其应用

技术领域

本发明属于植物秸秆处理技术领域，具体地说，涉及一种秸秆微生物处理剂及其应用。

背景技术

能源危机和环境污染已成为当今世界发展的两大难题，而以秸秆为主要原料的生物质沼气发酵技术是有效缓解该问题的关键技术之一。但由于秸秆等木质纤维素原料结构复杂、致密，难以水解酸化，致使目前秸秆沼气化利用效率较低，严重制约了秸秆类农业废弃物资源化利用进程。因此，深入开展秸秆沼气发酵效率提升技术研究对解决秸秆沼气化利用技术瓶颈具有重要意义。

研究表明，预处理技术可以促进木质纤维素的水解，从而有利于提高沼气发酵效率。如芦苇经蒸汽爆破预处理后的甲烷产量提高了89％，水稻秸秆经真菌处理后的甲烷产量提高了78.3％。目前，应用最为广泛的木质纤维素预处理方法主要分为物理、化学、生物三类。其中，生物预处理因具有能耗小、成本低、环境友好等特点受到了广泛关注。而复合菌系作为一种有效的生物预处理方法，能够充分发挥不同功能微生物之间的协同作用，解除代谢产物的反馈抑制，促进纤维素转化。由于在大多数情况下，木质纤维素原料灭菌不是必需的，这可以帮助降低成本和节省时间，因此复合菌系用于预处理对于大规模生物质生产是有利的。目前研究报道用于降解木质纤维素的复合菌系主要分为两类：一类是从特殊环境中直接获得的，如瘤胃液、厌氧消化液等。第二类是从自然环境(土壤、污泥等)中筛选分离构建的，也是目前研究较多的一类复合菌系，如MC1、WSD-5、WSC-6、XDC-2、MCHCA等，研究表明这些复合菌系均能不同程度地提升秸秆纤维素生物质沼气发酵效率。

生物强化，是指通过向生物系统添加选择的菌株或混合培养物而用于改善难降解的有机物分解代谢，近年来作为旨在提高生物燃料产物产量的替代方法，例如乙醇，氢气和甲烷。与旨在改善木质纤维素材料生产沼气的生物预处理方法相比，生物强化技术具有一定的优势，包括需要更少的时间，更低的成本，更少的干物质损失和毒性划界。根据最近的研究，生物强化技术被证实可加速酸化，进一步改善木质纤维素材料的沼气发酵。

目前已有研究不同复合菌系预处理对木质纤维素生物质沼气发酵效率的影响，以及不同生物强化处理对沼气发酵的影响。然而，少有关于复合菌系预处理和生物强化处理对木质纤维素生物质沼气发酵效果的比较研究。

发明内容

有鉴于此，本发明针对上述的问题，提供了一种秸秆微生物处理剂及其应用，利用人工构建的复合菌系处理玉米秸秆，开展复合菌系预处理和强化对其沼气发酵效率提升作用的比较研究，旨在为后续筛选和优化高效降解纤维素生物质的微生物处理技术，解决我国当前秸秆沼气工程面临的技术瓶颈提供理论参考。

为了解决上述技术问题，本发明公开了一种秸秆微生物处理剂，暂时不写。

与现有技术相比，本发明可以获得包括以下技术效果：

本发明的秸秆微生物处理剂可以破坏木质纤维素结构，这有助于改善水解过程，进一步促进木质纤维素生物质的沼气发酵效率。

当然，实施本发明的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有技术效果。

附图说明

此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本发明的一部分，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：

图1是本发明复合菌系AMC预处理前后玉米秸秆扫描电镜图像(×500倍)；其中，a为处理前，b为处理后；

图2是本发明玉米秸秆厌氧发酵过程中甲烷含量变化；

图3是本发明示范工程预处理前后秸秆厌氧发酵日均沼气产量。

具体实施方式

以下将配合实施例来详细说明本发明的实施方式，藉此对本发明如何应用技术手段来解决技术问题并达成技术功效的实现过程能充分理解并据以实施。

本发明公开了一种秸秆微生物处理剂，包括质量比为1:1:2:1：1的解淀粉类芽孢杆菌(ACCC 60060)、枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis(ACCC 60429)、纤维单胞菌属、不动杆菌属(ACCC19936)、绿色木霉(ACCC 30169)等菌株的复合系。

其中，上述的解淀粉类芽孢杆菌(ACCC 60060)、枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis(ACCC 60429)、纤维单胞菌属、不动杆菌属(ACCC19936)、绿色木霉(ACCC 30169)均购于中国农业微生物菌种保藏中心。

本发明还公开了一种秸秆微生物处理剂在处理玉米秸秆中的应用，包括以下步骤：

步骤1、制备秸秆微生物处理剂：

步骤1.1、在初始pH为6.5、温度32℃条件下，按照接种量5％分别将待培养解淀粉类芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis(ACCC 60429)、纤维单胞菌属，不动杆菌属种接种到培养基中，细菌数最高可达到1.2*10

其中，培养基含有15g玉米淀粉、15g葡萄糖，2.0g的MgSO

步骤1.2、将绿色木霉接种到发酵培养基中，接种量为10％，置于30℃、的恒温恒湿培养箱中培养，培养10d后，以麸皮加硅藻土作为烘干载体，将载体与菌悬液以2:3的比例混合后，于50℃鼓风烘干6h，所得菌粉，备用。

其中，发酵培养基按照质量份含量包括麸皮50％、豆饼粉10％、米糠20％、玉米碎粒20％。

步骤1.3、按照量比为1:1:2:1:1的解淀粉类芽孢杆菌(ACCC 60060)、枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis(ACCC 60429)、纤维单胞菌属、不动杆菌属(ACCC19936)、绿色木霉(ACCC 30169)混合，制备得到菌粉，即为秸秆微生物处理剂。

步骤2、秸秆预处理：将玉米秸秆加入培养基中，另加入秸秆微生物处理剂，25-35℃、150-180rpm条件下摇床处理69-75h，即为秸秆预处理液；

其中，玉米秸秆、培养基和秸秆微生物处理剂的配比为3-8g：90-110ml：8-12ml。

培养基的配比如下：KH

玉米秸秆：取自四川省成都市郊区农田，取回的玉米秸秆在自然条件下风干后粉碎至约5mm备用，其成分组成如表1。

步骤3、厌氧发酵：将质量比为1:1的秸秆按接种厌氧活性污泥进行批式发酵试验，将秸秆预处理液与厌氧活性污泥按照质量比(g/g)为45:1-50:1混合进行厌氧发酵。

厌氧活性污泥：取自农业部沼气科学研究所微生物实验室，其理化特性如表1。

表1玉米秸秆和厌氧活性污泥的特征

注：N.D.未检测

实施例1

一种秸秆微生物处理剂在处理玉米秸秆中的应用，包括以下步骤：

步骤1、制备秸秆微生物处理剂：秸秆微生物处理剂包括质量比为1:1:2:1:1的解淀粉类芽孢杆菌(ACCC 60060)、枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis(ACCC 60429)、纤维单胞菌属、不动杆菌属(ACCC19936)、绿色木霉(ACCC30169)等菌株的复合系。

步骤1.1、在初始pH为6.5、温度32℃条件下，按照接种量5％分别将待培养解淀粉类芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis(ACCC 60429)、纤维单胞菌属，不动杆菌属种接种到培养基中，细菌数最高可达到1.2*10

其中，培养基含有15g玉米淀粉、15g葡萄糖，2.0g的MgSO

步骤1.2、将绿色木霉接种到发酵培养基中，接种量为10％，置于30℃、的恒温恒湿培养箱中培养，培养10d后，以麸皮加硅藻土作为烘干载体，将载体与菌悬液以2:3的比例混合后，于50℃鼓风烘干6h，所得菌粉，备用。

其中，发酵培养基按照质量份含量包括麸皮50％、豆饼粉10％、米糠20％、玉米碎粒20％。

步骤1.3、按照量比为1:1:2:1:1的解淀粉类芽孢杆菌(ACCC 60060)、枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis(ACCC 60429)、纤维单胞菌属、不动杆菌属(ACCC19936)、绿色木霉(ACCC 30169)混合，制备得到菌粉，即为秸秆微生物处理剂。

步骤2、秸秆预处理：将5g玉米秸秆加入装有100mL培养基的250mL锥形瓶中，另加入10mL秸秆微生物处理剂，在30℃、160rpm条件下处理3d，即为秸秆预处理液，取样测定处理后秸秆中纤维素、半纤维、木质素含量，同时进行电镜扫描分析。

其中，培养基的配比如下：KH

玉米秸秆：取自四川省成都市郊区农田，取回的玉米秸秆在自然条件下风干后粉碎至约5mm备用，其成分组成如表1。

步骤3、厌氧发酵：

将质量比为1:1的秸秆按接种厌氧活性污泥进行批式发酵试验，秸秆预处理液(5g玉米秸秆+100mL培养基+10mL秸秆微生物处理剂)+235g厌氧活性污泥；厌氧发酵温度为中温(35±2)℃。

厌氧活性污泥：取自农业部沼气科学研究所微生物实验室，其理化特性如表1。

实施例2

一种秸秆微生物处理剂在处理玉米秸秆中的应用，包括以下步骤：

步骤1、制备秸秆微生物处理剂：

步骤1.1、在初始pH为6.5、温度32℃条件下，按照接种量5％分别将待培养解淀粉类芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis(ACCC 60429)、纤维单胞菌属，不动杆菌属种接种到培养基中，细菌数最高可达到1.2*10

其中，培养基含有15g玉米淀粉、15g葡萄糖，2.0g的MgSO

步骤1.2、将绿色木霉接种到发酵培养基中，接种量为10％，置于30℃、的恒温恒湿培养箱中培养，培养10d后，以麸皮加硅藻土作为烘干载体，将载体与菌悬液以2:3的比例混合后，于50℃鼓风烘干6h，所得菌粉，备用。

其中，发酵培养基按照质量份含量包括麸皮50％、豆饼粉10％、米糠20％、玉米碎粒20％。

步骤1.3、按照量比为1:1:2:1:1的解淀粉类芽孢杆菌(ACCC 60060)、枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis(ACCC 60429)、纤维单胞菌属、不动杆菌属(ACCC19936)、绿色木霉(ACCC 30169)混合，制备得到菌粉，即为秸秆微生物处理剂。

步骤2、秸秆预处理：将玉米秸秆加入培养基中，另加入秸秆微生物处理剂，25℃、180rpm条件下摇床处理69h，即为秸秆预处理液；

其中，玉米秸秆、培养基和秸秆微生物处理剂的配比为8g：90ml：12ml。

培养基的配比如下：KH

玉米秸秆：取自四川省成都市郊区农田，取回的玉米秸秆在自然条件下风干后粉碎至约5mm备用，其成分组成如表1。

步骤3、厌氧发酵：将质量比为1:1的秸秆按接种厌氧活性污泥进行批式发酵试验，将秸秆预处理液与厌氧活性污泥按照质量比(g/g)为45:1混合进行厌氧发酵。

厌氧活性污泥：取自农业部沼气科学研究所微生物实验室，其理化特性如表1。

实施例3

一种秸秆微生物处理剂在处理玉米秸秆中的应用，包括以下步骤：

步骤1、制备秸秆微生物处理剂：

步骤1.1、在初始pH为6.5、温度32℃条件下，按照接种量5％分别将待培养解淀粉类芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis(ACCC 60429)、纤维单胞菌属，不动杆菌属种接种到培养基中，细菌数最高可达到1.2*10

其中，培养基含有15g玉米淀粉、15g葡萄糖，2.0g的MgSO

步骤1.2、将绿色木霉接种到发酵培养基中，接种量为10％，置于30℃、的恒温恒湿培养箱中培养，培养10d后，以麸皮加硅藻土作为烘干载体，将载体与菌悬液以2:3的比例混合后，于50℃鼓风烘干6h，所得菌粉，备用。

其中，发酵培养基按照质量份含量包括麸皮50％、豆饼粉10％、米糠20％、玉米碎粒20％。

步骤1.3、按照量比为1:1:2:1:1的解淀粉类芽孢杆菌(ACCC 60060)、枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis(ACCC 60429)、纤维单胞菌属、不动杆菌属(ACCC19936)、绿色木霉(ACCC 30169)混合，制备得到菌粉，即为秸秆微生物处理剂。

步骤2、秸秆预处理：将玉米秸秆加入培养基中，另加入秸秆微生物处理剂，35℃、150rpm条件下摇床处理75h，即为秸秆预处理液；

其中，玉米秸秆、培养基和秸秆微生物处理剂的配比为3g：110ml：8ml。

培养基的配比如下：KH

玉米秸秆：取自四川省成都市郊区农田，取回的玉米秸秆在自然条件下风干后粉碎至约5mm备用，其成分组成如表1。

步骤3、厌氧发酵：将质量比为1:1的秸秆按接种厌氧活性污泥进行批式发酵试验，将秸秆预处理液与厌氧活性污泥按照质量比(g/g)为50:1混合进行厌氧发酵。

厌氧活性污泥：取自农业部沼气科学研究所微生物实验室，其理化特性如表1。

对比例1

5g玉米秸秆+100mL培养基+10mL超纯水+235g厌氧活性污泥，其余步骤同实施例1。

对比例2

空白组。

下面结合具体的实验数据来说明本发明的技术效果：

一、分析方法

1、常规理化指标分析

物料TS、VS的测定参照美国水和废水监测标准方法(APHA(American PublicHealth Association),Standard Methods for the Examination of Water andWastewater[M],Washington DC,USA,2012.)；纤维素、半纤维、木质素含量的测定采用美国国家可再生能源实验室(NREL)标准分析方法(National Renewable Energy Laboratory,Inc.Standard procedures for biomass compositional analysis[EB/OL].[2015-7-11].http：//www.nrel.gov/biomass/analytical_procedures.htmL.)；总C和总N含量的测定采用有机元素分析仪(EAI CE440)进行分析。

厌氧发酵日产气量采用排水集气法测定；甲烷含量采用气相色谱仪(GC122)分析，色谱柱为碳分子筛TDX-01，长度2m，内径2mm，采用200μL定量环进样，检测器为TCD，色谱条件如下：柱箱温度120℃，进样器温度120℃，检测器温度150℃，载气为H

挥发性脂肪酸(VFA)浓度的测定：采用气相色谱仪(GC102)分析，色谱柱为长度1.5m，内径2mm的GDX-104填充柱，采用FID检测器，色谱条件如下：柱箱温度160℃，进样器温度210℃，检测器温度230℃，载气为N

2 酶活分析

单株菌株和复合菌系分别在改良赫奇逊无机盐培养基HM(KH

3 扫描电子显微镜观察

取少量预处理前后的秸秆样品，制样，用日本HITACHI TM-1000型扫描电子显微镜进行扫描，放大500倍观察。

4 16S rDNA

分别取样保存于-80℃的超低温冰箱中，用于后续的DNA提取和微生物群落结构分析，具体分析由专业的生物技术测序公司完成。

二、结果与讨论

1玉米秸秆预处理前后木质纤维素含量变化

纤维素降解率是表征秸秆生物质经预处理后生物降解特性的指标之一。表2所示为预处理前后玉米秸秆的木质纤维素含量及降解率。玉米秸秆经秸秆微生物处理剂预处理3d后纤维素、半纤维素、木质素含量为0.25、0.23、0.14g·g

表2秸秆微生物处理剂预处理秸秆前后木质纤维素含量变化

2酶活分析

纤维素分解是在多种纤维素酶的协同作用下完成的，是一个复杂的生物学过程。因此，本试验选取了三种常用的酶，对其活性进行分析，包括滤纸酶、羧甲基纤维素酶和纤维二糖酶。其中，最能反映纤维素分解能力的指标是滤纸酶活。分析结果如表3所示，本发明构建的秸秆微生物处理剂的滤纸酶活、羧甲基纤维素酶活、纤维二糖酶活分别为0.33U·mL

表3单菌与人工构建秸秆微生物处理剂的酶活

3电镜扫描分析

利用秸秆微生物处理剂预处理玉米秸秆前后的表观形态结构变化如图1所示。未经预处理的玉米秸秆表面结构紧密规整(图1a)，而经过预处理后的玉米秸秆结构明显被破坏(图1b)，表面出现很多碎片，结构更为松散，孔隙增多，表面附着的菌落清晰可见。电镜分析结果说明本研究构建的秸秆微生物处理剂分泌的各种纤维素酶发挥了协同作用，破坏了木质素对纤维素和半纤维的包裹作用，对木质纤维素进行了有效降解，有利于后续的水解和发酵。

4秸秆沼气发酵效率分析

经秸秆微生物处理剂处理和未经处理的玉米秸秆厌氧发酵过程中日产沼气量对比分析结果如图2所示。三组试验在发酵第1d均开始产气，其中秸秆微生物处理剂预处理组(AMC)与对照组(Ctrl)变化趋势相似，发酵初期日产气量几乎呈线性上升，在发酵第4d就达到产气高峰，之后又逐渐下降，波动幅度较大；在厌氧发酵过程中，秸秆微生物处理剂预处理组(AMC)与对照组(Ctrl)的甲烷含量变化趋势仍相似，从发酵初期逐渐上升至第4d达到50％以上，之后趋于稳定日产沼气量和甲烷含量的结果表明，本研究人工驯化的厌氧复合菌系秸秆微生物处理剂强化处理有利于缓解产气波动，提高甲烷含量。

5 沼气发酵应用

对比预处理前后秸秆的产气数据(图3)，预处理前20d的累积产气量为185.49m3，日均产气量为9.27m3/d；预处理后22d的累积产气量为323.4m3，日均产气量为14.7m3/d。基于此，通过沼气工程的监测数据结果表明，经本研究构建的复合菌系预处理技术可有效提升秸秆沼气工程日均产气量约58.50％。

综合上述产气效率指标分析结果，本研究所构建的好氧对玉米秸秆沼气发酵效率具有提升作用。然而，无论是否使用预处理或生物强化，本研究中的总沼气产量和甲烷产量仅增加了13.02％和11.23％。一方面可能是由于本研究中秸秆微生物处理剂预处理秸秆的时间较短，仅3d，低于大多数的研究报道，纤维素未能得到高效降解；另一方面发酵初期未对发酵原料的各项参数(如pH、碳氮比等)进行优化，不利于厌氧发酵的高效运行。

上述说明示出并描述了发明的若干优选实施例，但如前所述，应当理解发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述发明构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离发明的精神和范围，则都应在发明所附权利要求的保护范围内。