ATXN7L3在肝癌诊断、治疗及预后中的应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，尤其是涉及ATXN7L3在肝癌诊断、治疗及预后中的应用。

背景技术

肝癌是世界范围内癌症致死率排名第四位的肿瘤疾病，通常分为原发性肝癌和继发性肝癌两类，二者中原发性肝癌又可以进一步分为胆管癌、肝细胞肝癌(hepatocellularcarcinoma,HCC)以及混合型肝癌三种类型。而三者中，HCC是原发性肝癌中最常见的组织学亚型，具有高复发、高转移、预后差的特点。值得注意的是，HCC的致死率在所有肝脏肿瘤中排名前列。虽然包括索拉菲尼在内的药物被广泛应用于临床治疗，但其治疗效果依然非常有限。因此，探索HCC发生发展新的分子机制对于肝癌的治疗具有非常重要的意义。

ATXN7L3全称Ataxin 7like 3，是调控细胞内组蛋白泛素化修饰的重要适配蛋白。它首先被发现存在于hSAGA复合物中，是维持该复合物组蛋白去泛素化酶活性所必须的。ATXN7L3与ENY2和泛素蛋白酶USP22三者共同构成了hSAGA复合物中组蛋白去泛素化模体(deubiquitination module,DUBm)的活性中心，并调节细胞内组蛋白H2A/H2B的去泛素化。进一步的研究发现，ATXN7L3还与泛素蛋白酶USP51或USP27X结合，构成与hSAGA无关的DUBm模体，调节细胞内组蛋白泛素化水平。而ATXN7L3在HCC中的表达情况和作用机制迄今还未见报道。

发明内容

鉴于现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供ATXN7L3在肝癌诊断、治疗及预后中的应用。本发明提供了一种与肝癌发生发展相关的分子标志物ATXN7L3和一种肝癌的诊断产品和手段，通过检测分子标志物的表达水平来判断患者是否患有肝癌的风险。并且提供一种治疗肝癌的药物组合或方法，通过特异性的上调调分子标志物来治疗肝癌。实验表明在HCC临床病人的HCC的癌组织和和癌旁组织中比较ATXN7L3的表达，发现ATXN7L3在癌组织HCC组织中显著低表达。此外，ATXN7L3的表达与HCC组织的分化程度正相关，即分化程度高的HCC组织中ATXN7L3表达量较高。并且，ATXN7L3表达与病人预后呈负相关性，即ATXN7L3低表达的病人总体生存率低、生存期短。此外，ATXN7L3通过体内、体外功能实验发现ATXN7L3蛋白表达的敲减能够促进HCC细胞的增殖能力。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案。

检测ATXN7L3表达的试剂在制备诊断和/或预后判断肝癌的产品中的应用。

进一步地，所述试剂选自：特异性识别ATXN7L3的探针；或特异性扩增ATXN7L3的引物。

进一步地，所述产品所述产品包括通过测序技术、核酸杂交技术、核酸扩增技术检测样本中ATXN7L3的表达水平的试剂，所述产品包括但不限于试剂、试剂盒、芯片、试纸、高通量测序平台。

ATXN7L3激动剂在制备预防或治疗肝癌的药物及药物组合物中的应用。

进一步地，所述药物组合物包括ATXN7L3激动剂。

进一步地，所述激动剂选自：以ATXN7L3或其转录为靶序列、且能够促进ATXN7L3表达或转录的干扰分子，包括：shRNA、小干扰RNA、dsRNA、微小RNA、反义核酸，或能表达或形成所述shRNA、小干扰RNA、dsRNA、微小RNA、反义核酸的构建物。

进一步地，所述药物组合物还包括与ATXN7L3激动剂配伍的其他药类以及药学上可接受的载体和/或辅料。

进一步地，所述ATXN7L3激动剂为任何药物治疗学上可接受的剂型。

进一步地，所述ATXN7L3激动剂为任何药物治疗学上可接受的剂量。

ATXN7L3在筛选预防或治疗肝癌的潜在物质中的应用。

本发明的激动剂可以通过本领域任何已知的方式配制药物组合物来使用。这种组合物包含活性成分，加上一种或多种药物可接受的载体、稀释剂、填充剂、结合剂及其它赋形剂，这依赖于给药方式及所设计的剂量形式。本领域枝术人员已知的治疗惰性的无机或有机的载体包括但不限于乳糖、玉米淀粉或其衍生物、滑石、植物油、蜡、脂肪、多羟基化合物例如聚乙二醇、水、蔗糖、乙醇、甘油，诸如此类，各种防腐剂、润滑剂、分散剂、矫味剂。保湿剐、抗氧化剂、甜味剂、着色剂、稳定剂、盐、缓冲液诸如此类也可加入其中，这些物质根据需要用于帮助配方的稳定性或有助于提高活性或它的生物有效性或在口服的情况下产生可接受的口感或气味，在这种组合物中可以使用的制剂可是其原始化合物本身的形式，或任选地使用其药物学可接受的盐的形式，本发明的激动剂可以单独给药，或以各种组合给药，以及与其它治疗药剂一起结合形式给药。如此配制的组合物根据需要可选择本领域技术人员已知的任何适当的方式把抑制剂或激活剂进行给药。使用药物组合物时，是将安全有效量的本发明的抑制剂施用于人，其中口服安全有效量通常至少约100微克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。

本发明的药物可根据需要制备成各种剂型。包括但不限于，经皮、粘膜、鼻、口颊、舌下或经口使用的片剂、溶液剂、颗粒剂、贴剂、膏剂、胶囊剂、气雾剂或栓剂。

本发明的药物的施用途径不受限制，只要它能发挥期望的治疗效果或预防效果即可，包括但不限于静脉内，腹膜内，动脉内，口服，肌肉内，皮下的。在某些情况下，可以系统地给药。在某些情况下是局部地给药。

本发明的药物的剂量不受限制，只要获得期望的治疗效果或者预防效果即可，可以依据症状、性别、年龄等来恰当的确定。本发明的治疗药物或预防药物的剂量可以使用例如对疾病的治疗效果或者预防效果作为指标来确定。

与现有技术比，本发明的有益效果如下。

本发明首次发现ATXN7L3在HCC中具有抑制肿瘤细胞增殖的功能。ATXN7L3在HCC肿瘤组织中低表达，且其低表达与病人预后呈负相关。检测ATXN7L3在HCC病人组织中的表达情况有可能助于诊断及预后判断，制备ATXN7L3表达载体或诱导其表达以达到治疗HCC、缓解HCC进展的功能，并且与现有治疗方案联合可能起到更好的治疗效果。

附图说明

图1是ATXN7L3在HCC肿瘤组织及对应的癌旁组织中的表达。其中T为HCC肿瘤组织，N为癌旁组织。

图2是ATXN7L3在不同分化程度的HCC肿瘤组织中的表达。

图3是ATXN7L3在不同分化程度的HCC肿瘤组织中的表达。

图4是ATXN7L3在体内体外抑制HCC细胞的生长增殖。

图5是ATXN7L3表达质粒的图谱。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如教科书和实验指南中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件，为本领域普通技术人员熟知或易于获知，以下实施例仅为本发明的优选实施例，并不限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

实施例。

一、表达序列的制备。

ATXN7L3的mRNA序列如SEQID NO.2所示，根据ATXN7L3的氨基酸序列如SEQID NO.1所示，制备其表达质粒，质粒图谱如图5所示。

二、ATXN7L3在肝癌诊断、治疗及预后中的应用。

如图1所示，ATXN7L3在HCC肿瘤组织及对应癌旁组织中的表达。搜集28例临床HCC病人的肿瘤组织及对应癌旁组织的配对样本，应用Western Blot检测ATXN7L3在其中的表达水平(图4A)，以GAPDH为内参并对结果进行定量分析(图4B)。结果显示，在其中21对样本中，ATXN7L3在HCC肿瘤组织中的表达明显低于对应的癌旁组织。

如表1所示，ATXN7L3在HCC组织中的表达与病人临床病理参数之间的关系，ATXN7L3在分化程度高的组织中表达更高。对64例临床病人的HCC肿瘤组织石蜡切片进行免疫组织化学染色，检测ATXN7L3的表达水平。根据染色程度对ATXN7L3的表达进行评分，并分析其与病人的年龄、性别、病理组织分化程度及甲胎蛋白(AFP)的表达情况的关系。结果显示，ATXN7L3的表达与病人的年龄、性别和AFP的表达情况无相关性，但与HCC病理组织分化程度有关(P＜0.005)。

Table 1.

Relation between the clinicopathologic variables and ATXN7L3 expressionin HCC

a：Chi-square test

b：Mean age

如图2所示，ATXN7L3在不同分化程度的HCC组织中表达的典型照片。对ATXN7L3在HCC肿瘤组织石蜡切片进行免疫组织化学染色，其在高分化水平(Well)的HCC组织中表达更高、在中分化水平(Moderate)的HCC组织中表达较高、在低分化水平(Poor)的HCC组织中表达低。

如图3所示，ATXN7L3的表达与HCC病人的临床预后呈负相关，ATX低表达的病人整体生存率低、生存期短。对ATXN7L3在85例带有病人预后信息的HCC肿瘤组织石蜡切片进行免疫组织化学染色，并按照染色强度进行评分。之后，按照中位数将病例分为ATXN7L3低表达及高表达两组，并分析两组病人的总体生存率及生存时间。结果显示，ATXN7L3高表达的病人总体生存率高且生存时间长。

如图4所示，ATXN7L3在细胞水平及裸鼠体内抑制HCC细胞的生长增殖。ATXN7L3在细胞水平及裸鼠体内抑制HCC细胞的生长增殖。在HCC细胞系HCCLM3中，转染ATXN7L3表达质粒或对照质粒后，进行MTS实验检测细胞生长，发现过表达ATXN7L3能够抑制HCC细胞的生长增殖，如图4A所示；细胞感染敲减ATXN7L3的病毒或对照病毒后，进行细胞计数并绘制生长曲线，发现ATXN7L3表达的敲减能够促进细胞的生长增殖，如图4B所示；细胞感染敲减ATXN7L3的病毒或对照病毒后，铺板并培养，待细胞形成明显克隆后进行固定和染色，发现ATXN7L3表达的敲减能够促进细胞的克隆形成能力，如图4C所示；细胞感染敲减ATXN7L3的病毒或对照病毒后，接种于裸鼠腋下，每隔一日测量所形成肿瘤的外径，待2周后进行解剖及称重，发现在裸鼠体内，ATXN7L3表达的敲减能够促进HCCLM3细胞的生长增殖，ATXN7L3表达敲减的细胞所形成的肿瘤体积小，如图4D和4E所示；生长速度快如图4F所示；且瘤重更大如图4G所示。

序列表

<110> 中国医科大学

<120>ATXN7L3在肝癌诊断、治疗及预后中的应用

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 354

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

mkmeemslsg ldnskleaia qeiyadlved sclgfcfevh ravkcgyffl ddtdpdsmkd 60

feivdqpgld ifgqvfnqwk skecvcpncs rsiaasrfap hlekclgmgr nssrianrri 120

ansnnmnkse sdqednddin dndwsygsek kakkrksdkl wylpfqnpns prrskslkhk 180

ngelsnsdpf kynnstgisy etlgpeelrs llttqcgvis ehtkkmctrs lrcpqhtdeq 240

rrtvriyflg psavlpeves sldndsfdmt dsqalisrlq wdgssdlsps dsgssktsen 300

qgwglgtnss esrktkkkks hlslvgtasg lgsnkkkkpk ppapptpsiy ddin 354

<210> 2

<211> 1065

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ATGAAAATGG AGGAAATGTC TTTGTCTGGC CTGGATAACA GCAAACTAGA GGCCATCGCT 60

CAGGAGATAT ACGCGGACCT GGTCGAGGAT TCTTGTTTGG GATTCTGCTT TGAGGTACAC 120

CGGGCTGTCA AGTGTGGCTA CTTCTTCTTG GACGACACGG ACCCTGATAG CATGAAGGAT 180

TTTGAGATCG TGGACCAGCC GGGCTTGGAC ATCTTTGGAC AGGTTTTCAA CCAGTGGAAG 240

AGCAAGGAGT GTGTTTGCCC CAATTGCAGT CGCAGCATTG CCGCCTCCCG CTTTGCTCCC 300

CATCTGGAGA AGTGCCTGGG AATGGGTCGG AACAGCAGCC GAATCGCCAA CCGCCGGATT 360

GCCAATAGCA ACAATATGAA TAAGTCTGAG AGTGACCAAG AAGATAATGA TGACATCAAT 420

GACAACGACT GGTCCTATGG CTCGGAGAAG AAAGCCAAGA AGAGAAAGTC AGACAAGCTA 480

TGGTATCTCC CATTCCAGAA CCCCAATTCC CCTCGAAGAT CCAAGTCATT AAAACACAAA 540

AATGGGGAAC TTAGCAATTC GGATCCTTTT AAGTATAACA ATTCAACTGG GATCAGCTAT 600

GAGACCCTGG GGCCGGAGGA GCTTCGCAGC CTGCTAACCA CGCAATGTGG GGTGATTTCT 660

GAACACACCA AGAAGATGTG CACAAGGTCC CTGCGCTGCC CACAGCACAC AGATGAGCAG 720

AGGCGAACCG TACGGATTTA TTTTCTCGGG CCCTCGGCTG TCCTTCCAGA GGTCGAGAGC 780

TCCCTGGATA ATGACAGCTT TGACATGACT GACAGCCAGG CCCTGATCAG CCGGCTTCAG 840

TGGGACGGCT CCTCTGACCT CTCACCCTCT GATTCAGGCT CCTCCAAGAC GAGTGAAAAT 900

CAGGGATGGG GTCTAGGTAC CAACAGCTCT GAGTCACGGA AAACCAAGAA AAAGAAATCC 960

CATCTGAGCC TGGTAGGGAC TGCCTCCGGC CTAGGTTCCA ACAAGAAGAA GAAGCCAAAG 1020

CCACCGGCAC CCCCGACGCC CAGCATCTAT GATGACATCA ACTGA 1065