测定血浆中阿比特龙浓度的方法

技术领域

本发明涉及医药检测技术领域，具体涉及一种测定血浆中阿比特龙浓度的方法。

背景技术

阿比特龙是一种抗雄激素药物，为雄激素代谢过程中的CYP17酶抑制剂，属于内分泌治疗范畴，该药物通过阻断雄激素生物合成的关键酶降低睾酮水平，除了睾丸、肾上腺来源的睾酮外，还可以降低前列腺肿瘤内部微环境中的雄激素合成。阿比特龙可以强烈抑制17α-羟化酶/C17,20-裂解酶(CYP17)，从而显著抑制雄激素的生物合成，在小鼠的药物代谢动力学模型中阿比特龙对于CYP17的抑制活性远远超过酮康唑。I期临床试验结果表明，阿比特龙在去势环境下不仅可以很好地抑制睾酮水平，而且具有很好的耐受性，也没有表现出像酮康唑一样的毒性反应。开放、单中心和剂量递增的临床试验表明持续阿比特龙治疗可以使50％～57％的患者血清中前列腺癌特异抗原降低，且II期临床推荐治疗剂量为1000mg/d，在此剂量下可同时抑制糖皮质激素和雄激素的合成。阿比特龙化学结构式如下所示。

目前，关于阿比特龙在比格犬血浆中的定量检测与分析，尚未有国内外相关文献报道。

专利申请号CN201710159438.8公开了一种全血中阿比特龙的定量检测方法，以全血作为待测对象，依次进行以下步骤：在全血裂解液中加入乙酸乙酯振荡漩涡后离心，乙酸乙酯层氮气流吹干后用20％乙腈水溶液复溶后离心，吸取上清液Ⅰ；称取碱性硅藻土放入玻璃层析柱中，振动处理，然后加入上清液Ⅰ依次用纯水、20％甲醇水溶液、色谱甲醇洗脱，洗脱液氮气流吹干后用20％乙腈水溶液复溶后离心，吸取上清液Ⅱ进行高效液相色谱系统分析，得阿比特龙药物峰面积Y，代入公式Y＝27524X+1956.6，X为上清液Ⅱ的阿比特龙浓度；然后经换算，得待测全血中的阿比特龙浓度。

西南交通大学制药工程学院吴青松等开展了乙酸阿比特龙酯的合成及其质量检测研究，其采用Luna C18色谱柱(250mm×4.6mm，5μm)，流速1.0ml/min，检测波长220nm，柱温40℃，流动相A相为甲醇-乙腈(80％-20％)、流动相B相为水，梯度洗脱，定量分析了乙酸阿比特龙酯和作为杂质存在的阿比特龙的含量。

国外期刊报道了印度Kumar等采用RP-HPLC方法定量分析了大鼠血浆中阿比特龙，其采用Betasil C18色谱柱，利用乙酸乙酯萃取，室温环境下定量检测了大鼠血浆中阿比特龙含量。其回收率为70％以上，流动相为乙腈-水-0.01M磷酸二氢钾(pH3.0)＝55-5-40(V/V/V)。

目前以高效液相色谱法为主，检测下限不能满足较小给药量时生物体内的含量测定的要求，检测过程中信噪比低，存在溶剂峰的干扰，测定的阿比特龙的含量准确度不足，因此，能够用一种方法解决上述问题具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种测定血浆中阿比特龙浓度的方法，克服现有技术中的检测方法无法检测血浆中较低浓度水平的精准定量检测的缺陷；本发明的方法样本预处理过程简化，避免基质效应，色谱峰形极佳，实现了对血浆中药物快速、灵敏、特异性分析，为体内药代动力学的检测提供了简便的分析方法，实现在血浆中较低浓度水平的精准定量；能够满足大批量临床样品分析的需求。

为了解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

一方面，本发明提供一种测定血浆中阿比特龙浓度的方法，包括如下步骤：

1)标准系列工作溶液的配制：称取阿比特龙于容量瓶中，经甲醇溶解配制成标准对照品储备液；将标准对照品储备液用50％乙腈水溶液稀释，配制成标准系列的阿比特龙工作溶液；

2)标准曲线血浆样本的制备：取标准系列的阿比特龙工作溶液，稀释到空白血浆中，配制成浓度为1～500ng/ml的阿比特龙标准曲线血浆样品；

3)标准曲线回归方程的绘制：取标准曲线血浆样品，加入内标工作溶液，涡旋，加入乙腈沉淀剂沉淀后，涡旋、离心后，进样LC-MS/MS系统，得到色谱图；根据得到的色谱图中色谱峰的峰面积与内标峰面积比计算阿比特龙在血浆中的浓度，制定标准曲线回归方程；

其中，所述LC-MS/MS系统中液相条件如下：

液相条件

色谱柱：Waters XTERRA MS C18；流动相A∶10mM乙酸铵-0.1％甲酸水溶液，流动相B∶0.1％甲酸甲醇溶液；

质谱条件

采用ESI源，离子化方式：电喷雾离子化正离子；监测方式：MRM；极性：正离子；碎裂电压：240V，碰撞能：65V

阿比特龙-d

阿比特龙(ABTL)：母离子m/z为350.2，子离子的m/z为155.9。

进一步地，所述标准对照品储备液的浓度为1mg·mL

进一步地，所述标准系列的阿比特龙工作溶液的浓度范围为20～10000ng/mL；

进一步地，所述阿比特龙标准曲线血浆样品的浓度范围为1～500ng/mL。

进一步地，所述血浆来自比格犬、兔、鼠或人等哺乳动物。

进一步地，所述标准曲线回归方程的获取过程如下：取标准曲线血浆样品各50μL，加入内标工作溶液20μL，涡旋30s，加入300μL乙腈沉淀剂沉淀后，涡旋3min，离心2490g，4℃，10min；5μL进样LC-MS/MS系统，得到色谱图；根据得到的色谱图中色谱峰的峰面积与内标峰面积比计算阿比特龙在血浆中的浓度，制定标准曲线回归方程。

进一步地，所述内标工作溶液的配制过程如下：称取阿比特龙-d

将阿比特龙-d

进一步地，所述LC-MS/MS系统的条件如下：

色谱条件

色谱柱：Waters XTERRA MS C18(2.1×50mm，5micron)；流动相A∶10mM乙酸铵-0.1％甲酸水溶液，流动相B∶0.1％甲酸甲醇溶液；流速：0.5mL·min

流动相比例设置如下：

质谱条件

采用ESI源，离子化方式：电喷雾离子化正离子；监测方式：MRM；极性：正离子；碎裂电压：240V，碰撞能：65V；阿比特龙-d

质谱切换阀设置如下：

离子源参数设置如下：毛细管反吹干燥气温度:300℃；毛细管反吹干燥气流量：10l/min；雾化器压力:45psi；鞘流气温度:350℃；鞘流气流量：11ml/min，毛细管电压：3500V。

进一步地，所述LC-MS/MS系统检测后，阿比特龙在2.16min左右出峰；

所述标准曲线的回归方程如下：测得的阿比特龙在比格犬血浆中的标准曲线回归方程为y＝0.026236x-0.001218，R

另一方面，本发明提供一种测定血浆中阿比特龙浓度的方法，包括如下步骤：

样品溶液的配制：向待测血浆样品中加入内标工作溶液，涡旋，加入乙腈沉淀剂沉淀后，涡旋、离心；

样品溶液的检测：将配制好的样品溶液，进样LC-MS/MS系统，得到色谱图；

样品溶液中浓度的计算：将待测血浆样品中目标药物的峰面积与内标峰面积比代入本发明所述方法获得的标准曲线回归方程，计算测定的药物的相应浓度。

进一步地，所述样品溶液的配制如下：向50μL待测血浆样品中加入20μL内标工作溶液，加入300μL乙腈沉淀剂沉淀后，涡旋3min，离心2490g，4℃，10min。

进一步地，所述LC-MS/MS系统的检测条件如下：

色谱条件

色谱柱：Waters XTERRA MS C18(2.1×50mm，5micron)；流动相A∶10mM乙酸铵-0.1％甲酸水溶液，流动相B∶0.1％甲酸甲醇溶液；流速：0.5mL·min

流动相比例设置如下：

质谱条件

采用ESI源，正离子MRM模式检测。

质谱切换阀设置如下：

离子源参数设置如下：

进一步地，所述内标工作溶液的配制过程如下：称取阿比特龙-d

将阿比特龙-d

定性方法：待测药物与药物标准品的保留时间一致，结合质谱参数中的定性和定量离子对确定为目标药物。

定量方法：以分析物峰面积与内标峰面积比对标准曲线中分析物的理论浓度进行线性最小二乘法回归计算，以所得回归方程计算样品中分析物的实测浓度。

本发明采用液相色谱-质谱联用法进行检测，既结合了液相色谱仪有效分离化合物的能力，又结合质谱仪很强的组分鉴别能力，能够有效分离和鉴别血浆中阿比特龙，并进行定量检测。

本发明方法可获得高回收率且有效降低杂质峰的干扰，避免传统方法由于溶剂效应带来的影响，避免传统方法的繁琐和条件不受控的情况。

本发明采用氘代阿比特龙作为内标物，可使测定的血浆中的阿比特龙浓度的重现性好、准确度高；

本发明方法具有系统适用性，对不同来源空白血浆无选择性，能够专一性测定阿比特龙，分离度好。

本发明方法用量小，每次血浆样品测试仅需5μL，可准确测定处化合物。

与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：

本发明提供了一种预处理方法简便的测定血浆中的阿比特龙浓度的测定方法，采用比格犬血浆作为示范，采用蛋白沉淀法，在本实验所采用的色谱条件下，阿比特龙保留时间为2.16min左右，峰形良好，无杂峰干扰测定，基线平稳；本方法具有较高的特异性，能准确测定血浆中的阿比特龙的浓度，灵敏度较高，阿比特龙的血浆最低定量限为1ng/mL，本发明方法快速、准确、灵敏度高、操作简便，为阿比特龙的血药浓度测定提供依据。本方法阿比特龙的血浆标准曲线线性范围为1～500ng/mL，批内和批间精密度RSD均小于±10％。本发明方法重现性好，准确度高，不受基质、高血脂基质和溶血基质的干扰，不同个体的血浆对本发明方法无干扰现象。

现有测试方法以高效液相色谱法为主。相比现有方法，本发明方法的检测下限能满足较小给药量时生物体内的含量测定要求，检测过程中信噪比符合标准要求，无杂质峰的干扰，测定的阿比特龙的含量准确度高。

本发明方法能够满足生物样本检测要求，可应用于药物临床前及临床评价研究。

附图说明

图1 LC-MS/MS法测得的比格犬血浆中阿比特龙的标准曲线图；

图2 LC-MS/MS法测得的比格犬血浆中阿比特龙和阿比特龙-d

图3阿比特龙正离子多反应检测扫描质谱图；

图4阿比特龙-d

图5Beagle犬空腹经口灌服醋酸阿比特龙片后阿比特龙血药浓度-时间曲线

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

1.主要仪器

Agilent G6470型三重四极杆液质联用仪，配有液相色谱仪(含自动进样器)、电喷雾电离离子源(ESI)及Agilent Mass Hunter Workstation Software数据处理系统(Agilent，美国)；METTLER TOLEDO AB135-S型十万分之一天平(METTLER，瑞士)。

2.色谱条件

色谱柱：Waters XTERRA MS C18(2.1×50mm，5micron)；流动相A∶10mM乙酸铵-0.1％甲酸水溶液，流动相B∶0.1％甲酸甲醇溶液；流速：0.5mL·min

流动相比例设置如下：

3.质谱条件

采用ESI源，正离子MRM模式检测。

质谱切换阀设置如下：

离子源参数设置如下：

离子源参数设置如下：毛细管反吹干燥气温度(Gas Temp):300℃；毛细管反吹干燥气流量(Gas Flow)：10l/min；雾化器压力(Nebulizer):45psi；鞘流气温度(Sheath GasHeater):350℃；鞘流气流量(Sheath Gas Flow)：11ml/min，毛细管电压(Capillary)：3500V。

4.抗凝剂：EDTA-K2

5.内标：阿比特龙-d

6.数据处理

色谱保留时间及色谱峰面积由Agilent Mass Hunter Workstation Software采集处理与定量分析,采用Agilent ECM网络系统。以分析物峰面积与内标峰面积比对标准曲线中分析物的理论浓度进行线性最小二乘法回归计算，以所得回归方程计算样品中分析物的实测浓度。样品中分析物的实测浓度由仪器采用以下回归方程计算：

y＝ax+b

其中，y＝分析物/内标峰面积比；a＝标准曲线之斜率；x＝药物浓度/内标浓度；b＝标准曲线之截距；(权重因子为1/x

所有计算和统计分析所使用小数点位数与软件输出保持一致。所有与浓度相关的数据保留小数点后3位，色谱峰保留时间保留小数点后3位，百分数保留1位小数，色谱峰面积保留整数，峰面积比保留小数点后6位。

数据的RSD值、偏差、均值等采用Microsoft Office Excel 2013进行计算。

7.样品进行检测前的预处理方法：

取全血，加入抗凝剂EDTA-K2，通过蛋白沉淀法进行处处理后制得空白血浆，冷藏用于进行样品稀释或配制，使用前解冻。

50μL标准曲线血浆样品使用前加入内标工作溶液20μL，涡旋30s，加入300μL乙腈，涡旋3min，离心，2490g，4℃，10min，待进样。

50μL SST使用前加入内标工作溶液20μL，涡旋30s，加入300μL乙腈，涡旋3min，离心，2490g，4℃，10min，待进样。

50μL质控血浆样品使用前加入内标工作溶液20μL，涡旋30s，加入300μL乙腈，涡旋3min，离心，2490g，4℃，10min，待进样。

50μL空白血浆使用前加入甲醇20μL，涡旋30s，加入300μL乙腈，涡旋3min，离心，2490g，4℃，10min，待进样，记作：Double blank或Carryover样品。

或者50μL空白血浆使用前加入内标工作溶液20μL，涡旋30s，加入300μL乙腈，涡旋3min，离心，2490g，4℃，10min，待进样，记作：Blank样品。

50μL超纯水使用前加入甲醇20μL，涡旋30s，加入300μL乙腈，涡旋3min，离心，2490g，4℃，10min，待进样，记作：Reagent and Materials blank样品。

备注：Double blank为双空白样品、carryover为残留考察用双空白样品、blank为只加内标的单空白样品、Reagent and Materials blank为试剂耗材验收空白样品。

实施例1

1.溶液配制

流动相A(10mM乙酸铵-0.1％甲酸水溶液)：称取约0.7708g乙酸铵至适当溶剂瓶中，再加入1000mL超纯水及1mL的甲酸，混匀超声。

流动相B(0.1％甲酸甲醇)：量取1000mL甲醇转移至适当的溶剂瓶中，再加入1mL甲酸，混匀超声。

稀释溶液(50％乙腈水溶液)：分别取200mL乙腈和200mL超纯水转移至适当的溶剂瓶中，混匀，待用。

2.标准溶液配制：

标准对照品储备液的配制

精密称取阿比特龙对照品10.04mg分别于10mL容量瓶中，用10mL移液管吸取10mL甲醇配置成浓度为1mg·mL

标准系列工作溶液的配制：

取标准对照品储备液适量，用50％乙腈水溶液稀释，得到阿比特龙工作溶液为：20、40、100、200、1000、5000、8000、10000、100000ng/mL。

标准曲线血浆样品的配制

取标准系列工作溶液各10μL，稀释到空白血浆中使得总体积为0.2mL，配制的标准曲线血浆样品中阿比特龙浓度值为：1、2、5、10、50、250、400、500ng/mL。

SST样品：取标准系列工作溶液10μL，稀释到空白血浆中使得总体积为0.2mL，配制的SST样品中阿比特龙浓度值为：1ng/mL。

3.内标标准溶液配制

内标储备溶液配制

在规格为1.02mg的阿比特龙-d

内标工作溶液配制(IS Spike,100ng·mL

吸取10μL阿比特龙-d

4.质控标准溶液配制

质控对照品储备液的配制：

分别称取阿比特龙对照品10.04mg，用10mL移液管吸取10mL甲醇加入10mL容量瓶中，含待测物(阿比特龙)浓度为1mg·mL

质控工作溶液的配制：

分别取质控对照品储备液，稀释到50％乙腈水溶液中，配制成的阿比特龙质控工作液的浓度为20、60、750、7500、75000ng/mL。

质控血浆样品的配制：

分别取质控工作溶液，稀释到空白血浆中，配制成的阿比特龙质控血浆样品液的浓度为3750、375、37.5、3、1ng/mL；分别对应AQL、HOQ QC、MOQ QC、LOQ QC、LLOQ。

5.方法学验证

5.1线性范围和定量下限

取标准系列工作溶液各10μL，稀释到空白血浆中使得总体积为0.2mL，配制的标准曲线血浆样品中阿比特龙浓度值为：1、2、5、10、50、250、400、500ng/mL。

取标准曲线血浆样品、空白血浆Double blank样品、Blank样品，5μL进样到色谱系统分析。

结论：所得标准曲线样品的线性曲线图如图1所示，其中LC-MS/MS法测得的阿比特龙在比格犬血浆中的标准曲线方程为：y＝0.026236x-0.001218，R

5.2精密度与准确度

取四个不同浓度的质控血浆样品，阿比特龙质控血浆样品液的浓度为375、37.5、3、1ng/mL；分别对应为HOQ QC、MOQ QC、LOQ QC、LLOQ浓度，并将其进行检测。作为批内及批间准确度和精密度的考察。每一个浓度平行制备6份，至少测试三次。采用平均值来评估批间准确度和精密度。结果如下表：

表1：LC-MS/MS法测定血浆中阿比特龙批内、批间的精密度和准确度

结果表明：阿比特龙的血浆样品批内、批间精密度、准确度偏差均小于15％。低、中、高浓度水平标准血浆样品测得值应为标示值的85.0％～115.0％范围内，批内与批间精密度(RSD)小于15.0％。说明本发明方法对血浆中的卡瑞斯汀的检测具有良好的精密度和准确度。

5.3系统适用性：

取经预处理的阿比特龙质控血浆样品，浓度为1ng/mL；5μL进样检测，重复分析8次；

取经预处理的空白血浆Blank样品，5μL进样检测，重复分析8次；

分别记录待测物与内标的色谱峰面积值及保留时间，并计算待测物与内标的色谱峰面积比值及色谱峰保留时间的变异系数。具体结果如下表2所示：

表2：阿比特龙的系统适用性

结论：待测物信噪比(S/N不小于5)，8次重复分析所得待测物与内标色谱峰面积比值的变异系数应小于5％；8次重复分析所得待测物与内标色谱峰保留时间的变异系数应小于0.5％。待测物保留时间变异系数0.0-1.2％、内标保留时间变异系数0.0-1.3％、面积比的变异系数0.5-5.7％。说明本发明方法对血浆中药物的检测方法适用测定阿比特龙。

5.4选择性

选择性是指色谱方法测定分析物时，区分生物基质中干扰的能力。方法验证之前，需要至少筛选6个不同批次的空白基质用于方法验证。

取6个比格犬不同来源的空白血浆，经预处理为Carryover样品后，5μL进样到色谱系统分析；

取6份来自不同来源的空白血浆，配制成的阿比特龙质控血浆样品液的浓度为1ng/mL，经预处理，5μL进样到色谱系统分析；

取6份来自不同来源的空白血浆，经预处理为Blank样品后，5μL进样到色谱系统分析。

分别记录各份空白样品及定量下限浓度水平的标准血浆样品的结果如下表。

表3：六个不同来源空白健康比格犬血浆对分析物、内标的选择性考察对比表(阿比特龙)

结论：至少6份不同来源空白基质样品中的分析物保留时间处色谱峰峰面积低于相对应的不同来源空白基质LLOQ浓度待测物峰面积的20.0％，且内标保留时间处内标峰面积低于相对应的不同来源空白基质LLOQ浓度内标峰面积的5.0％。6份不同来源空白基质配制的LLOQ浓度测得值在理论值的80.0％～120.0％范围内。本发明方法针对不同来源空白基质样品中的分析物的干扰范围为0～1.5％，内标干扰响应值为0～0.1％。可见，不同人体的空白血浆对阿比特龙的检测结果没有造成干扰，该方法可以用于检测不同人体血浆中阿比特龙，不同人群的血浆对本发明检测方法无影响。

5.5回收率

5.5.1分析物的提取回收率

分析物回收样品

分别取浓度为375、37.5、3ng/mL阿比特龙质控血浆样品液，平行制备6份，不加入100ng/mL内标溶液，沉淀后，取合适体积的上清溶液，加入与上清相同体积的100ng/mL内标溶液，涡流混合后测定。

回收率参比样品：

提取过程与分析物回收样品操作相同，但是100ng/mL内标溶液在沉淀后加入，再取上清涡流后进行测定。

5.5.2内标物的提取回收率

内标的提取回收率样品

由空白血浆样品平行制备6份，加入100ng/mL内标溶液，沉淀后，取合适体积的上清溶液，加入与MOQ QC质控样品浓度相当的标准品溶液。

内标的回收率参比样品：

提取过程与内标的提取回收率样品的提取操作相同，但是MOQ QC质控样品和内标溶液均在沉淀后加入。

结论：1)本发明方法的待测物阿比特龙在高、中、低三个浓度范围内的提取回收率分别为110.3％、107.1％、101.5％，对应的变异系数CV值为0.7％、1.7％、1.5％；总回收率为106.3％，总体回收率变异CV值为3.7％。2)本发明方法的内标物阿比特龙的提取回收率为106.2％，回收率CV值为4.1％。

5.6基质效应

1)基质效应系指生物基质中存在的组分对分析物的离子化所产生的抑制或增强作用。分别取6个不同批次的空白比格犬血浆，每个批次配制一份，经前处理后分别加入与处理后的低浓度和高浓度质控样品浓度相当的标准品溶液及内标溶液进行分析。

无基质存在的与低浓度和高浓度质控样品浓度相当的纯溶液，平行6份，进行分析。

2)溶血基质的配制：取100μL空白全血，将其超声破坏血细胞，取其20μL加入980μL正常空白血浆，混匀，即为2％经超声破坏的溶血血浆，视为严重溶血。

使用模拟的溶血血浆制备待测物两个浓度水平(LOQ QC、HOQ QC)样品各6份，并将其处理后，进样到色谱系统分析。

3)使用高血脂血浆样品制备待测物低、高浓度水平(LOQ QC、HOQ QC)样品各6份，并将其处理后，进样到色谱系统分析。

结论：经内标归一化的基质因子的变异系数CV％：2.2～3.5％；溶血基质效应的平均准确度偏差范围：-7.5～-1.6％；高血脂基质效应的平均准确度偏差范围：-9.0～0.6％；说明本发明方法没有明显的基质效应，也没有明显的溶血和高血脂基质效应。

5.7稳定性

将待测物低、高(LOQ QC、HOQ QC)两个浓度的比格犬血浆质控样品，在如下条件下进行稳定性考察：

1)-70℃反复冻融3次稳定。

2)室温放置17h稳定。

3)-20℃条件下31d稳定。

4)全血稳定性：分别考察加入含低、高(LOQ QC、HOQ QC)两个浓度水平分析物在全血中冰水浴下放置(0h)、(0.5～1.5h)峰面积之比的变化，在放置相应考察时间点后，将全血样品离心分离血浆，加入内标按照相应血浆样品处理操作方法处理，每个浓度水平平行6份。

通过稳定性考察后的样品与现配制的样品同时检测，每个浓度对比结果如下：

表4室温放置17h稳定-短期稳定性结果：

表5 -20℃条件下31d稳定-长期稳定性结果：

表6 -70℃反复冻融3次稳定性结果：

表7全血稳定性结果：

本发明的方法检测的血浆中各药物的浓度在上述考察条件下得出的CV值小于5％，提示在上述考察条件下本发明方法对血浆中阿比特龙检测具有较强的稳定性。

5.8比格犬血浆样品检测

于96孔板中精密加入50uL的阿比特龙浓度为1ng/ml的血浆样品，加入20uL的ISSpike，加入300uL乙腈于96孔板中，涡旋混合5min，于4℃以2490g离心10min，5uL进样到色谱系统进行LC-MS/MS分析，结果如图2所示。

结论：经方法学验证，本发明方法具有灵敏度高，适用性强，精密度和准确度良好、稳定性好的优点，药物的提取回收率在可接受范围内，未见明显基质效应，本发明方法还具有快速、通量高的优点。

5.9临床应用

9例雄性Beagle犬单次空腹经口灌服250mg(1片)醋酸阿比特龙片。于给药前0h和给药后0.25h、0.5h、0.75h、1h、1.25h、1.5h、1.75h、2h、2.5h、3h、3.5h、4h、6h采集前肢静脉血1～2mL。应用LC-MS/MS方法测定血浆样本中阿比特龙的浓度。具体数值如表8和图5所示。

表8 Beagle犬空腹经口灌服醋酸阿比特龙片后阿比特龙主要药动学参数

结论：运用本发明方法能快速、稳定、高效的检测血浆样本中阿比特龙的浓度，能应用于临床药代动力学的研究。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。