一种PEA检测用的试剂盒及其使用方法

技术领域

本发明涉及抗原检测技术领域，尤其涉及一种PEA检测用的试剂盒及其使用方法。

背景技术

假单孢菌又称绿脓杆菌，是一种条件致病菌，几乎可以感染人所有的体表组织和器官，由于假单胞菌在人体和自然界广泛存在，并且对多种抗生素不敏感，加之多种传播途径，它引起的医院内感染已成为控制院内交叉感染的棘手问题。

假单孢菌主要的毒力因子为外毒素A，即PEA，其为细菌感染过程中细菌体内产生的一种胞外酶。PEA合成后为71kd的前体蛋白。去掉25个氨基酸的信号序列后，以66kd的成熟蛋白形式分泌到上清。它有613个氨基酸残基组成，分3个结构功能区：I区为氨基酸末端区，与靶细胞识别有关，能与相应的表面受体结合；II区为跨膜区，与毒素的迁移定位有关；III区为羧基末端区，具有 ADP-核糖基转移酶活性，为毒素分子的活性部分。PEA与靶细胞表面受体结合，通过膜运动聚集于膜特化区。胞膜内陷形成胞内泡，小泡与溶酶体融合。PEA在转移定位至靶细胞的胞质溶胶后，通过抑制蛋白质合成导致细胞病变。研究证实，PEA在非毒性剂量下会影响免疫系统，从而抑制抗原抗体反应，并且PEA 在体外实验中还能抑制淋巴细胞的转化。经过长期实验发现，抗PEA抗体在假单孢菌感染的小鼠中表现出保护性作用。

PEA作为假单胞菌的主要毒力因子，成为评价假单孢菌感染的一个重要指标。目前，针对于PEA的检测主要采用荧光定量检测，检测用的RT-PCR设备成本高，且检测流程时间长，操作难度大，普遍仅适用于实验室研究。因此，开发一种特异性强，灵敏度高，使用方便，快速检测PEA的试剂盒对于研究假单胞菌的作用机理具有重要意义。

发明内容

有鉴于此，本发明提出了一种检测迅速，特异性强，灵敏度高，使用方便的PEA检测用的试剂盒及其使用方法。

本发明的技术方案是这样实现的：本发明提供了一种PEA检测用的试剂盒，包括PEA蛋白、抗PEA抗体、SABC、酶标板、酶底物溶液、稀释液、洗涤液和终止液，PEA蛋白作为生化指标，抗PEA抗体用生物素标记作为检测抗体标记物，抗PEA抗体包被的酶标板作为固相载体，SABC用于放大检测信号。

在以上技术方案的基础上，优选的，PEA蛋白为大肠杆菌表达的重组蛋白，其氨基酸序列为 GPADSGDALLERNYPTGAEFLGDGGDISFSTRGTQNWTVERLLQAHRQLEER GYVFVGYHGTFLEAAQSIVFGGVRARSQDLDAIWRGFYIAGDPALAYGYAQ DQEPDARGRIRNGALLRVYVPRSSLPGFYRTGLTLAAPEAAGEVERLIGHPLP LRLDAITGPEEEGGRLETILGWPLAERTVVIPSAIPTDPRNVGGDLDPSSIPDKE QAIS。

在以上技术方案的基础上，优选的，抗PEA抗体为抗PEA的多克隆抗体，其制备方法包括，用PEA蛋白免疫兔子获得含有抗PEA抗体的血清，再将血清经过PEA亲和柱纯化，并浓缩和透析后获得纯化的多克隆抗体。

在以上技术方案的基础上，优选的，酶标板为96孔酶标板。

在以上技术方案的基础上，优选的，酶底物溶液为TMB应用液。

在以上技术方案的基础上，优选的，稀释液为10mmol/L，pH7.2-7.4的磷酸盐缓冲液，其中含有1％的牛血清白蛋白和0.1％的proclin 300。

在以上技术方案的基础上，优选的，洗涤液为10mol/L，pH7.2-7.4的磷酸盐缓冲液，其中含有0.05％Tween-20和0.1％的proclin 300。

在以上技术方案的基础上，优选的，终止液为1.0mol/LH

另一方面，提供了一种PEA检测用的试剂盒的使用方法，包括以下步骤，

S1将待检样品用稀释液稀释后，投入酶标板的微孔中，使待检样品中的PEA 与固相载体上的抗PEA抗体结合，用洗涤液洗去未结合的杂蛋白和其他物质；

S2使步骤S1中的获得物与检测抗体标记物结合，用洗涤液洗去多余的生物素标记抗体；

S3向步骤S2中的获得物加入SABC，使SABC和生物素标记抗体形成复合物，用洗涤液洗去多余的SABC；

S4向步骤S3中的的获得物加入酶底物溶液，37℃下进行孵育反应，用终止液终止酶反应后检测显色强度。

本发明的一种PEA检测用的试剂盒及其使用方法相对于现有技术具有以下有益效果：

(1)本发明设计了一种新型的试剂盒，以生物素标记抗体作为检测抗体，采用双抗体夹心法提高检测的特异性和精确性，再利用SABC放大了检测信号，从而大大提高了ELISA检测的灵敏度，相比现有的实验室检测手段，高效迅速，操作流程短难度低，成本低廉。

(2)本发明中采用的蛋白为大肠杆菌表达的重组蛋白，特异性强，且兔免疫获得的抗体为多克隆体抗体，相较于现有的检测手段普遍使用的单抗或单抗和多抗组合，在保证了检测的快速、精确和灵敏的基础上，其获取手段更方便简单，成本更低。

附图说明

图1为本发明的实施例1至3的PEA剂量(浓度)-反应(吸光度)曲线。

具体实施方式

下面将结合本发明实施方式，对本发明实施方式中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施方式仅仅是本发明一部分实施方式，而不是全部的实施方式。基于本发明中的实施方式，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本发明保护的范围。

实施例1

本发明的一种PEA检测用的试剂盒，包括PEA蛋白、抗PEA抗体、SABC、酶标板、TMB应用液、含有1％的牛血清白蛋白和0.1％的proclin 300的 10mmol/L，pH7.2-7.4的磷酸盐缓冲液、含有0.05％Tween-20和0.1％的proclin 300 的0.25mol/L，pH7.2-7.4的磷酸盐缓冲液和1.0mol/LH

其中，PEA蛋白为大肠杆菌表达的重组蛋白，其氨基酸序列为 GPADSGDALLERNYPTGAEFLGDGGDISFSTRGTQNWTVERLLQAHRQLEER GYVFVGYHGTFLEAAQSIVFGGVRARSQDLDAIWRGFYIAGDPALAYGYAQ DQEPDARGRIRNGALLRVYVPRSSLPGFYRTGLTLAAPEAAGEVERLIGHPLP LRLDAITGPEEEGGRLETILGWPLAERTVVIPSAIPTDPRNVGGDLDPSSIPDKE QAIS。

具体的，抗PEA抗体为抗PEA的多克隆抗体，其制备方法包括，用PEA 蛋白免疫兔子获得含有抗PEA抗体的血清，再将血清经过PEA亲和柱纯化，并浓缩和透析后获得纯化的多克隆抗体。

另一方面，其使用方法，包括以下步骤，

S1将待检样品用含有1％的牛血清白蛋白和0.1％的proclin 300的10mol/L，pH7.2-7.4的磷酸盐缓冲液稀释后，投入酶标板的微孔中，使待检样品中的PEA 与固相载体上的抗PEA抗体结合，用含有0.05％Tween-20和0.1％的proclin 300 的10mol/L，pH7.2-7.4的磷酸盐缓冲液，洗去未结合的杂蛋白和其他物质；

S2使步骤S1中的获得物与检测抗体标记物结合，用10mol/L，pH7.2-7.4 的磷酸盐缓冲液洗去多余的生物素标记抗体；

S3向步骤S2中的获得物加入SABC，使SABC和生物素标记抗体形成复合物，用10mol/L，pH7.2-7.4的磷酸盐缓冲液洗去多余的SABC；

S4向步骤S3中的的获得物加入TMB应用液，37℃下进行孵育反应，用 1.0mol/LH

需要说明的是，ELISA检测，即酶联免疫吸附测定，是指将可溶性的抗原或抗体结合到聚苯乙烯等固相载体上，利用抗原抗体特异性结合进行免疫反应的定性和定量检测方法。

还需要说明的是，双抗体夹心法，是将抗PEA抗体结合到作为固相载体的酶标板表面，并保持其免疫活性，并使抗PEA抗体与酶连接成酶标抗体。这种酶标抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性。在测定时，使待检样品内的PEA 蛋白和酶标抗体进行抗原抗体结合反应，然后用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。在加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅进行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，故可极大的放大反应效果，从而使测定方法具有很高的敏感度。

在本发明中，通过步骤S1使待检样品中的PEA与固相载体上的抗PEA抗体结合，以及通过步骤S2中使获得物与检测抗体标记物结合，实现了双抗体夹心，然后用SABC放大反应效果，进而达到了提高检测灵敏度和精确度的目的。

实施例2和3为实施例1的相同条件下的复孔试验，试验结果如下表和图1 所示。其中，图1为PEA剂量(浓度)-反应(吸光度)曲线。

由此可知，本发明检测灵敏度小于46.9pg/ml，检测范围为78-5000pg/ml，剂量-反应曲线的线性相关系数大于0.990，具有简便，灵敏，准确，快速的优点，为快速定量检测PEA提供了有效的工具。

以上所述仅为本发明的较佳实施方式而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。