用于骨组织工程的支架材料及其制备方法
文献发布时间:2023-06-19 09:29:07
技术领域
本发明属于生物医学材料技术领域,具体涉及用于骨组织工程的支架材料及其制备方法。
背景技术
骨缺损的治疗一直以来是骨科临床上的难题之一。全球每年骨折和骨缺损的患者数以千万计,传统的治疗方法主要有自体骨移植、同种异体骨移植、人工骨移植,然而这些方法都存在较大的缺陷。自体骨移植作为骨移植技术的“金标准”,存在造成新的病损、来源有限、引起骨区感染、疼痛、手术时间长等缺陷;同种异体骨移植存在易被人体吸收,易感染,免疫排斥反应严重等;人工骨移植存在来源有限,成骨困难,原料孔隙率变异大等缺陷。由于现行骨缺损修复方法的种种缺陷,目前研究者们将修复骨缺损目标转向骨组织工程。
组织工程的核心为:建立细胞与生物材料的三维空间复合体,即具有生命力的活体组织,用来对病损组织进行形态、结构和功能的重建并达到永久性替代。组织工程包括三个关键因素:信号分子(生长因子、诱导因子)、支架材料和靶细胞。支架材料在构建组织工程化组织或器官中占有举足轻重的地位,不仅为特定的细胞提供结构支撑,有利于细胞的黏附、营养物质的交换、细胞增殖和分化并向支架内部迁移,为细胞生长提供合适的外部环境,而且还能起到模板的作用,引导组织再生和控制组织结构。
目前常用的组织工程支架材料包括可降解的生物活性无机材料、天然生物高分子和可降解合成高分子材料以及它们的复合材料。虽然近几年有关组织工程支架材料的研究很多,但至今尚未研制出一种理想的骨组织工程支架材料。如何制备出生物相容性、细胞亲和性、力学性能良好以及材料降解与细胞生长或成骨速度基本匹配的高孔隙率支架是目前组织工程研究急需解决的问题。解决问题的可行途径之一是通过两种或以上具有互补特性的生物可降解材料复合,并进行仿生设计、模拟和实验,制备性能优异的复合组织工程支架材料。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于骨组织工程的支架材料及其制备方法,该支架材料具有较高的孔隙率和连通性,骨传导性较强,力学性能优异;且具有较高的骨诱导活性,可促进新生骨组织生成;生物相容性良好,无毒,可生物降解。
本发明为实现上述目的所采取的技术方案为:
一种用于骨组织工程的支架材料,包括:
壳聚糖衍生物,由葫芦[n]脲接枝壳聚糖制得,其中,n=5~8;
氧化石墨烯;
砭石粉。壳聚糖是一个典型的天然材料在骨组织工程中以极大的优势,提供了高密度的阳离子表面,进而促进细胞的粘附,并未细胞的增殖和细胞外基质生产提供一个友好的微环境;且本身具有优异的生物相容性和抗菌性能;接枝葫芦[n]脲制得壳聚糖衍生物,结合两者特点,可形成物质传输定向通道;再与氧化石墨烯复合,通过不同的分子间作用力,形成有序的排列结构,使得材料具有相互连通的三维多孔结构。砭石粉以砭石为原料,经纳米技术萃取而成的粉末状物质,具有纳米尺寸,含有多种微量元素及稀土元素,分散在三维结构中,可促进成骨分化和细胞外基质矿化,抑制向破骨细胞分化;进而提高体外骨诱导性能,诱导其向成骨细胞转化,同时可调节成骨相关细胞因子和破骨细胞因子的表达。除此之外,还可进一步提升材料的力学性能。本发明制得的支架材料在体内能够促进新生骨组织生成,从而达到促进骨修复的目的;具有良好的生物相容性,无毒性。
优选地,葫芦[n]脲接枝壳聚糖的接枝率≥46%。
壳聚糖衍生物的制备方法,包括:
将葫芦[n]脲与过硫酸钾分散于水中,氮气保护下,加入壳聚糖,加热搅拌反应,过滤,收集清液,透析、沉淀、抽滤、洗涤、提纯,得到壳聚糖衍生物。
优选地,葫芦[n]脲与过硫酸钾的质量比为1:1.2~1.5;壳聚糖的加入量为0.05~0.08g/mL。
一种用于骨组织工程的支架材料的制备方法,包括:
取壳聚糖衍生物溶液,加入砭石粉和氧化石墨烯,超声;然后加入甘油,充分混匀、脱泡,冷冻、干燥得到支架材料。
优选地,壳聚糖衍生物溶液的浓度为5~8%,溶剂为3~5%的冰醋酸溶液。
优选地,砭石粉的质量为壳聚糖衍生物质量的8~10%;氧化石墨烯的质量为壳聚糖衍生物质量的0.5~0.8%。
优选地,甘油的加入量占壳聚糖衍生物质量的25~30%。
优选地,冷冻温度为-20~25℃,冷冻时间22~24h;所述干燥操作为真空冷冻干燥,时间为36~48h。
优选地,在支架材料的制备过程中加入托玛琳石,其加入量为壳聚糖衍生物质量的3~5%。托玛琳石的加入,形成微纳米级的孔道,提高支架材料内部孔隙的连通性,且孔隙率较高;支架中大孔隙为细胞和组织的长入提供足够的空间,小孔隙有利于支架内外物质交换,提高物质交换的效率,为支架内部细胞组织提供充足的营养物质,加快细胞代谢废物的排出;促进细胞外基质矿化,使得材料具有更好的骨传导性和骨整合性;除此之外还可维持较高的力学性能。
相比于现有技术,本发明具有如下有益效果:
葫芦[n]脲接枝壳聚糖制得壳聚糖衍生物,可形成物质传输定向通道;再于氧化石墨烯复合,形成有序排列的三维多孔结构;砭石粉分散在三维结构中,可促进成骨分化和细胞外基质矿化,抑制向破骨细胞分化,进而提高体外骨诱导性能。除此之外,还可进一步提升支架材料的力学性能。托玛琳石的加入,在维持支架材料良好的力学性能的同时,可提高其内部孔隙率和连通率,使得材料具有更好的骨传导性和骨整合性。本发明制得的支架材料在体内能够促进新生骨组织生成,从而达到促进骨修复的目的;具有良好的生物相容性,无毒性;可应用于骨组织工程。
因此,本发明提供了一种用于骨组织工程的支架材料及其制备方法,该支架材料具有较高的孔隙率和连通性,骨传导性较强,力学性能优异;且具有较高的骨诱导活性,可促进新生骨组织生成;生物相容性良好,无毒,可生物降解。
附图说明
图1为本发明试验例1中生物相容性测试结果对比示意图;
图2为本发明试验例1中ALP活性测试结果对比示意图;
图3为本发明试验例1中成骨分化性能测试结果对比示意图;
图4为本发明试验例1中TRAP活性测试结果对比示意图;
图5为本发明试验例1中破骨分化性能测试结果对比示意图;
图6为本发明试验例2中体内骨再生性能测试结果对比示意图;
图7为本发明试验例3中孔隙率和连通率测试结果对比示意图;
图8为本发明试验例3中力学性能测试结果对比示意图。
具体实施方式
以下结合具体实施方式和附图对本发明的技术方案作进一步详细描述:
本发明实施例所用壳聚糖购自济南海德贝有限公司,葫芦[6]脲、葫芦[7]脲、葫芦[8]脲均购自上海纳孚生物科技有限公司。
实施例1:
壳聚糖衍生物的制备:
将葫芦[6]脲与过硫酸钾(质量比为1:1.2)分散于水中,水的用量为葫芦[6]脲质量的25倍,通氮气30min;接着加入壳聚糖衍生物(加入量为0.05g/mL),在氮气保护下,加热搅拌反应10小时,反应完毕后过滤除去不溶物,收集清液;将此清液稀释后,在硫酸钾稀溶液中透析48小时,将透析袋中的物质倒入10倍体积的沉淀剂中沉淀,抽滤后所得固体用水及沉淀剂反复洗涤5次提纯,得到壳聚糖衍生物。通过红外光谱技术测定接枝率的方法测定葫芦[6]脲接枝壳聚糖的接枝率为64%。
氧化石墨烯溶液的制备:
取氧化石墨烯,加入适量去离子水,400W超声3min,得到浓度为2mg/mL的氧化石墨烯水溶液,并用NaOH调定其pH值为9。
用于骨组织工程的支架材料的制备:
配制浓度为5%的壳聚糖衍生物溶液,加入砭石粉和氧化石墨烯溶液,质量分别为壳聚糖衍生物的8%和0.5%;超声使其均匀分散至壳聚糖衍生物溶液中,然后加入占壳聚糖衍生物质量30%的甘油,充分混匀,真空脱泡;倒入直径为5cm的表面皿中,于-20℃冰箱内冷冻24h,真空冷冻干燥48h,得到支架材料。
实施例2:
壳聚糖衍生物的制备与实施例1不同之处在于:用葫芦[7]脲代替葫芦[6]脲,接枝率为56%。
氧化石墨烯溶液的配制与实施例1相同。
用于骨组织工程的支架材料的制备与实施例1不同之处在于:砭石粉和氧化石墨烯的质量分别为壳聚糖衍生物质量的9%和0.6%。
实施例3:
壳聚糖衍生物的制备与实施例1不同之处在于:用葫芦[8]脲代替葫芦[6]脲,接枝率为52%。
氧化石墨烯溶液的配制与实施例1相同。
用于骨组织工程的支架材料的制备与实施例1不同之处在于:砭石粉和氧化石墨烯的质量分别为壳聚糖衍生物质量的10%和0.8%。
实施例4:
壳聚糖衍生物的制备与实施例1不同之处在于:用葫芦[5]脲代替葫芦[6]脲,接枝率为71%。
氧化石墨烯溶液的配制与实施例1相同。
用于骨组织工程的支架材料的制备与实施例1不同之处在于:砭石粉和氧化石墨烯的质量分别为壳聚糖衍生物质量的8.5%和0.7%。
实施例5:
壳聚糖衍生物的制备与实施例1相同。
氧化石墨烯溶液的配制与实施例1相同。
用于骨组织工程的支架材料的制备与实施例1不同之处在于:制备过程中加入托玛琳石粉,加入量为壳聚糖衍生物质量的3%。
实施例6:
壳聚糖衍生物的制备与实施例2相同。
氧化石墨烯溶液的配制与实施例1相同。
用于骨组织工程的支架材料的制备与实施例5相同。
实施例7:
壳聚糖衍生物的制备与实施例3相同。
氧化石墨烯溶液的配制与实施例1相同。
用于骨组织工程的支架材料的制备与实施例5相同。
实施例8:
壳聚糖衍生物的制备与实施例5相同。
氧化石墨烯溶液的配制与实施例1相同。
用于骨组织工程的支架材料的制备与实施例5不同之处在于:不添加砭石粉。
对比例1:
壳聚糖衍生物的制备与实施例1相同。
氧化石墨烯溶液的配制与实施例1相同。
用于骨组织工程的支架材料的制备与实施例1的不同之处在于:不添加砭石粉。
对比例2:
氧化石墨烯溶液的配制与实施例1相同。
用于骨组织工程的支架材料的制备与对比例1不同之处在于:用壳聚糖代替壳聚糖衍生物。
试验例1:
1、成骨分化实验
1.1体外rBMSCs-OVX的分离培养
本次动物实验均严格按照《实验动物护理和使用指南》进行。骨质疏松大鼠模型的建立采用双侧卵巢切除(OVX)的16周龄SD大鼠,并通过术后3个月体重和腰椎骨密度(BMD)的测量确定。通过戊巴比妥钠处死OVX大鼠后,采用10mL杜尔贝科改良的伊格尔培养基(DMEM,Gibco,USA)加10%胎牛血清(Gibco,USA)和100U/mL青霉素-链霉素冲洗大鼠股骨和胫骨的骨髓,进而从OVX大鼠体内收集BMSCs。原始BMSCs-OVX在37℃、5%CO
1.2细胞活性和增殖评估
通过细胞计数Kit-8测定支架上培养的rBMSCs-OVX,并在不同时间点进行评估。简而言之,1.0×10
对对比例1~2、实施例1、实施例5制得的支架材料进行上述测试,结果如图1所示。从图中分析可知,随着天数的增长,支架材料上的rBMSCs-OVX均有明显的增殖,说明制得的支架对细胞无毒性。在培养1d的时候,细胞在各个支架上的生长并无明显差异,但在4d和7d时,实施例1制得的支架材料上细胞活性>1.25,明显高于对比例1和对比例2,表明加入砭石粉后,可增强支架材料的生物相容性,更有利于细胞在其上生长和增殖。且实施例5稍好于实施例1,表明托玛琳石的加入具有协同增强的作用。
1.3碱性磷酸酶(ALP)活性
ALP是骨矿化过程中重要的胞外酶,是骨分化的早期物质。按照5×10
对对比例1~2、实施例1~7制得的支架材料进行上述测试,结果如图2所示。分析可知,与实施例1制得的支架材料共培养的细胞的ALP活性明显高于对比例1和对比例2,且效果稍好于实施例2~4,表明支架材料中加入砭石粉有利于成骨分化。而实施例5~7的效果好于实施例1~3,表明托玛琳石的加入具有协同增强的作用。
1.4RT-qPCR分析
按照2×10
表1RT-qPCR反应中使用的引物序列
对对比例1、对比例2、实施例1、实施例5进行上述测试,结果如图3所示。分析可知,与对比例1和对比例2相比,实施例1制得的支架材料中,Runx-2、OCN、OPG因子的mRNA表达量明显上升,蛋白水平增加,RANKL因子的mRNA表达量明显下降,导致OPG/RANKL比值升高,表明其成骨分化能力越强。结果说明砭石粉加入支架材料可以调节成骨细胞因子的mRNA表达含量,促进成骨分化。实施例5的效果好于实施例1,表明托玛琳石的加入具有一定的协同增强作用。
2、破骨分化实验
2.1体外骨髓来源的巨噬细胞(BMMs)的分离培养
通过分离与培养骨髓来源的巨噬细胞(Bone marrow-derved macrophages,BMMs)以获得破骨细胞分化的前体细胞。股骨和胫骨的骨髓细胞经过冲洗后,从6周大的C57/BL6雄性小鼠的骨髓中提取原始骨髓来源的巨噬细胞。分理出的细胞在含10%的牛血清蛋白(FBS)、1%青霉素/链霉素和30ng/mL M-CSF的α-MEM培养基中进行。细胞培养物在37℃、5%CO
2.2破骨细胞分化及抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色
基于成熟破骨细胞表达特异性的抗酒石酸酸性磷酸酶,通过TRAP染色实验观察破骨细胞分化状态并探究支架材料对破骨细胞分化的影响。将BMMs细胞与支架材料在24孔transwell细胞培养板中共培养,加入含有30ng/mL M-CSF和50ng/mL NF-κB受体激活蛋白配体(Receptor activator of nuclear factor-κB ligand,RANKL)的完全α-MEM培养基。每隔一天更换一次培养基,直到第7d左右在对照孔中观察到多核的“薄饼”形的成熟破骨细胞形成,随后将细胞进行多聚甲醛固定并按照生产商的说明使用TRAP染色试剂盒进行细胞染色。将包含3个及3个以上细胞核的TRAP染色阳性多核细胞计数为破骨细胞,并在光学显微镜下拍照。在每个样品的五个随机选择的视野中,使用Image J软件对TRAP染色阳性区域的总面积和破骨细胞的总数量进行定量分析。
对对比例1、对比例2、实施例1、实施例5进行上述测试,结果如图4所示。分析可知,与对比例1和对比例2相比,与实施例1制得的支架材料共培养的BMMs在TRAP-阳性多核破骨细胞数量和面积均出现明显下降;表明砭石粉加入支架材料可以很好地抑制破骨细胞的形成。且实施例5效果好于实施例1,说明托玛琳石的加入具有协同增强的作用。
2.3RT-qPCR分析
用30ng/mL M-CSF和50ng/mL RANKL刺激7d后,用TRIzol试剂从与支架材料共培养的细胞中提取总mRNA。然后,逆转录合成cDNA,并利用ABI 7500测序系统进行实时荧光定量PCR检测相关基因如:NFATcl、Cathepsin K(CTSK)、DC-STAMP、c-Fos的表达。使用以下循环条件:在93℃下初始变性2min;随后进行40个重复循环,分别为90℃、60s,55℃、60s和72℃、60s;最后在72℃延伸7min。表2为测试中使用的引物序列,并将所有基因的相对表达水平以管家基因GAPDH进行了标准化。
表2RT-qPCR反应中使用的引物序列
对对比例1、对比例2、实施例1、实施例5进行上述测试,结果如图5所示。分析可知,与对比例1和对比例2相比,实施例1制得的支架材料中,NFATcl、CTSK、DC-STAMP、c-Fos因子的mRNA表达量明显降低,蛋白水平均出现显著下调,与TRAP测试结果一致。表明支架材料中加入砭石粉后对破骨细胞的形成具有较强的抑制效果。且实施例5的效果好于实施例1,表明托玛琳石的加入起到一定的协同增强作用。
试验例2:
动物体内实验
建立双侧临界大小的颅骨缺损模型。首先在戊巴比妥钠(40mg/kg)麻醉下,沿矢状缝切开1.0至1.5cm钝性切开显露颅骨。在去除骨膜后,使用电钻在颅骨两侧形成两个直径为5mm的全层缺损。最后,在18只OVX大鼠中产生36个大小相同的颅骨缺损,填充在支架材料上。术后每只动物腹腔注射抗生素。此外,在前14d和7d,分别给予大鼠10mg/kg calcein(Sigma-Aldrich)和30mg/kg alizarin red(Sigma-Aldrich)的腹腔注射。植入后12周,大鼠腹腔通过注射过量戊巴比妥钠处死。然后收集所有颅骨组织并于4%多聚甲醛溶液中固定,然后进行显微ct。
Micro-CT重建分析
采用18μm分辨率的Micro-CT(μCT-100,SCANCO,Switzerland)检测颅骨组织植入物。X射线的电压为70KV,电流为200μA和300ms的曝光时间。经扫描后,使用3D Creator软件重建三维图像。定量分析新形成的骨矿化组织的数量。根据重建的微ct图像,使用CTAn软件进行分析,计算骨密度(BMD)和骨体积与组织体积之比(BV/TV,%)。
对对比例1、对比例2、实施例1、实施例5进行上述测试,结果如图6所示。分析可知,与对比例1和对比例2相比,实施例1制得的支架材料组新骨形成的主要指标骨密度和骨量/组织体积比要明显高于对比例制得的支架材料,表明砭石粉的存在可以提升成骨性能。且实施例5效果好于实施例1,表明加入托玛琳石起到协同增强的效果。
试验例3:
1、孔隙率测试
用液体代替法来测试支架材料的孔隙率。将支架材料放入已知体积(V
孔隙率(%)=(V
2、Micro-CT检测
将支架材料置于样品台上,并做好固定;在高分辨(4K)下对支架材料进行扫描和三维重建,具体参数如下:电压45kV,电流145μA,积分时间400ms,体素分辨率1μm;利用分析软件CTan对材料的连通率进行分析。
对对比例1~2、实施例1、实施例3、实施例5、实施例7、实施例8进行上述两项测试,结果如图7所示。从图中分析可知,实施例1制得的支架材料的孔隙率和连通率均高于对比例1~2,且实施例5和实施例7的效果明显好于实施例1、实施例3。表明砭石粉加入后制得的支架材料具有较好的孔隙率和较好的连通性;而托玛琳石的存在使得支架材料的孔隙率及连通率具有明显的增高,且实施例8的效果好于对比例1也可证明托玛琳石的增强作用。
3、力学性能测试
将支架材料制备成1cm×1cm×1cm大小的样品,通过万能力学试验机进行压痕测试。取直径为1mm的压头,以0.2mm/min的速度压至材料厚度的1/10即停止,测试5个样品,取平均值。根据下列公式计算材料的弹性模量(E)和压缩强度(P):
E=F(1-ν
其中,F:压力;ν:泊松比;R:压头半径;δ:位移。
P=Eδ/[πR
其中,E:弹性模量;ν:泊松比;R:压头半径;δ:位移。
对对比例1~2、实施例1、实施例2、实施例5、实施例6、实施例8进行上述两项测试,结果如图8所示。从图中分析可知,实施例1制得的支架材料的压缩强度高于对比例1~2,表明砭石粉加入后制得的支架材料具有较好的力学性能;且实施例5和实施例7的效果与实施例1、实施例3相当甚至稍有提升,表明托玛琳石的存在使得支架材料具有较高孔隙率及连通率的同时,可以维持较好的力学性能。而实施例8的效果好于对比例1表明托玛琳石对材料力学性的提升具有一定的增强作用。
上述实施例中的常规技术为本领域技术人员所知晓的现有技术,故在此不再详细赘述。
以上所述,仅为本发明的具体实施方式,但本发明的保护范围并不局限于此,任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内,可轻易想到变化或替换,都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此,本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。
- 一种用于骨组织工程的光固化复合材料及基于其的骨组织工程支架
- 用于骨组织工程的支架材料及其制备方法