一种商陆果实发酵液及其制备方法和用途

技术领域

本发明属于生物医药、食品以及保健品领域，具体涉及一种商陆果实发酵液及其制备方法以及其在制备治疗癌症的药物、食品和保健品中的用途。

背景技术

商陆Phytolaccae acinosa Radix是传统中药，以多年生的根入药，苦寒，归肺、脾、肾、大肠经，具有逐水消肿、解毒散结、利尿功效，外用解毒散结，用于治疗水肿、胀满、痈肿等症，现代临床也用于肝腹水型肿瘤、水肿等疾病的治疗。商陆始载于《神农本草经》，列为下品，并记载“商陆，味辛、平，主水胀、瘤痹，熨除痈肿，杀鬼精物”。汉代《名医别录》曰“商陆味酸，疗胸中邪气，水肿，痪痹，腹满，疏五脏，散水气”。晋代葛洪《肘后方》中记载：“治卒肿满身面皆洪大，商陆根一斤(刮去皮，薄切之)，煮令烂，去滓，入羊肉一斤，下葱豉盐如食法，随意令之，肿瘥后变宜作此。亦可常捣商陆，与米中拌蒸作饼子，食之”。弘景曰：方家不甚用，惟疗水肿，切生根，杂鲤鱼煮作汤服。道家乃散用之，及煎酿服……其实子亦入神药。花名荡花，尤良。《救荒本草》谓之章柳，子、根、苗、茎并可蒸食云。

《中国药典》规定商陆的原植物来源有2个品种，即商陆Phytolacca acinosaRoxb.和垂序商陆Phytolacca americana L.，但二者毒性相差显著。通过本草考证和现代研究均证明商陆毒性小，曾经作为食材使用，而垂序商陆毒性剧烈。在长期的混用中，一般中医普遍认为其是有毒中药，可引起呕吐、头痛、腹泻等症，故临床上少用或限制使用。但在民族医药中，如彝族、蒙古族、土家族、苗族民间就较为常用。南朝《雷公炮炙论》记载“商陆花白者，年多后仙人采之用作脯，可下酒也”。唐代孙思邈《千金翼方》“根苗并堪食，色紫者味尤佳，更胜白者，净洗熟蒸，并无毒”。之后便有商陆食疗的用法。而至宋代《太平圣惠方》：“明目，益听”，更明确认为其有补益作用。明代李时珍《本草纲目》“商陆昔人亦种为蔬，取白根及紫色者孽破，作畦栽之，亦可种子。根苗并可洗蒸食，或用灰法煮过亦良，服丹砂、乳石人食之尤利”。

商陆为多年生植物，其果序顶生或侧生、聚伞状，单株成熟鲜果年产量为5～15kg，可连续多年，产量极大，资源丰富，但是其鲜果一直未得到有效的开发、利用。采用毒性小的商陆Phytolacca acinosa Roxb.鲜果为原料，鲜果中除含有与根中一致的皂苷类、黄酮类、蒽醌类、酚酸、甾醇化学成分外，还含有大量的果胶类多糖、蛋白、微量元素等，可为发酵提供充足的营养物质，另外鲜果中含有丰富的天然共生菌种，为鲜果发酵提供了条件保障。发酵制成的鲜果发酵液，具有逐水消肿、散结止痛的功效，在我国民间用于癌症、艾滋病、动脉硬化、皮肤病等的治疗，疗效显著。

发明内容

本发明提供一种商陆果实发酵液及其制备方法，并且分离并鉴定了所述发酵液中的混合发酵菌种以及治疗活性成分，进而获得一种发酵过程可控，发酵产物明确，可用于癌症、艾滋病、动脉硬化、皮肤病等重大、疑难疾病的治疗，为临床提供新的解决方案。

第一方面，本发明提供一种商陆鲜果发酵液的制备方法，所述方法包括以下步骤：

(1)发酵母液的制备：取成熟、新鲜的商陆果，压碎，自然发酵，并不断搅拌，可以适量加入无机盐类和白砂糖调整培养条件，充分发酵，即制得发酵母液；

(2)第一次发酵液的制备：取新鲜、成熟的商陆果，洗净，沥去水分，阴凉处晾至六七成干，置于非铁质的发酵容器内，加入2～3％的发酵母液，与商陆果混合均匀，于20～30℃，有氧发酵30～60天，加入适量白砂糖、有机酸进行糖度和酸度调整，分离发酵液，即制得第一次发酵液；

(3)第二次发酵液的制备：再将第一次发酵液置于非铁质容器内，置于5～25℃冷处，避光密封、静置，在厌氧条件下，再次充分发酵30天以上，得到第二次发酵液，即商陆果实发酵液。

在其中一个实施方式中，所述发酵母液的制备中，加入鲜果重量0.1～0.5％的磷酸铵和15％～25％结晶白砂糖调整培养条件；第一次发酵液的制备中，加入鲜果重量15％～25％的白砂糖调整糖度，加入鲜果重量0.5％～2.0％的柠檬酸调整酸度。

按照前述制备商陆果实发酵液的方法获得的发酵液，所述的商陆果实发酵液的发酵菌群是以Penicillium sublateritium、Golubeviapallescens、Aspergilluspenicillioides、Aspergillus parvulus、Meyerozyma guilliermondii、Candidaintermedia、Lodderomyces elongisporus和Aspergillus sydowii八种菌种为主要特征构成。

第二方面，本发明提供一种根据上述制备方法得到的商陆鲜果发酵液，所述商陆鲜果发酵液中含有Penicillium sublateritium、Golubevia pallescens、Aspergilluspenicillioides、Aspergillusparvulus、Meyerozyma guilliermondii、Candida intermedia、Lodderomyces elongisporus和Aspergillus sydowii八种菌的混合菌种，其中，与发酵前的鲜果相比，发酵液中每种菌的丰度至少增加100倍以上。

第三方面，本发明提供一种商陆果发酵液，所述发酵液含有蒽醌及其苷类以及商陆多糖作为活性成分，所述蒽醌及其苷类包括式(A)至式(F)的化合物，所述商陆多糖由阿拉伯糖(Ara)∶鼠李糖(Rha)∶半乳糖醛酸(GalUA)∶甘露糖(Man)∶葡萄糖(Glc)∶半乳糖(Gal)按摩尔比12∶6∶1∶20∶30∶36组成；

所述商陆鲜果发酵液由商陆鲜果以包括Penicillium sublateritium、Golubeviapallescens、Aspergillus penicillioides、Aspergillus parvulus、Meyerozymaguilliermondii、Candida intermedia、Lodderomyces elongisporus和Aspergillussydowii八种菌的混合菌为发酵菌种制备而成。

第四方面，本发明提供一种商陆鲜果发酵液，所述发酵液由商陆鲜果以包括Penicillium sublateritium、Golubevia pallescens、Aspergillus penicillioides、Aspergillus parvulus、Meyerozyma guilliermondii、Candida intermedia、Lodderomyces elongisporus和Aspergillus sydowii八种菌的混合菌为发酵菌种制备而成。

发酵过程是以特定菌种为核心的复杂生物化学反应过程，所以还要有一定的环境条件。为了进一步说明本发明，所述的制备商陆果实发酵液的方法，除了采用合适的发酵菌种外，其发酵条件特征在于：采用成熟、新鲜的商陆果，商陆鲜果不得霉败、腐烂；第一次发酵天数是30～60天，发酵温度20～30℃；第二次发酵天数是30天以上，可以适当调整发酵液的糖度、酸度、无机盐含量，以及环境的温度、湿度、溶氧，以保证以8种菌种为特征菌种的发酵能够顺利进行，经过筛选的适宜湿度为相对湿度70～80％、溶氧。

但是在此基础上不限于添加以促进、保证定向发酵顺利进行的其它新的菌种，添加了一种或若干其它菌种，不会对优势菌种发酵结果形成明显差异的，均落入本发明。

另外，采用Penicillium sublateritium、Golubevia pallescens、Aspergilluspenicillioides、Aspergillus parvulus、Meyerozyma guilliermondii、Candidaintermedia、Lodderomyces elongisporus和Aspergillus sydowii八种菌种的任何一种菌种和/或两种以上菌种任意组合的混合菌种，作为发酵菌种所制备的发酵液，亦落入本发明。

第五方面，本发明提供一种前述的商陆鲜果发酵液在制备治疗疾病的药物中的用途，所述疾病选自癌症、艾滋病、动脉硬化和皮肤病。

第六方面，本发明提供一种前述的商陆鲜果发酵液在制备治疗癌症的药物中的用途，其特征在于，所述癌症选自肝癌、肺癌、胰腺癌、宫颈癌、乳腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌、前列腺癌，优选肝癌。

进一步地，所述药物可制备成口服液体制剂或固体制剂，所述固体制剂选自片剂、胶囊剂、颗粒剂。

第七方面，本发明提供一种前述的商陆鲜果发酵液在制备非治疗目的的饮食品或保健食品中的用途。

第八方面，本发明提供一种非治疗目的的饮食品，其包含前述的商陆鲜果发酵液。

第九方面，本发明的商陆果发酵液的用法：商陆果发酵液可以直接配制成口服液体制剂；也可以采用常规提取、纯化、干燥等方法制成其提取物、干燥物或固形物，将其作为原料药，加入药学、保健品、食品上可接受的赋形剂或辅料，制备其它药物制剂、保健品、食品等。

附图说明

图1鲜果液(PAR-1)和发酵母液、第一次和第二次发酵液(PAR-2)菌种的种水平热图对比

图2商陆果发酵液中小分子成分的结构式

图3商陆果发酵液对H22肝癌荷瘤小鼠瘤重的影响

根据本发明的方法制备的商陆鲜果发酵液，其中发酵菌种明确，发酵过程可控，发酵液的质量稳定，并且具有明确的药理活性成分，对癌症有显著地治疗效果。

具体实施方式

实施例1商陆果发酵液的制备

发酵母液的制备：取新鲜成熟的商陆果，压碎，自然发酵，并不断搅拌，加入鲜果重量0.1％～0.5％的磷酸铵和鲜果重量16％的结晶白砂糖调整培养条件，充分有氧发酵，即制得发酵母液。

第一次发酵液制备：取新鲜成熟商陆果200kg，洗净，沥去水分，阴凉处晾至六七成干，备用。将净商陆果置于PVC塑料桶内，加入占鲜果质量2～3％的发酵母液。加入鲜果重量15％～25％的白砂糖进行糖度调整，加入鲜果重量0.5～2％柠檬酸进行酸度调整。于20～30℃，有氧发酵30～60天，分离或压榨分离发酵液，即得。

第二次发酵液制备：再将第一次发酵液置于PVC塑料桶内，静置、沉降、避光、贮藏，厌氧发酵，充分发酵30天以上，即为第二次发酵，分离得到上清发酵液，即得商陆果发酵液。

实施例2商陆发酵菌种的鉴定

发酵菌种是获得目标发酵产物的关键，本发明发酵菌种的鉴别包括以下步骤：

取样：用冻存管分别取鲜果样本、实施例1的商陆果发酵液样本各3ml，直接放入液氮中进行速冻1h时间，然后把冻存管用封口袋做好标记进行分装，放入-80℃冰箱进行保存。

2.进行基因组DNA提取，提取步骤：

1)将样本进行匀浆裂解：在2mL beads Tube中，加入0.25～0.5g样品和0.6mLBuffer SOL，在涡旋仪上最高速度涡旋5～10min；加入60μL Buffer SDS至样品中，涡旋15s。

2)进一步裂解细菌：将样品放入70℃水浴锅中恒温10min，短暂离心收集管壁上的液滴。

3)加入200μL Buffer PS和150μL Absorber Solution至裂解液中，涡旋混匀20s，室温静置5min，期间偶尔颠倒2～3次，13kg离心5min。

4)转移上清液至2mL离心管中，加入等体积Buffer GDP，颠倒混匀，制成混合溶液。将DNA柱装入收集管，把离心管中的混合溶液转移一半至DNA柱中，13kg离心30～60s，倒弃流出液，再将剩下的混合液转移到DNA柱中重复离心操作，倒弃流出液，把DNA柱装回收集管中。

5)加400μL Buffer GDP至DNA柱，13kg离心30～60s，倒弃流出液，把DNA柱装回收集管中。

6)再加600μL Buffer GDP至DNA柱，13kg离心30～60s，倒弃流出液，把DNA柱装回收集管中。

7)重复步骤6。

8)将DNA柱装在1.5mL离心管中，加入50μL预热至70℃Buffer的AE至柱子的膜中央，放置3～5min，13kg离心1min。丢弃DNA结合柱，将DNA保存在2～8℃冰箱中。

9)引物序列为：

GATGAAGAACGYAGYRAATCCTCCGCTTATTGATATGC，进行目标区域PCR扩增，将扩增产物回收、定量。

3.进行DNA的16S、ITS测序，文库扩建、数据库检索：文库定量及测序使用AMPureXP Beads对第二轮扩增产物进行纯化，用ABI StepOnePlus Real-Time PCR System(LifeTechnologies，产地美国)进行定量，根据Hiseq2500的PE250模式pooling上机测序。

4.测序结果

根据菌种的丰度值，最后确定商陆鲜果经过发酵后的发酵液中主要发酵菌种为Penicillium sublateritium、Golubevia pallescens、Aspergillus penicillioides、Aspergillus parvulus、Meyerozyma guilliermondii、Candida intermedia、Lodderomyces elongisporus、Aspergillus sydowii八种菌种。其中Penicilliumsublateritium为1种青霉菌；Golubevia pallescens、Meyerozyma guilliermondii、Candida intermedia、Lodderomyces elongisporus为酵母类；Aspergilluspenicillioides、Aspergillus parvulus、Aspergillus sydowii为曲霉菌类。鲜果液(标记为PAR-1)和发酵液(标记为PAR-2)的菌种水平热图见附图1，鲜果液(PAR-1)和发酵液(PAR-2)菌种的种水平丰度表见表1。

表1 鲜果液(PAR-1)和发酵液(PAR-2)菌种的种水平丰度表

实施例3商陆鲜果发酵液的制备

采用8种菌种进行发酵

取200kg新鲜成熟的商陆果，洗净，沥去水分，于阴凉处晾至六七成干，将其放入PVC塑料桶内，加入Penicillium sublateritium、Golubevia pallescens、Aspergilluspenicillioides、Aspergillus parvulus、Meyerozyma guilliermondii、Candidaintermedia、Lodderomyces elongisporus、Aspergillus sydowii八种菌种，依次按照滴度比例3.37:3.31:2.32:2.16:1.52:1.45:1.11:1加入菌种，再加入2.5kg白砂糖和0.6kg柠檬酸对发酵液的糖度和酸度进行调整，发酵环境白天温度25～30℃，夜间温度19～27℃，发酵30天后，用纱布压榨分离制得第一次发酵液。

将得到的第一次发酵液放置于干净的PVC塑料桶中，密封避光，厌氧发酵，静置，白天温度15～27℃，夜间温度8～20℃，再次发酵30天，充分沉降，弃去沉淀，得第二次发酵液，即得到以8种菌种发酵的商陆果发酵液。该商陆果发酵液可以直接配制成口服液体制剂，也可作为原料使用。

实施例4商陆果发酵液的制备

采用8种菌种外加2种菌种混合发酵

取200kg新鲜成熟的商陆果，洗净，沥去水分后于阴凉处晾至六七成干，将其放入PVC塑料桶内，加入Penicillium sublateritium、Golubevia pallescens、Aspergilluspenicillioides、Aspergillus parvulus、Meyerozyma guilliermondii、Candidaintermedia、Lodderomyces elongisporus、Aspergillus sydowii八种菌种，另加入Candida parapsilosis、Malassezia restricta两种菌种依次按照滴度比例3.37:3.31:2.32:2.16:1.52:1.45:1.11:1:0.5:0.5加入菌种，利用此10种菌种共同发酵，再加入2.5kg白砂糖和0.6kg柠檬酸对发酵液的糖度和酸度进行调整，发酵环境白天温度25～30℃，夜间温度19～27℃，发酵30天后，用纱布压榨分离制得第一次发酵液。

将得到的第一次发酵液放置于干净的PVC塑料桶中，密封避光，密封避光，厌氧发酵，静置，白天温度15～27℃，夜间温度8～20℃，二次发酵60天，充分沉降，弃去沉淀，得第二次发酵液，即得到商陆果发酵液。

实施例5商陆鲜果发酵液中活性成分的分离和鉴定

为了进一步说明目标发酵液的物质组成，本发明对商陆果采用8种混合菌种进行发酵所获得的发酵液的化学小分子成分和多糖大分子成分的组成进行了分析和鉴定。

1、小分子药物活性成分的分离和鉴定

取实施例2制备的商陆果发酵液，冷冻干燥，加入适量乙醇使醇浓度在80-85％，静置醇沉，重复一次，合并上清液，减压旋转蒸发浓缩至无醇味，加质谱级甲醇稀释至10ul/ml，进行Q-TOF-MS分析。数据用Marker View软件进行主成分分析，负离子模式下采集数据，化合物通过Peak View2.0/masterview1.0软件，依据精确质量数和同位素峰度比筛查化合物，再通过对照品及数据库Natural products HR-MS/MS Spectral Library 1.0software中对照品二级谱图比对进行裂解规律分析，确定发酵液的成分组成，结果见表2。

表2 MS2 of sample based on ESI-QTOF

经数据库检索得出各化合物的结构式，鉴定为醌类以及其苷类成分A-F，结果见附图2。

2、商陆果发酵液的大分子多糖成分分析

取实施例2制备的商陆果发酵液，冷冻干燥，加少量水复溶，加入适量乙醇使醇浓度在80％，静置醇沉，重复三次，得到总多糖沉淀物。进一步采用Sevage法除蛋白，流水透析48h，纯水透析24h除小分子，冻干，即得精制总多糖。采用完全酸水解、柱前衍生，GC-MS法，进行单糖组成分析。商陆果发酵液中的多糖主要由阿拉伯糖(Ara)∶鼠李糖(Rha)∶半乳糖醛酸(GalUA)∶甘露糖(Man)∶葡萄糖(Glc)∶半乳糖(Gal)按摩尔比12∶6∶1∶20∶30∶36组成，其中半乳糖和葡萄糖含量较高，甘露糖次之，鼠李糖、半乳糖醛酸含量较低。

实施例6商陆果发酵液对H22荷瘤小鼠的抗肿瘤作用研究

试药：取商陆发酵液进行冷冻干燥，得到发酵液的冻干品，按冻干品的质量计算，用一定量的纯水复溶配制成低(0.75g/kg)、中(1.5g/kg)、高(3g/kg)剂量的混悬液进行给药。阳性药：环磷酰胺，按0.07g/kg给药。

瘤株：小鼠H22肝癌细胞株，购于上海富衡生物科技有限公司。取生长状态良好的H22细胞接种于小鼠腹腔内，接种量为0.2ml，体内连续传代3次后，取腹部膨胀明显小鼠腹水，加入适量生理盐水，调整细胞密度为1×10

动物、模型：SPF级ICR小鼠，雌雄各半，体重17.3-30.5g，由黑龙江中医药大学实验动物中心提供，合格证编号：SCXK黑：2013-004。在小鼠腋窝下进行接种，将50只小鼠按照性别和体重随机分为商陆果发酵液低、中、高剂量组，环磷酰胺组和模型对照组(等体积生理盐水)。

给药方法：每天记录小鼠体质量，小鼠接种后第三天开始，每天给药一次，连续给药14天，末次给药后，剥离皮下瘤组织，称重。

统计方法：抑瘤率(％)＝(1-给药组瘤重/模型组瘤重)×100％

采用SPSS16.0进行统计学处理，数据均采用

结果见表3。

表3 商陆果发酵液对H22荷瘤小鼠体重的影响

注：与给药前比较

由表3可见，给药前，各组之间体重无明显的差异性(P>0.05)；给药14天后，各组体重分别同给药前比较，环磷酰胺组体重明显降低(P<0.01)，商陆果发酵液各组无明显的差异性；给药14天后，商陆果发酵液各组同环磷酰胺组比较，商陆果发酵液中、低剂量组具有明显的差异性(P<0.05)。

表4 商陆果发酵液对H22荷瘤小鼠肿瘤重量的影响

注：与模型组比较

由表4可见，给药14天后，各给药组同模型组比较，瘤重明显降低(

实施例7商陆鲜果发酵液制备口服液体制剂

将制得的商陆果发酵液直接在口服液灌装生产线，灌装于50ml棕色避光直口玻璃瓶中，制成口服液，避光阴凉处保存，即得。

实施例8商陆鲜果发酵液制备肠溶硬胶囊制剂

商陆鲜果发酵液5L，加入药用无水磷酸氢钙粉末400g，混合均匀，冷冻干燥，得冻干粉末，再加入无水磷酸氢钙粉末400g，混合均匀，过80目筛，填充于肠溶硬胶囊中，即得。本剂型可以适当减轻商陆果发酵液因发酵乙醇等含量较高，所产生的对胃的刺激作用。

实施例9商陆鲜果发酵液制备肠溶软胶囊制剂

商陆鲜果发酵液5L，加入药用无水磷酸氢钙粉末400g，混合均匀，冷冻干燥，得冻干粉末，再加入适量的乳化剂、油脂等药用辅料，制成半固体填充药料，填充于肠溶软胶囊中，即得。本剂型可以适当减轻商陆果发酵液因发酵乙醇等含量较高，所产生的对胃的刺激作用。

以上所述仅为本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原料的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。