达玛烷三萜皂苷化合物及其应用

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，尤其是达玛烷三萜皂苷化合物及其应用。

背景技术

青钱柳属胡桃科。它是青钱柳属中唯一的一种植物，主要分布在中国南部和东南部。由于这种植物叶子甘甜，所以该植物被命名为“甜茶树”。青钱柳在中国被用作治疗糖尿病和高脂血症的民间药物。青钱柳叶在2013年被国家卫生委员会批准为新的食品原料。目前，青钱柳是功能性食品市场上重要的、有价值的保健食品原料。在过去的三十年里，植物化学家对该植物提取物进行了大量的分离和纯化，发现了100多种次生代谢物，尤其是发现了达玛烷三萜皂苷类化合物。达玛烷三萜皂苷是近年来研究非常热门的一类次生代谢产物，这种化合物可从多种植物中提取，如青钱柳、人参、三七、绞股蓝等，它们具有多种生物活性，如神经保护、抗氧化、抗炎、抗高血糖、抗肿瘤以及抗高脂等作用。

2型糖尿病（T2DM）和肿瘤仍是当今社会发病率较高的两种疾病，目前，这两种疾病的治疗手段仍然有限，因此当务之急是研究和开发相应的新的防治方法。达玛烷三萜皂苷因其在预防糖尿病和癌症方面的积极作用而受到越来越多的关注。特别是近年来对富含达玛烷三萜皂苷的胡桃科植物青钱柳更是给予了更多的研究关注，而发掘更多达玛烷三萜皂苷类化合物成为研究的热点。

发明内容

本发明公开了达玛烷三萜皂苷化合物及其应用，其从青钱柳中分离出来，并能应用于制备抗肿瘤药物中。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：

本发明提供了一种具有通式（Ⅰ）的化合物达玛烷三萜皂苷F：

本发明还提供了一种具有通式（Ⅱ）的化合物达玛烷三萜皂苷K：

本发明进一步提供了以上所述的化合物达玛烷三萜皂苷F或以上所述的化合物达玛烷三萜皂苷K的制备方法，包括以下步骤：

S1. 青钱柳叶粉碎后，用体积分数为60~90%乙醇在室温下浸泡，得提取液，把提取液减压浓缩，回收溶剂得到浸膏；

S2. 浸膏悬浮于水中，然后用乙酸乙酯进行萃取，乙酸乙酯萃取物用硅胶柱进行色谱分离，以体积比依次为9:1、8:2、2:1、1:1和0:1的氯仿-甲醇梯度系统进行洗脱，得到样品组分Fr. A、Fr. B、Fr. C、Fr. D；

S3. 将样品组分Fr. A用MCI柱进行洗脱，依次用体积分数为 50%、90%甲醇-水洗脱得到组分A1和A2；

S4. 用硅胶柱纯化组分A2，以体积比依次为1:0、10:1、2:1、1:1和0:1的石油醚-乙酸乙酯进行洗脱，得到五个组分A2a、A2b、A2c、A2d、A2e；

S5. 在制备型高效液相色谱上对组分A2c进行分离，依次用体积分数为50%、60%、70%、80%、90%和100%甲醇-水洗脱，流速为10 mL/min，得到6个组分A2cI、A2cⅡ、A2cⅢ、A2cⅣ、A2cⅤ、A2cVI；

S6. 组分A2cⅢ经半制备高效液相色谱法分离，用体积分数为65% CH

更进一步的，所述步骤S1中，乙醇的浓度为70%。

更进一步的，所述步骤S6中，甲醇-水的体积分数为75%。

本发明还提供了以上所述的化合物达玛烷三萜皂苷F或化合物达玛烷三萜皂苷K在制备抗肿瘤药物中的应用。进一步的，所述抗肿瘤药物为抗结肠癌、肝癌、宫颈癌、肺癌和乳腺癌药物。

本发明还提供了一种抗肿瘤药物，含有以上所述的化合物达玛烷三萜皂苷F和/或化合物达玛烷三萜皂苷K作为活性成分。

本发明从青钱柳叶中提取出新化合物达玛烷三萜皂苷F和达玛烷三萜皂苷K，其具有较好的抗肿瘤活性，对青钱柳抗肿瘤活性成分的确定具有重要意义，也为青钱柳在功能性食品和抗肿瘤药物上的应用开发提供了更广阔的思路。

附图说明

图1a是化合物达玛烷三萜皂苷F的

图2是化合物达玛烷三萜皂苷F的关键NOESY相关图；图2b是化合物达玛烷三萜皂苷K的

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明的保护范围不限于以下实施例。

实施例1：化合物的提取和分离

（1）材料和方法

一般实验程序利用JASCOP-1020数码相机测量旋光度；红外由NICOLET iS10和BRUKERTENSOR27红外光谱仪测量，溴化钾压缩；紫外光谱采用岛津UV2401PC紫外分光光度计测定；LC四极杆质谱仪（LC-MS8030，日本岛津）；质谱通过采用液相色谱-质谱法（安捷伦1290UPLC/6540 Q-TOF，安捷伦6210 ESI/TOF MS）测定；1D和2D 核磁共振谱在Bruker DRX-500MHz和avance III600 MHz上进行；Combi Flash Rf (RF200, Teledyne Isco, Inc.,USA)；高效液相色谱仪（安捷伦LC1260 infinity，安捷伦）；旋转蒸发器（RE-52A，上海亚龙生化仪器厂）；电子天平（BS400S，北京赛多利斯有限公司；美国梅特勒-托利多XS105双量程）；半制备高效液相色谱仪：RP柱（Zorbax SB-C18，5μm，9.4×250 mm，美国安捷伦公司）；制备型高效液相色谱仪：Prep C18，OBD, 5μm，19×250 mm，美国Waters公司）。

硅胶（100-200目，中国青岛海洋化工股份有限公司）用于柱色谱（CC）；薄层色谱法采用玻璃预涂硅胶GF254（中国青岛海洋化工股份有限公司）；倒置填料（RP-18，Merk）。MCI填料（MCI gel CHP-20P，日本三菱）；RP柱（Zorbax SB-C18，5μm，9.4×250 mm，美国安捷伦公司）；L-阿拉伯呋喃糖、L-阿拉伯吡喃糖、D-喹诺酮、D-葡萄糖和1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP）（阿拉丁公司，中国上海）；氯仿、石油醚、乙酸乙酯、甲醇（AR，均购自中国西龙科技有限公司）；α-糖苷酶（G0660-750UN，SIGMA，德国）；阿卡波糖（109A032，solarbio，北京索莱宝科技有限公司）；pNPG（N0493，东京化学工业株式会社）。

（2）植物原料

青钱柳（50.0 kg）于2017年9月在中国广西资源县采集，并由黄德清副教授（桂林医学院药学院）鉴定。凭证样本（编号201709001）已存入桂林医学院药学院。

（3）提取和分离步骤

S1. 青钱柳叶粉碎后，用体积分数为70%乙醇在室温下浸泡浸泡3次，每次3天，得提取液，把提取液减压浓缩，回收溶剂得到浸膏。

S2. 浸膏悬浮于适量的水中，然后用乙酸乙酯进行萃取，乙酸乙酯萃取物用硅胶柱（100-200目，20×150 cm，8.25 kg）进行色谱分离，以体积比依次为9:1、8:2、2:1、1:1和0:1的氯仿-甲醇梯度系统进行洗脱，得到样品组分Fr. A、Fr. B、Fr. C、Fr. D。

S3. 将样品组分Fr. A（1.65kg）用MCI柱（10×60cm）进行洗脱，依次用体积分数为50%、90%甲醇-水洗脱得到组分A1和A2；

S4. 用硅胶柱纯化组分A2（0.80 kg），以体积比依次为1:0、10:1、2:1、1:1和0:1的石油醚-乙酸乙酯进行洗脱，在TLC分析的基础上得到五个组分A2a、A2b、A2c、A2d、A2e；

S5. 在制备型高效液相色谱上对组分A2c（265.0 g）进行分离，依次用体积分数为50%、60%、70%、80%、90%和100%甲醇-水洗脱，流速为10 mL/min，得到6个组分A2cI、A2cⅡ、A2cⅢ、A2cⅣ、A2cⅤ、A2cVI；

S6. 组分A2cⅢ（137.0 mg）经半制备高效液相色谱法分离，用体积分数为65% CH

实施例2 化合物分析

化合物1：CypaliurusideF（1），无色粉末（甲醇）。[α]

化合物2：CypaliurusideK（2），无色粉末（甲醇）。[α]

糖绝对构型测定：两个化合物1和2分别在80°C水浴中用1 M 盐酸回流2小时，反应混合物用碳酸钠中和，氯仿萃取3次，水层在真空下蒸发干燥，用硅胶薄层色谱（水：甲醇：二氯甲烷= 1：8：12）分别检测这两个化合物的水层中是否存在D-鸡纳糖。

表1. 化合物1和2的氢谱数据（

表2. 化合物1和2的碳谱数据（

Cypaliuruside F(1)的分子式为C

通过

CypaliurusideK（2）为白色粉末，在质谱中显示出分子离子峰[M+Na]

用青钱柳甙Z

实施例3 抗肿瘤活性测定

细胞毒性试验

实验使用的人类肿瘤细胞系：结肠癌（Lovo）、肝癌（HepG2）、宫颈癌（Hela）、肺癌（NCI-H460）和乳腺癌（T47D），均来自ATCC (Manassas, VA, USA)。以顺铂（DDP）和紫杉醇为阳性对照，用MTT法检测化合物1和2对所有细胞株的体外细胞毒性活性。

所有细胞均在DMEM培养基（Gibco，中国）中培养，培养基中添加10%FBS（胎牛血清）（Gibco，德国），在培养温度37℃、含5% CO

统计分析：所有实验分三次进行，抑制率和IC

检测结果如表3所示：

表3. 青钱柳化合物对人肿瘤细胞系的细胞毒性，IC50值（μM）（n=3）。

如表3所示，化合物1和2对五种人类肿瘤细胞系都具有显著的抗肿瘤活性，其IC