一种具有抑制HT-29细胞增殖及益生功能的长双歧杆菌及应用

技术领域

本发明涉及一种具有抑制HT-29细胞增殖及益生功能的长双歧杆菌及应用，属于微生物技术应用领域。

背景技术

人肠道菌群是最为复杂的微生态系统之一，人体肠道中定植有数量巨大的微生物，这些微生物与宿主之间相互影响、共同进化，与人体健康具有密切的联系。大量的研究结果表明，肠道微生物影响宿主肠道细胞的增值和免疫系统的发育，它们与许多人类疾病相关，例如肥胖、炎症性肠病(IBD)、肠道病原菌感染、肝硬化、糖尿病等。长双歧杆菌作为人类肠道菌群中的优势菌，它与宿主之间存在共生关系，对于维持正常肠道菌群和人体健康具有重要作用。因此，一些特定的长双歧杆菌菌株可以作为益生菌，用于某些肠道疾病的干预治疗。微生物胞外多糖(EPS)是由某些微生物合成并分泌到胞外的一类大分子聚合物，它可以提高菌体对胃肠道环境的耐受能力，保护菌体免受宿主免疫系统的影响。

一些长双歧杆菌产生的胞外多糖可以调节宿主的免疫反应，降低宿主的炎症水平，对结肠炎起到防治作用。目前用于治疗炎症性肠病的药物主要包括抑炎类药物、免疫抑制剂以及抗生素等，这些药物通常只能缓解疾病症状，并不能达到治疗的目的，且长期使用可能导致副作用，例如过敏和肝脏疾病。而长双歧杆菌作为健康人肠道中的共生菌，通过与肠道免疫系统的相互作用，对宿主具有一定的免疫调节作用，且对人体没有毒副作用。胞外多糖是长双歧杆菌对宿主产生免疫调节作用的重要机制，不同微生物产生的胞外多糖由于单糖组成、分子结构的不同，其功能也存在差异。有研究表明，黏性胞外多糖一般具有较大的分子量，且具有抑制免疫反应的作用，而低分子量的胞外多糖通常可以促进免疫反应。因此，筛选一株可以合成黏性胞外多糖的长双歧杆菌，对于开发用于治疗结肠炎或尤其引发的结肠癌的药物具有重要意义和广阔前景。

结肠腺癌是结肠腺上皮来源的常见消化道恶性肿瘤，属于结肠癌多种病理类型中的一种，其病因尚未明确，但本病的发生与多脂肪少纤维的饮食有关，腺瘤状息肉、结肠血吸虫、非特异性溃疡性结肠炎、结肠腺癌细菌性痢疾、阿米巴肠病等亦与本病发生密切相关。约40％的结肠癌分布于直肠及直肠乙状结肠曲，其余分布于乙状结肠、盲肠、升结肠、降结肠、横结肠及肝、脾曲等处。结肠腺癌是结肠癌中类型最常见的一种，其余分类有粘液腺癌及未分化癌，大体形态可呈息肉状、溃疡型等。临床表现为结肠癌起病隐匿，早期仅见粪便隐血阳性，逐步为血便、痢疾样脓血便，里急后重，有时呈顽固性便秘，大便形状变细，或糊状大便，或腹泻与便秘交替，这些改变成为结肠癌的突出表现。病人常有不同程度的腹痛，常有糜烂、坏死和继发性感染，如发生在右侧则会产生右腹部钝痛，有时出现餐后腹痛。左侧结肠癌常并发肠梗阻，时有腹部绞痛，伴有腹胀、肠鸣音亢进等。腹部肿块多见于右腹部，是右侧结肠癌的表现之一，提示已到中晚期，肿块表面可有结节感，一般可以推动，但到肿瘤晚期时则固定，合并感染时可有压痛。结肠癌的患者可出现进行性贫血，低热，进行性消瘦，恶液质，肝肿大、浮肿、结肠腺癌黄疸和腹水等。

因此，寻找新的治疗药物，有效控制结肠炎的发展，并阻止结肠炎的癌变，一直是研究者们关注的热点。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种具有抑制HT-29细胞增殖及益生功能的长双歧杆菌及应用，可以制备缓解结肠炎或结肠癌的食品或药物，解决上述技术问题。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种具有抑制HT-29细胞增殖及益生功能的长双歧杆菌，其特征在于，所述长双歧杆菌的菌株编号为 BB20071001，分类命名为长双歧杆菌Bifidobacterium longum，保藏号为： CGMCC No 4470，保藏日期为2010年12月14日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号远3号。

所述长双歧杆菌具有如下性质：

(1)具有耐酸性，在pH3.0-9.0环境条件下生长良好，在pH2.5环境下存活良好；

(2)具有粘附性和抑制性，能够较好地粘附在结肠癌细胞HT-29上并抑制结肠癌细胞HT-29的增殖。

本发明的有益效果是：本发明所述的长双歧杆菌BB20071001分离自健康婴儿的肠道菌群，该菌株具有较好的耐受模拟胃肠液的能力，且对人体无毒副作用，具有抑制HT-29细胞增殖及益生功能，可缓解结肠炎或结肠癌，用其制备出的相关食品或药物，相对于用于治疗结肠炎或结肠癌的传统药物具有一定的优势，具有广阔的市场前景。

本发明还涉及一种所述具有抑制HT-29细胞增殖及益生功能的长双歧杆菌在制备具有缓解结肠炎或结肠癌的食品或药物方面的应用。

在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。

进一步，所述缓解结肠炎或结肠癌的食品或药物为发酵乳或微胶囊。

进一步，所述发酵乳的制备方法包括以下步骤：

(1)发酵乳原料的准备：将乳粉、蔗糖、酵母粉分别按120～140g/L、60～70g/L、1～2g/L的比例与水混匀，然后65～75℃杀菌处理20-40min；

(2)将发酵剂以质量分数0.1～1‰添加到发酵乳原料中，37～39℃发酵4～8h，制得发酵乳制品；所述发酵剂由所述长双歧杆菌BB20071001、保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌组成。

进一步，所述发酵剂中的长双歧杆菌BB20071001、保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌按质量比为1-8:1:1。

进一步，所述微胶囊的壁材包括变性蛋白与多糖，芯材为长双歧杆菌BB20071001；其中，所述变性蛋白与多糖的质量比为1-5:1，微胶囊的含菌量为10

进一步，所述壁材还包括冻干保护剂，冻干保护剂、变性蛋白与多糖的质量比为12.5-25:1-5:1。

进一步，所述变性蛋白为变性乳清蛋白或变性明胶；所述多糖为海藻酸钠、壳聚糖或阿拉伯胶；所述冻干保护剂为甘油、海藻糖或脱脂奶粉。

进一步，所述微胶囊的制备方法包括以下步骤：

(1)培养活化的长双歧杆菌BB20071001，将发酵液离心，并用生理盐水洗涤菌体，得到长双歧杆菌湿菌体；

(2)将蛋白溶液的pH调节至7.0-8.5，加热使其充分变性，然后将其与多糖溶液混合，灭菌，得到蛋白-多糖混合溶液；将氯化钙溶液的pH调节至 6.0-8.5，灭菌；

(3)在无菌条件下，将步骤(1)得到的湿菌体加入到步骤(2)得到的蛋白- 多糖混合溶液中，混合均匀后将其滴加到氯化钙溶液中固化，无菌过滤、洗涤，得到湿润的微胶囊；

(4)将步骤(3)得到的湿润的微胶囊冷冻干燥，得到长双歧杆菌微胶囊。

具体实施方式

以下对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

实施例1长双歧杆菌BB20071001的分离筛选

本发明具有抑制HT-29细胞增殖及益生功能的长双歧杆菌是通过大量实验从若干份婴儿粪便中筛选出来的最优菌株，其具体筛选方法如下：

(一)乳酸菌的分离筛选

(1)收集若干份出生一周龄的婴儿粪便，将粪便样品在含有低聚果糖的MRS+0.5‰-1‰(质量百分数)半胱氨酸培养基中富集12h；

(2)将粪便样品进行梯度稀释后涂布于添加了质量百分数为0.02％溴甲酚紫的MRS+0.5‰-1‰半胱氨酸的固体平板上，培养24-48h；

(3)选取变色圈明显，并且符合乳酸菌基本形态(乳白色、半透明、圆形、菌落表面湿润、边缘整齐等)的单菌落进行平板划线纯化，筛选分离出乳酸菌；

(4)将上述单菌落于液体MRS+0.5‰-1‰(质量百分数)半胱氨酸中培养 24h后进行革兰氏染色，选取革兰氏阳性菌进行后续试验。

(二)筛选具有抑制HT-29细胞增殖及益生功能的菌株

(1)在超净工作台内，将前面得到的革兰氏阳性菌分别接种到10ml MRS 液体培养基中，使用厌氧管在恒温恒湿箱中于36.5-37.5℃温度下培养12h，重复传代2-3次，得到不同菌株的菌液。

(2)人结肠癌细胞株HT-29生长于含10％胎牛血清的DMEM培养基中，温度37℃，5％CO

(3)收集对数期人结肠癌细胞，调整细胞悬液浓度为5×10

(4)5％CO

(5)5％CO

(6)终止培养，小心吸去孔内培养液；

(7)每孔加入150μl二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解，在酶联免疫检测仪OD490nm处测量各孔的吸光度值(A值)；

(8)实验重复3次；

(9)计算抑制率。

经MTT比色法测定和重复测量方差分析得出其中一株菌株具有最高的 HT-29细胞抑制率，从而获得具有抑制HT-29细胞增殖及益生功能的菌株，利用形态特征、培养性状和生理生化特征等微生物学特性以及16SrDNA等分子生物学手段对该菌株鉴定为长双歧杆菌，将其进行菌种保藏，编号为 BB20071001，分类名称为Bifidobacterium longum，保藏编号为：CGMCC No 4470，保藏日期：2010年12月14日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心。

该长双歧杆菌BB20071001的生物学特性如下：

菌落特征：在MRS+0.5‰(质量百分数)半胱氨酸的培养基上生长良好，形成乳白色、半透明、凸面圆形菌落，直径约3mm，菌落表面光滑、湿润，边缘整齐。细胞形态长而弯曲，棍棒状，部分呈哑铃形，无运动性，不产芽孢。

生长特性：该菌株的最低生长温度为20℃，最高生长温度为45℃，该菌株以37℃的生长温度为最佳，最高和最低初始生长pH为9.0和3.0，最适生长初始pH为6.8。

实施例2：利用长双歧杆菌BB20071001制备发酵乳

准备原料，乳粉、蔗糖、酵母均采用市售常规产品，购买市售酸奶发酵剂(保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌质量比1:1)，将长双歧杆菌BB20071001 株连续活化3代后，按2％的接种量接种到添加了0.05％半胱氨酸盐酸盐的 MRS培养基培养基中，37℃厌氧培养24h，8000g离心30min，收集菌泥，用生理盐水清洗2次，按菌泥重量的3倍添加冻干保护剂(120g/L脱脂乳粉、100g/L海藻糖、150g/L蔗糖和余量的水)，混合均匀后进行真空冷冻干燥，最后将冻干得到的菌粉真空包装。制得的菌粉的活菌浓度可达1×10

方案1：(1)发酵乳原料的准备：将乳粉、蔗糖、酵母粉分别按120g/L、 70g/L、1g/L的比例与水混匀，然后65℃杀菌处理40min；

(2)将发酵剂以质量分数0.1‰添加到发酵乳原料中，37℃发酵8h，制得发酵乳制品；所述发酵剂由所述长双歧杆菌BB20071001、保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌按质量比1:1:1组成。

方案2：(1)发酵乳原料的准备：将乳粉、蔗糖、酵母粉分别按140g/L、 60g/L、2g/L的比例与水混匀，然后75℃杀菌处理20min；

(2)将发酵剂以质量分数1‰添加到发酵乳原料中，39℃发酵4h，制得发酵乳制品；所述发酵剂由所述长双歧杆菌BB20071001、保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌按质量比8:1:1组成。

方案3：(1)发酵乳原料的准备：将乳粉、蔗糖、酵母粉分别按130g/L、 65g/L、1.2g/L的比例与水混匀，然后70℃杀菌处理30min；

(2)将发酵剂以质量分数0.5‰添加到发酵乳原料中，38℃发酵6h，制得发酵乳制品；所述发酵剂由所述长双歧杆菌BB20071001、保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌按质量比5:1:1组成。

所得发酵乳具有良好的感官和理化性质，口感细腻、粘滑，无不良味道，风味与传统发酵无明显差异，而因其含有长双歧杆菌BB20071001，可以实现缓解结肠炎或结肠癌的作用。

实施例3：利用长双歧杆菌BB20071001制备微胶囊

方案1：以长双歧杆菌BB20071001为芯材，以海藻酸钠和乳清蛋白为壁材。

(1)菌株的制备：在超净工作台内，将0.1ml冻存的长双歧杆菌 BB20071001的菌液接种到10ml MRS液体培养基中，使用厌氧管在恒温恒湿箱中于36.5-37.5℃温度下培养12h，重复传代2-3次，得到活化的长双歧杆菌。

将活化的长双歧杆菌按0.1％的体积比接种到250ml MRS液体培养基中，置于恒温恒湿箱中，在36.5-37.5℃温度下培养15h，4500rpm离心15min 收集菌体。然后用0.9％生理盐水洗涤菌体，在4500rpm下离心15min，重复洗涤2次后，得到泥状的长双歧杆菌湿菌体。

(2)将乳清蛋白加入到去离子水中，使用磁力搅拌器，在室温(25℃左右) 下搅拌2h，然后置于4℃环境中静置过夜，以确保乳清蛋白完全溶解水合，次日平衡至室温，用1mol/LNaOH调节其pH至8.0，得到8wt％的乳清蛋白溶液，80℃下水浴加热30min使其充分变性。

将海藻酸钠加入到去离子水中，室温下搅拌至均匀分散，于4℃环境中静置过夜，次日平衡至室温后，得到4wt％的海藻酸钠溶液。

将变性的乳清蛋白溶液和多糖溶液混合，其中乳清蛋白与海藻酸钠的质量比为1:1，磁力搅拌使其混合均匀，在100℃沸水浴中灭菌30min，作为壁材待用。

(3)配制3wt％的氯化钙溶液，用1mol/LHCl调节其pH值至6.0，121℃灭菌20min，待用。

(4)在超净工作台内，把离心得到的菌体加入到壁材中，小心搅拌使混合均匀，避免进入气泡。在磁力搅拌器的作用下，用2ml无菌注射器吸取上述混合液，垂直滴入氯化钙凝固浴中，即形成微胶囊颗粒。湿胶囊在氯化钙溶液中固化30min，用无菌筛过滤，用0.9％无菌生理盐水洗涤2-3次，得到湿润的微胶囊。

(5)将湿润微胶囊在真空冷冻干燥机中冷冻干燥24-48h，得到冻干的长双歧杆菌微胶囊，其含菌量约为10

方案2：以长双歧杆菌BBMN68为芯材，以海藻酸钠、乳清蛋白和甘油为壁材。

多糖溶液通过将多糖溶解在50wt％的甘油水溶液中制备而得，最终产品中甘油、海藻酸钠和乳清蛋白的质量比为12.5:1:1，其它具体制备方法同上述方案1。

方案3：具体制备方法同方案2，但将海藻酸钠溶解于50wt％的甘油水溶液中，其中甘油与海藻酸钠的质量比为25:1，将其与8wt％的乳清蛋白混合，最终产品中甘油、乳清蛋白与壳聚糖的质量比为25:5:1。

方案4：具体制备方法同方案1，但将8wt％乳清蛋白溶液的pH调节至 7.0，并与3wt％的壳聚糖溶液混合得到蛋白-多糖混合溶液，其中乳清蛋白与壳聚糖的质量比为5:1，微胶囊的含菌量约为10

方案5:具体制备方法同方案1，但将4wt％的明胶溶液的pH调节至8.5，并与5wt％的阿拉伯胶溶液混合得到蛋白-多糖混合溶液，其中明胶与阿拉伯胶的质量比为2:1，微胶囊的含菌量约为10

此外，在其他具体实施的方案中，壁材还可以是其他多糖(如壳聚糖、阿拉伯胶)、其他蛋白(如明胶)和其他冷冻干燥保护剂(如海藻糖、脱脂奶粉等)的复配，不局限于上述方案中的列举。

通过上述方案得到的所述微胶囊具体较好的耐胃酸能力以及肠溶性，可以通过胃部进入肠道，并在肠道中快速崩解释放出长双歧杆菌，其可用于制备治疗结肠炎或结肠癌的药物，也可以加入至酸奶等食品中，起到缓解结肠炎、防止结肠炎的癌变的作用。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。