治疗阿尔茨海默氏病的化合物

技术领域

本发明涉及用于治疗阿尔茨海默氏病的化合物、组合物和方法。

背景技术

阿尔茨海默氏病是最常见的神经退行性疾病，也是老年人痴呆症的最常见病因。截止2015年9月，该病已影响全球4750万人。65岁以后其患病率为5％，并且随着年龄的增长呈指数增长(80岁以上的人口有25％受到影响)，但该患病也可以更早发生。

阿尔茨海默氏病的特征是神经元的进行性和不可逆转的丧失。这种丧失导致认知能力的下降，例如记忆、语言、推理，以及时空定向能力的消失。最终，患者无法识别熟悉的人或执行普通的行为。

阿尔茨海默氏病似乎(至少部分)是由于大脑中存在形成所谓淀粉样斑的β-淀粉样肽的胞外沉积物所致。这些斑块导致周围神经元功能障碍，并最终导致神经元死亡。β-淀粉样肽包含36至43个氨基酸，并衍生自经由β-分泌酶和γ-分泌酶导致的淀粉样前体蛋白(APP)的异常酶促裂解。该肽是不溶的且几乎不降解。此过程通常始于海马体，然后逐渐扩展到大脑皮层的不同区域。

目前，尚无该疾病的药物治疗方法。

实际上，当前在此背景下批准的药物，例如多奈哌齐(Rogers等，(1998)ArchIntern Med.158:1021-3)是一种抗胆碱酯酶，旨在减缓疾病的症状发展，但不能预防神经元变性和死亡。

因此，针对阿尔茨海默氏病需要这些化合物的替代疗法，特别是除了治疗症状之外，还要改变这种疾病的病理机制。

发明内容

本发明源于本发明人对Q碱(queuine)作为神经保护剂在预防或治疗阿尔茨海默氏病中的潜力的认识。不希望受特定理论的束缚，本发明人相信，Q碱可以对参与导致淀粉样斑形成的病理机制的蛋白质的错误折叠进行预防或发挥有益作用。

因此，本发明涉及Q碱、Q碱的前体、Q碱的衍生物或Q碱的立体异构体、Q碱的类似物或其药学上可接受的盐或水合物，其用于预防或治疗阿尔茨海默氏病。

本发明涉及下式(I)的化合物或其药学上可接受的盐或水合物，其用于预防或治疗个体的阿尔茨海默氏病：

其中：

-R

其中：

·R

·R

·R

-R

·具有1至20个碳原子的烷基，

·具有3至20个碳原子的芳基或杂芳基，

·具有3至20个碳原子的环烷基或杂环烷基，

·羟基，

·具有1至20个碳原子的羰基或羧基，

·环氧基，

·-O-R

·-O-CO-R

本发明还涉及以下式(II)表示的下式(I)的化合物或其药学上可接受的盐或水合物，其用于预防或治疗个体的阿尔茨海默氏病：

其中：

-a表示双键或环氧基，

-R

其中：

·R

·R

·R

-R

在本发明的一个实施方案中，如上定义使用的式(I)化合物，特别是式(II)化合物或其药学上可接受的盐或水合物与至少一种其它化合物组合用于预防或治疗阿尔茨海默氏病。

本发明还涉及药物组合物，其包含作为活性物质的如上定义的式(I)的化合物，特别是式(II)的化合物或其药学上可接受的盐或水合物，任选地与至少一种药学上可接受的赋形剂或媒介物结合，用于预防或治疗阿尔茨海默氏病。

在本发明的一个实施方案中，上述药物组合物还包含至少一种可用于预防或治疗阿尔茨海默氏病的其它化合物。

本发明还涉及药物组合物，其包含作为活性物质的式(I)的化合物，特别是式(II)的化合物或如上定义的其药学上可接受的盐或水合物，还包含至少一种可用于预防或治疗阿尔茨海默氏病的其它化合物，并任选地与至少一种药学上可接受的赋形剂或媒介物结合。

本发明还涉及产品，其包含：

-如上定义的式(I)的化合物，特别是式(II)的化合物，或其药学上可接受的盐或水合物，

-至少一种用于预防或治疗阿尔茨海默氏病的其它化合物，

所述产品为一种组合制剂，用于同时、分开或依次预防或治疗个体的阿尔茨海默氏病。

本发明还涉及一种膳食补充剂，其包含如上定义的式(I)的化合物，特别是式(II)的化合物，或其药学上可接受的盐或水合物，其用于减少阿尔茨海默氏病的风险。

在本发明的一个实施方案中，如上定义的膳食补充剂任选地包含其它化合物，所述其它化合物优选地选自维生素、矿物质、脂肪酸、氨基酸和抗氧化物。

本发明还涉及用于预防或治疗个体中的阿尔茨海默氏病的方法，其包括向所述个体施用有效量的如上定义的式(I)的化合物，特别是式(II)的化合物，或其药学上可接受的盐或水合物。

在本发明的一个实施方案中，如上定义的方法进一步包括给药至少一种可用于预防或治疗阿尔茨海默氏病的化合物。

本发明还涉及如上定义的式(I)的化合物，特别是式(II)的化合物在制备用于预防或治疗个体阿尔茨海默氏病的药物中的用途。

在本发明的一个实施方案中，如上所定义的药物还包含至少一种可用于预防或治疗阿尔茨海默氏病的化合物。

式(I)的化合物

如上定义的式(I)化合物可以由本领域技术人员容易地化学合成，特别地，如Barnett&Grubb(2000),Tetrahedron56:9221-9225、Oxenfordet al.(2004)TetrahedronLetters45:9053-9055、Brookset al.(2010)Tetrahedron Letters51:4163-4165、Gerberet al.(2012)Org.Biomol.Chem.10:8660-8668、Allen Brook的题目为“Synthesisof Tritium Labeled Queuine,PreQ

简要地通过举例来说，可以根据以下反应方案合成Q碱：

另外，可以从天然来源(例如微生物，特别是细菌)或从植物(特别是从被α-变形菌(例如根瘤菌，中慢生根瘤菌和中华根瘤菌)结瘤的植物)中提取和任选纯化如上定义的式(I)的化合物。

举例来说，可以从如下制备的tRNA，特别是tRNA

在酸性条件下制备总RNA

枯草芽孢杆菌(B.subtilis)菌株(或其他相关细菌)在含有适当补充剂的ED液体培养基中于37℃恒定通风条件下生长。将新鲜的过夜培养物接种在15ml的ED培养基中至在600nm(OD600)处的光密度为0.1。细胞在37℃下生长至OD600为1，并在-80℃于70mM(HepespH 7.5)中在等体积的60％甲醇中冷却。所有随后的步骤均在冷条件下进行，并且将用于所制备的粗品RNA的溶液用焦碳酸二乙酯处理并灭菌。在4℃下使细胞沉淀，用水洗涤，然后重悬于0.5ml的10％葡萄糖、11mM Tris、10mM EDTA中。将悬浮液转移至装有0.1g酸洗玻璃珠的试管中(sigma-Aldrich，G4649)。将试管放入装有50g干冰的

富集tRNA

然后将所制备的总RNA与一体积的氯化锂(8M，pH 4.5)和终浓度为0.01mM的乙酸钠(pH 5.2)混合。将该RNA溶液在-80℃下孵育2小时。在4℃以14,000rpm离心15分钟后，tRNA保留在上清液中。为了除去盐污染物，通过加入0.3M pH 5.2的乙酸钠和2.5体积的无水乙醇，在-80℃使tRNA沉淀1小时。然后，通过在4℃以14,000rpm离心15分钟使tRNA沉淀成颗粒，并用70％乙醇洗涤。将该tRNA颗粒溶解在10mM Tris，1mM EDTA(pH 7.5)中。

根据本发明的Q碱的立体异构体可以是任何类型。优选地，Q碱的立体异构体是对映体-Q碱。

根据本发明的药学上可接受的盐或水合物可以是任何类型。然而，优选地，根据本发明的药学上可接受的盐是盐酸盐。

优选地，根据本发明的糖基选自甘露糖基、半乳糖基或谷氨酰基。

优选地，氨酰基选自丙氨酸(ala,A)、精氨酸(arg,R)、天冬酰胺(asn,N)、天冬氨酸(asp,D)、半胱氨酸(cys,C)、谷氨酰胺(gln,Q)、谷氨酸(glu,E)、甘氨酸(gly,G)、组氨酸(his,H)、异亮氨酸(ile,I)、亮氨酸(leu,L)、赖氨酸(lys,K)、蛋氨酸(met,M)、苯丙氨酸(phe,F)、脯氨酸(pro,P)、丝氨酸(ser,S)、苏氨酸(thr,T)、色氨酸(trp,W)、酪氨酸(tyr,Y)和缬氨酸(val,V)。

在本发明的一个实施方案中，根据本发明的式(I)，特别是式(II)的取代基可以联合在一起。

在如上定义的式(I)的化合物的一个优选实施方案中：

-R

-R

·具有1至20个碳原子的烷基，

·具有3至20个碳原子的芳基或杂芳基，

·具有3至20个碳原子的环烷基或杂环烷基，

·羟基，

·具有1至20个碳原子的羰基或羧基，

·环氧基，

·-O-R

·-O-CO-R

在如上定义的式(I)的化合物的另一个优选的实施方案中：

-R

其中：

·a表示双键或环氧基，和

·R

在如上定义的式(I)的化合物的另一个优选的实施方案中：

-R

-R

在如上定义的式(I)的化合物，特别是式(II)的化合物的另一优选实施方案中：

-R

-R

-R

优选地，当R

优选地，如上定义的式(I)的化合物，特别是式(II)的化合物由以下式(III)、(IV)或(V)表示：

优选地，当tRNA

同样优选地，当tRNA

优选地，根据本发明的式(I)的化合物，特别是式(II)的化合物由以下式(VI)表示：

如本领域技术人员应该清楚的，根据本发明的化合物的所有立体化学构型旨在被本文所示的式所覆盖。特别地，如本文所期望的，当未指定键的立体构型时，该键可以代表任何向上键，向下键以及二者的混合物，特别是两者的1/1混合物。

因此，根据本发明的式(I)的化合物还涉及式(V)的化合物的光学活性形式，例如由以下式(Va)和(Vb)表示的对映异构体：

或其混合物，特别是其外消旋混合物。

式(VIa)的化合物是Q碱。Q碱也被称为7-(3,4-反-4,5-顺-二羟基-1-环戊烯-3-基氨基甲基)-7-脱氮鸟嘌呤。式(VIb)的化合物是对映体。

优选地，式(I)的化合物，特别是根据本发明的式(II)的化合物由下式(VII)、(VIIa)、(VIIb)、(VIII)、(VIIIa)、(VIIIb)、(IX)、(IXa)、(IXb)、(X)表示:

同样优选地，根据本发明的式(I)的化合物由下式(XII)、(XIIa)、(XIIb)、(XIII)、(XIV)、(XV)、(XVI)、(XVII)或(XVIII)表示：

式(VIIa)的化合物为环氧Q碱,也称为7-(5-[3,4-环氧-2,5-二羟基环戊-1-基)氨基]甲基)-7-脱氮鸟嘌呤。

式(VIIIa)的化合物为Q苷，也称为2-氨基-5-({[(1S,4S,5R)-4,5-二羟基环戊-2-烯-1-基]氨基}甲基)-7-(β-D-呋喃核糖基)-1,7-二氢-4H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-酮。

式(IXa)的化合物为环氧Q苷也称为57-(5-[(3,4-环氧-2,5-二羟基环戊-1-基)氨基]甲基)-7-脱氮鸟苷。

优选地，根据本发明的式(II)的化合物选自甘露糖基Q碱、半乳糖基Q碱、谷氨酰基Q碱、半乳糖基Q苷、甘露糖基Q苷、谷氨酰基Q苷、Q碱tRNA和环氧Q碱-tRNA。

式(XIII)的化合物为N-((2-氨基-4-氧代-4,7-二氢-3H吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-苯基丙-1-胺。

化合物(XIV)是N-((2-氨基-4-氧代-4,7-二氢-3H吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-基)甲基)-丙-1-胺。

化合物(XVII)为N-((2-氨基-4-氧代-4,7-二氢-3H吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-基)甲基)-丁-1-胺。

化合物(XVIII)为N-((2-氨基-4-氧代-4,7-二氢-3H吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-基)甲基)-己-1-胺。

还优选地，根据本发明的式(I)的化合物，特别是式(II)的化合物选自Q碱-tRNA

还最优选地，根据本发明的式(I)的化合物，特别是式(II)的化合物选自：Q碱、对映体-Q碱、Q苷、环氧Q碱、环氧Q苷、甘露糖基Q碱、半乳糖基Q碱、谷氨酰基Q碱、半乳糖基Q苷、甘露糖基Q苷、谷氨酰基Q苷、Q碱tRNA和环氧Q碱-tRNA、式(XII)、(XIIa)和(XIIb)的化合物。

阿尔茨海默氏病

阿尔茨海默氏病是本领域技术人员众所周知的。其特别定义在由世界卫生组织制定的《2016年国际疾病分类(ICD-10)第10次修订版》的G30类。此外，阿尔茨海默氏病由《精神障碍诊断和统计手册》(DSM-5)(2013)第五版，美国精神病学协会，第611-614页中的以下诊断标准定义：

A.符合重度或轻度神经认知障碍的标准。

B.在一个或多个认知域中存在隐匿性起病和逐渐发展的障碍(对于重度的神经认知障碍，必须有至少两个域受损)。

C.符合以下标准则很可能(probable)或可能(possible)患有阿尔茨海默氏病：

对于重度的神经认知障碍：

如果存在以下任一情况，则诊断为很可能的阿尔茨海默氏病；否则，应该诊断为可能的阿尔茨海默氏病。

1.来自家族史或基因检测的致病性阿尔茨海默氏病基因突变的证据。

2.以下三种情况全部都存在：

a.记忆力和学习能力下降以及至少一种其他认知能力下降的明确证据(基于详细病史或一系列神经心理学测试)。

b.认知稳定进行性地、逐渐地下降，没有长期的平稳期。

c.没有混合病因学的证据(例如，没有其他神经退行性疾病或脑血管疾病，或其他可能助长认知能力下降的神经、精神或系统疾病或病症)

对于轻度神经认知障碍：

很可能的阿尔茨海默氏病：如果有从基因检测或家族史证明存在致病性阿尔茨海默氏病基因突变的证据，则可以诊断出很可能的阿尔茨海默氏病。

可能的阿尔茨海默氏病：如果没有通过基因检测或家族史证明存在致病性阿尔茨海默氏病基因突变的证据，并且存在以下三种情况，则诊断为可能的阿尔茨海默氏病：

1.记忆力和学习力下降的明显证据。

2.认知稳定进行性地、逐渐地下降，没有长期的平稳期。

3.没有混合病因学的证据(即没有其他神经退行性疾病或脑血管疾病，或其他可能导致认知能力下降的神经系统疾病或系统疾病)。

D.用脑血管疾病、另一种神经退行性疾病、物质的作用或另一种精神、神经或系统性疾病不能更好地解释这种障碍。

根据本发明预防或治疗的阿尔茨海默氏病尤其可以是早期的阿尔茨海默氏病、中期的阿尔茨海默氏病、晚期的阿尔茨海默氏病、临床前的阿尔茨海默氏病、由于阿尔茨海默氏病引起的痴呆、由于阿尔茨海默氏病引起的轻度认知障碍，由于阿尔茨海默氏病引起的轻度神经认知障碍，阿尔茨海默氏病引起的重度神经认知障碍，很可能的阿尔茨海默氏病或可能的阿尔茨海默氏病。

优选地，本发明的预防或治疗阿尔茨海默氏病涉及预防或治疗由于阿尔茨海默氏病引起的至少一种认知或神经认知障碍，具体地选自记忆障碍或学习障碍。

本发明还涉及预防或治疗阿尔茨海默氏病的症状。

个体

根据本发明的个体优选是人。

在本发明的一个优选实施方案中，根据本发明的个体为65岁或以上。在本发明的另一个优选实施方案中，根据本发明的个体小于65岁。

根据本发明的个体可表现出痴呆的一种或多种症状或可患有痴呆。

根据本发明的个体可以不患有痴呆。特别地，根据本发明的个体可以患有认知障碍，特别是与盎格鲁-撒克逊(Anglo-Saxon)命名轻度认知障碍(MCI)相对应的轻度认知障碍，其是本领域技术人员众所周知的，并且特别定义在Petersen et al.(1999)ArchNeurol56:303-308中。通常在以下情况下将个体定义为患有MCI：存在与记忆功能不足的客观证据相关联的主观抱怨，但缺少认知和总体智力功能和日常生活活动的完整性。优选地，患有根据本发明的MCI的个体具有最低精神状态测验(MMSE)评分(特别是在“反屈肌群评估认知”(Groupe de Réflexion sur les Evaluation COgnitives，GRECO，对认知评估组的研究)的共识版本中)高于对应于第5个百分位的评分，根据的是年龄和社会文化水平。

此外，根据本发明的个体也可能没有认知障碍。

其它化合物

根据本发明，可用于预防或治疗阿尔茨海默氏病的其它化合物可以是本领域技术人员已知的任何类型。优选地，根据本发明的其它化合物选自多奈哌齐、加兰他敏、美金刚和利伐斯的明。

优选地，膳食补充剂中的其它化合物选自维生素、矿物质、脂肪酸、氨基酸、抗氧化物及其衍生物或前体。

优选地，维生素选自吡哆醇、磷酸吡哆醛(维生素B6)、核黄素、硫胺素、维生素E、维生素K3、维生素C、烟酸、CoQ10和β-胡萝卜素。

优选地，矿物质选自钙、镁、硒和磷。

优选地，氨基酸是L-DOPA(左旋多巴)。

优选地，脂肪酸选自左旋肉碱和乙酰基-L-肉碱。

施用

如本文所意指的，“组合的”或“组合”是指如上所定义的式(I)的化合物，特别是式(II)的化合物，与另一种化合物或产品同时(一起(即在相同的给药部位)或分别给药)或不同时给药；，其条件是如上定义的式(I)的化合物对个体发挥作用的时间段和所述其它药物或产品发挥其对个体的药理作用的时间段至少部分相交。

同样优选地，本发明的式(I)的化合物，特别是式(II)的化合物或其药学上可接受的盐或水合物用于给药或以0.01至40mg/kg/d，更优选0.01至10mg/kg，甚至更优选0.01至1mg/kg/d，最优选0.01至0.1mg/kg/d的剂量方案给药。

优选地，根据本发明的式(I)的化合物，特别是式(II)的化合物或其药学上可接受的盐或水合物为适于施用的形式或通过口服途径、皮内途径、静脉内途径、肌内途径或皮下途径施用。优选地，根据本发明的式(I)的化合物，特别是式(II)的化合物，或包含该化合物的药物组合物、药物、产品或膳食补充剂为适合于施用的形式或通过皮下植入施用。

优选地，根据本发明的式(I)的化合物，或包含该化合物的药物组合物、药物、产品或膳食补充剂为粉末、小袋、片剂、明胶、胶囊、液体或凝胶溶液的形式。

同样优选地，根据本发明的药物组合物、药物、产品或膳食补充剂包含根据本发明的式(I)的化合物，尤其是单位剂量至少为0.15mg、1mg、10mg、50mg、100mg、500mg或1000mg的Q碱、对映体-Q碱、Q苷、式(XII)、式(XIIa)或式(XIIb)的化合物。

同样优选地，根据本发明的药物组合物、药物、产品或膳食补充剂包含来自微生物和/或植物的提取物，特别是纯化的提取物，其包含根据本发明的式(I)的化合物，尤其是Q碱、对映体-Q碱、Q苷、式(XII)、式(XIIa)或式(XIIb)的化合物，单位剂量具体为至少0.15mg、1mg、10mg、50mg、100mg、500mg或1000mg。

在以下非限制性实施例中将更详细地解释本发明。

附图说明

图1显示了5种不同浓度(30nM，100nM，300nM，1μM和3μM)的Q碱在被Aβ1-42毒化后对皮层存活的影响(以占媒介物组的百分比表示)。每个值表示为平均值±sem(100％＝无Aβ1-42)。(*)表示p<0.05。BDNF(50ng/ml)是参考化合物。

图2显示了5种不同浓度(30nM，100nM，300nM，1μM和3μM)的Q碱在被Aβ1-42毒化后对神经突网络的影响(以占媒介物组的百分比表示)。每个值表示为平均值±sem(100％＝无Aβ1-42)。(*)表示p<0.05。BDNF(50ng/ml)是参考化合物。

图3显示了5种不同浓度(30nM，100nM，300nM，1μM和3μM)的Q碱在被Aβ1-42毒化后对Tau/神经突比率的影响(以占媒介物组的百分比表示)。每个值表示为平均值±sem(100％＝无Aβ1-42)。(*)表示p<0.05。BDNF(50ng/ml)是参考化合物。

实施例

该实施例的目的是评估本发明化合物在阿尔茨海默氏病的体外模型中的作用，所述阿尔茨海默氏病源于淀粉样蛋白β

A.材料和方法

大鼠皮质神经元的培养如Singeret al.(1999)J.Neurosci.19:2455-2463所述。简言之，将妊娠15天的雌性雌鼠通过颈脱位杀死，并将胎儿从子宫中取出。取出皮质并将其置于包含2％的青霉素和链霉素(PS)和1％牛血清白蛋白的Leibovitz冰冷培养基中。皮层通过胰蛋白酶消化(0.05％)在37℃解离20分钟。通过添加含II级DNA酶I(0.1mg/ml)和10％胎牛血清(FCS)的Dulbecco改良的Eagle培养基(Dulbecco’s modified Eagle’s medium，DMEM)终止反应。然后通过使细胞3次穿过10毫升移液器而将该细胞机械解离。然后将细胞在4℃下以515x g离心10分钟。丢弃上清液，并将沉淀的细胞重悬于确定成分的培养基中，所述培养基由添加了2％B27补充剂、2mM L-谷氨酰胺、2％PS溶液和10ng/ml BDNF的神经元基础培养基(Neurobasal)组成。使用台酚蓝排除试验在Neubauer细胞计数仪中对活细胞进行计数。将细胞以30000个细胞/孔的密度接种在预涂有聚-D-赖氨酸的96孔板中，并在37℃下在湿空气(95％)/CO

2.1.在毒化前六天孵育Q碱

培养5天后，将细胞与Q碱(7种浓度)一起温育。与Q碱孵育6天后，在Q碱存在下，在文献Callizotet al.(2013)J.Neurosci.Res.91:706-16中定义的培养基中，将细胞用10μM淀粉样蛋白β

测试了以下条件：

-媒介物溶液

-10μM淀粉样蛋白β

-10μM淀粉样蛋白β

-10μM淀粉样蛋白β

-每个条件使用6个孔并进行3种培养。

2.2.毒化前24h孵育Q碱

简而言之，在第10天，加入Q碱(7种浓度)。24小时后，以10μM的淀粉样蛋白β

测试了以下条件：

-对照介质

-10μM淀粉样蛋白β

-10μM淀粉样蛋白β

-10μM淀粉样蛋白β

-每个条件使用6个孔并进行3种培养。

毒化24小时后，将细胞用乙醇(95％)和乙酸(5％)的冷溶液固定5分钟。然后将细胞透化，并在室温下用含0.1％皂苷和1％胎牛血清(FCS)的磷酸盐缓冲盐水(PBS)溶液封闭非特异性位点15分钟。然后，将细胞与单克隆抗体抗微管相关蛋白2(MAP-2)孵育。该抗体可特异性染色神经元的细胞体和神经突。该抗体与Alexa Fluor 488山羊抗小鼠IgG一起揭示。神经元的核被荧光标记物(赫斯特(Hoechst)溶液)标记。

评价神经元的存活(计数MAP-2阳性神经元细胞体的数目)。

对于每个培养孔，使用InCell AnalyzerTM 2000(GE Healthcare)以20倍放大率拍摄每孔20张照片。所有图像均在相同条件下拍摄。所有值均表示为平均值±标准误平均值(s.e.mean)。统计分析是在不同条件下进行的(ANOVA,之后是Dunnett检验)。

与没有Q碱的条件相比，用Q碱孵育的神经元存活率增加，这表明Q碱具有抗阿尔茨海默氏病的特性。

该实施例的目的是通过给药淀粉样蛋白β

A.材料和方法

饲养5周大的体重30-35g的雄性瑞士小鼠(JANVIER，法国Saint Berthevin)。除行为实验期间外，将动物成组圈养，可以随意获得食物和水。将它们以12小时/12小时的光照/避光周期(在07:00pm熄灯)饲养在温度和湿度受控的动物设施中。通过使用永久性标记物标记小鼠的尾巴进行编号。

本发明使用了七十二只雄性瑞士小鼠(30-35g)。组成六个动物组，并对其进行不同的处理：

表1：治疗组

第1天：脑室内(ICV)注射乱序版本的淀粉样蛋白β

在第8天到第10天，使用了两种不同的行为测试：

-第8天(肽注射后第7天)，在Y-迷宫中进行自发交替过程(评估空间工作记忆)；

-被动回避反应(评估上下文长期记忆)，在第9天进行训练，并且第10天为保留期(retention session)。

第10天(在行为测试后)通过断头处死动物。在每只动物上收集血浆样品。解剖出海马体和额叶皮层并在液氮中冷冻。

在每组n＝6的动物中，使用一个半海马体用比色法确定脂质过氧化水平。

在每组n＝6的动物中，使用一个半海马通过ELISA测定来确定四种生化标记物的水平。

其他大脑结构存储在-80℃，可用于补充生化分析。

3.1.化合物

将多奈哌齐溶解在0.9％的氯化钠中

-命名：多奈哌齐

-IUPHAR名称：2-[(1-苄基-4-哌啶基)甲基]-5,6-二甲氧基-2,3-二氢茚-1-酮，盐酸盐，水合物(1:1:1)

-CAS:120014-06-4

-供应商：Sigma-Aldrich(法国)

-参考号：D6821

Aβ

-命名:淀粉样-β蛋白(25-35)，人类、小鼠、大鼠

-CAS:131602-53-4

-供应商：Polypeptides(法国)

-参考号：SC489

Sc.Aβ:

-命名：乱序淀粉样蛋白-β蛋白(25-35)，人类、小鼠、大鼠

-CAS:NA

-供应商：Polypeptides(法国)

-参考号：SC942

Q碱购自Synthenova SAS，15rue J.Baptiste Lamarck，14200Herouville SaintClair。

3.2.淀粉样蛋白肽的施用

用2.5％异氟烷麻醉每只小鼠，并ICV注射Aβ

4.1.行为和生化分析

4.1.1.自发交替表现

在第8天，测试所有动物在Y-迷宫中的自发交替表现，这是空间工作记忆的指标。该Y-迷宫由灰色聚氯乙烯制成。每臂长40厘米，高13厘米，底部宽3厘米，顶部宽10厘米，并且以相等的角度收敛。将每只鼠放在一臂的末端，并允许其在8分钟的时间内自由通过迷宫。通过目视法检查一系列的臂的进入(包括可能返回同一臂)。交替定义为连续进入所有三个臂。因此，最大交替次数是进入臂的总数减去2，交替百分比计算为(实际交替/最大交替)×100。参数包括交替百分比(记忆指数)和进入臂的总数(勘探指数)(Mauriceet al.(1996)Brain Res.706:181-193；Mauriceet al.(1998)Neuroscience83:413-428；Meunieret al.(2006)J.Pharmacol.Exp.Ther.317:1307-1319；Meunieret al.(2013)Genome Research23:34-45；Villardet al.(2009)Neurophsychopharmacologie34:1552-1566；Villardet al.(2011)J.Psychopharmacol.25:1101-1117)。从计算中除去表现出极端行为(交替百分比<20％或>90％或进入臂的数量<10)的动物。

4.1.2.被动回避测试

该设备是一个具有两个隔间(15×20×15cm高)的盒子，一个隔间用白色聚氯乙烯壁照亮，另一个隔间用黑色聚氯乙烯壁和网格地板避光。闸门分隔开每个隔间。实验期间，位于设备上方40厘米处的60W灯点亮白色隔间。使用震动发生扰频器(LafayetteInstruments，Lafayette，美国)将无规则的脚底电击(0.3mA，持续3s)传送到网格地板。在训练期间，闸门最初是关闭的。在训练期间，将每只鼠放入白色隔间。5秒钟后，门升起。当鼠进入黑暗的隔间并将其所有爪子放在网格地板上时，门关闭并且脚底电击的时间为3s。举步通过的等待时间(即进入暗室所花费的等待时间)以及发声次数被记录下来。训练后24小时进行保留测试。将每只鼠再次放入白色隔室。5秒钟后，门升起。记录举步通过和逃逸的等待时间(对应于从暗室中再次退出)，长达300秒(Meunieret al.(2006)J.Pharmacol.Exp.Ther.317:1307-1319；Villard et al.(2009)Neurophsychopharmacologie34:1552-1566；Villardet al.(2011)J.Psychopharmacol.25:1101-1117).

在训练和记忆期间的等待时间显示为均低于10s的动物被视为对程序无反应，并从计算中除去。

4.2.脂质过氧化测定

将每组的所有小鼠断头处死，并迅速取出两个海马体，称重并保存在液氮中直至进行测定。解冻后，将每只小鼠的一个海马体在冷甲醇(1/10w/v)中匀浆，在5分钟内以1,000g离心，并将上清液置于Eppendorf管中。将反应体积的每种匀浆加入到1mM的FeSO

4.3.ELISA测定

通过ELISA测定分析Bax、Bcl2、GFAP和半胱天冬酶-3中的含量。

这些工具包是：

·线粒体功能障碍/细胞凋亡

半胱天冬酶-3: 供应商：USCNK 参考：SEA626Mu

Bax: 供应商：USCNK 参考：SEB343Mu

Bcl2: 供应商：USCNK 参考：SEA778Mu

·炎症过程

GFAP: 供应商：USCNK 参考：SEA425Mu

对于所有测定，将皮质在Tris缓冲液(50mM Tris，150mM NaCl，pH 7.5)中解冻后匀浆，然后超声处理20s。离心(16,100g，15分钟，4℃)后，根据制造商的说明将上清液用于ELISA分析。对于每个测定，在450nm处读取吸光度，并使用标准曲线计算样品浓度。结果以每毫克组织的pg或ng标记物以及Sc.Aβ+媒介物溶液的百分比表示。以每组6个样品(n＝36/ELISA试剂盒)进行测试，一式两份。

与未接受Q碱的小鼠相比，被给予Q碱的小鼠所测试的行为和生化特性得到改善，这表明Q碱具有抗阿尔茨海默氏病的特性。

该实施例的目的是评估本发明化合物在阿尔茨海默氏病的体外模型中的作用，所述阿尔茨海默氏病源于淀粉样蛋白β1-42肽对皮质神经元的毒化，其依据以下文献：Callizotet al.(2013)J.Neurosci.Res.91:706-16；Chumakov et al.(2015)NatureScientific Reports5:7608；Combset al.(2000)J.Neurosci.20:558-67；Cummingset al.(1998)Neurology.51(Suppl 1):S2-17,discussion S65-7；Harrison(1990)J.Physiol.422:433-446；Kawaharaet al.(2000)Brain Res.Bull.53:389-97；Pikeet al.(1991)Brain Res.563:311-4；Sakonoet al.(2010)FEBS J.277:1348-58；Singeret al.(1999)J.Neurosci.19:2455-2463；Sisodiaet al.(1990)Science.248:492-5,Janet al.,(2010)Nat.Protoc.,5:1186-1209.

A.材料和方法

1.

如文献Callizotet al.,(2013)所述，对大鼠皮质神经元进行改良培养。简言之，将妊娠15天的雌性大鼠(Wistar)杀死。收集胎儿，并立即将其置于含2％青霉素(10,000U/mL)和链霉素(10mg/ml)溶液(PS)和1％牛血清白蛋白(BSA)的冰冷L15 Leibovitz培养基中。用终浓度为0.05％胰蛋白酶和0.02％EDTA的胰蛋白酶-EDTA溶液在37℃处理皮质20分钟。加入含4.5g/L葡萄糖的Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM，该培养基含有II级DNA酶I(终浓度为0.5mg/ml)和10％胎牛血清(FCS))终止解离。通过三次加压穿过10毫升移液器吸头使细胞机械解离。然后将细胞在4℃下以515x g离心10分钟。弃去上清液，并将沉淀物重悬于确定成分的培养基中，该培养基由含有2％B27补充剂溶液，2mmol/L L-谷氨酰胺，2％PS溶液，10ng/mL脑源性神经营养因子(BDNF)，2％热灭活的马血清，2％热灭活的FCS，1g/L葡萄糖，1mM丙酮酸钠和100μM非必需氨基酸的神经元基础培养基组成。使用台酚蓝排除试验，在Neubauer细胞仪中计数活细胞。将细胞以每孔45,000的密度播种在预涂有聚L-赖氨酸的96孔板中(用于免疫染色)，并在37℃的空气(95％)-CO

2.

在培养的第10天，在暴露于Aβ

添加Aβ

3.

在96孔板上在1种培养物中测试每种化合物(每种条件6孔)。对于96孔板，仅使用60孔。不使用第一行/列和最后一行/列(以避免边缘效应)，并用无菌水填充。在施用Aβ

4.

4.1.免疫染色

施用Aβ

a)在含有1％胎牛血清和0.1％皂苷的PBS中以1/1000的比例稀释的鸡多克隆抗体抗微管相关蛋白2(MAP-2)(该抗体特异性染色细胞体和神经突，可用于研究神经元细胞死亡和神经突网络)。

b)在含有1％胎牛血清和0.1％皂苷的PBS中以1/100稀释的小鼠单克隆抗tau磷光体(anti-tau phosphor)(Thr212，Ser214)。

c)在含有1％胎牛血清和0.1％皂苷的PBS中以1/400的比例稀释的兔多克隆抗体抗SIRPα/CD172a(该抗体特异性染色小胶质细胞，并且可以评估小胶质细胞的活化)。

这些抗体与在含1％FCS、0.1％皂苷的PBS中以1/400稀释的二抗山羊抗兔IgG、山羊抗小鼠IgG和偶联有Alexa Fluo的山羊抗鸡IgG r一起在室温暴露1小时。

对于每种情况，使用ImageXpress(分子设备)以20倍的放大倍率自动拍摄30张照片/孔(代表整个孔区域)。在相同条件下自动获取所有图像。使用自定义模块编辑器(Custom Module Editor，分子设备Molecular Devices)执行以下分析：

-总神经元存活(MAP-2阳性神经元的数量)

-总神经突网络(MAP-2阳性神经突的长度)

-神经元细胞质中Tau的高度磷酸化(AT100，重叠的Tau/MAP-2，重叠的μm

-小胶质细胞的总活化(OX-41染色的小胶质细胞面积，μm

4.2TNF-α评估

为了评估细胞培养物中小胶质细胞的活化，在培养结束后72小时通过ELISA对细胞培养上清液中的TNF-α水平进行定量。

5.

所有值均表示为平均值+/-sem。通过单向ANOVA进行统计分析，然后进行Dunnett检验或PLSD Fisher检验，p<0.05被认为是显著的。

6.

Q碱对被Aβ

TNF-α的评估结果示于下表1中：

表1：Aβ

表1显示肽Aβ