一种番泻苷A的纯化方法和应用

技术领域

本发明属于提取纯化技术领域，尤其是一种番泻苷A的纯化方法和应用。

背景技术

番泻叶为豆科植物狭叶番泻或尖叶番泻的干燥小叶。狭叶番泻叶的主要成分为番泻苷A及B、番泻苷C和D、芦荟大黄素双蒽酮苷、大黄酸葡萄糖苷、芦荟大黄素-8-葡萄糖苷等。尖叶番泻叶的主要成分为番泻苷A、B、C，芦荟大黄素-8-葡萄糖苷，大黄酸-8-葡萄糖苷，大黄酸-1-葡萄糖苷等。番泻苷A属于蒽醌糖苷类，为淡黄色结晶粉末，其稳定性受到温度、pH值、光照和湿度等因素的影响。番泻苷A不溶于水、苯、醚和氯仿，微溶于甲醇、丙酮和二氧六环，溶于NaHCO

目前，有关番泻苷A的分离纯化方法的研究多以大孔吸附树脂为主。此工艺得到的番泻苷A产品纯度不高，且过程繁琐，浪费溶剂，难以满足现在的科研需求，并且植物中的番泻苷A资源，不能得到更好地利用。

通过检索，尚未发现与本发明专利申请相关的专利公开文献。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中的不足之处，提供一种番泻苷A的纯化方法和应用。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种番泻苷A的纯化方法，步骤如下：

将番泻叶制成中粉，加入5-10倍体积乙醇溶液，水浴加热提取，提取液减压旋蒸回收乙醇后，冻干成粉末；取冻干粉末，高纯水重新溶解定容后，加入大孔吸附树脂柱，进行动态吸附，动态吸附结束后，先用水洗至无色，后用5-8BV40-60％乙醇溶液洗脱有效成分，收集洗脱液，用高效液相色谱法监测洗脱液中番泻苷A的含量，合并番泻苷A含量高于50％的洗脱流分，减压旋蒸回收有机溶剂，冻干成粉末；干法上样，加入到硅胶柱顶端，氯仿甲醇梯度洗脱，用高效液相色谱法监测洗脱液中番泻苷A的含量，合并番泻苷A含量高于80％的洗脱流分，减压旋蒸回收有机溶剂，冻干成粉末即得番泻苷A柱层析产品。

而且，具体步骤如下：

⑴番泻苷A的提取：精密称取番泻叶中粉，该中粉为65目-80目，加入5-10倍体积乙醇溶液，水浴加热提取，减压过滤，过滤压力为0.5-2.0MPa，除去残渣，得提取液；同法提取2-5次，合并提取液；提取液经减压浓缩，浓缩温度为30-60℃，浓缩压力为0.5-2.0MPa，回收有机溶剂后，冷冻干燥成粉末；

⑵大孔吸附树脂吸附：在玻璃柱中加入乙醇，后将大孔吸附树脂倒入，再加入乙醇，直至乙醇的高度高于树脂层，浸泡；然后，放净洗涤液，用同样的方法反复醇洗，直至试管中的洗涤液加入3-5倍质量的水，不显浑浊时为止；最后用清水充分洗涤，至洗涤液无醇味；取步骤⑴得到的冷冻干燥的粉末，高纯水溶解、定容，每2g-5g冻干粉末定容至1L-2.5L，后加入大孔吸附树脂柱，进行动态吸附，动态吸附结束后，先用水洗至无色后，再用40％-60％乙醇溶液洗脱有效成分，每2g-5g冻干粉末使用1.2L-3L40％-60％乙醇溶液洗，收集洗脱液，用高效液相色谱法监测洗脱液中番泻苷A的含量，合并番泻苷A含量高于50％的洗脱流分，减压浓缩，浓缩温度为30-60℃，浓缩压力为0.5-2.0MPa，回收有机溶剂后，冷冻干燥成粉末；

⑶洗脱液的配制：配置洗脱液A：纯氯仿，洗脱液B：体积比为1：9的甲醇和氯仿的混合液，洗脱液C：体积比为2：8的甲醇和氯仿的混合液，洗脱液D：体积比为3：7的甲醇和氯仿的混合液，洗脱液E：体积比为4：6的甲醇和氯仿的混合液，洗脱液F：体积比为5：5的甲醇和氯仿的混合液；洗脱液G：体积比为6：4的甲醇和氯仿的混合液；洗脱液H：体积比为7：3的甲醇和氯仿的混合液；

⑷装柱与上样：称取硅胶，湿法进行装柱，由洗脱液A平衡硅胶柱后，采用干法上样，于通风橱中将硅胶与番泻苷A样品混合均匀、充分干燥；

⑸洗脱：分别用B液、C液、D液、E液、F液、G液、H液梯度洗脱，收集洗脱液，由高效液相色谱法监测洗脱液中番泻苷A的含量；

⑹合并番泻苷A含量高于80％的洗脱流分，减压浓缩，浓缩温度为30-60℃，浓缩压力为0.5-2.0MPa，回收有机溶剂后，冷冻干燥成粉末，即得番泻苷A柱层析产品。

而且，所述步骤⑴中水浴提取条件为：乙醇溶液为40％-70％的乙醇溶液，提取温度30-50℃，提取时间0.5-1小时。

而且，所述步骤⑵中树脂层的高度为柱高的40％-60％。加入乙醇的高度高于树脂层20cm-40cm，浸泡时间为12-24小时。

而且，所述步骤⑵中大孔吸附树脂为比表面积为480-520m

而且，所述步骤⑷中硅胶为200-300目硅胶，柱径为50-100mm，径高比为1:7-1:12。

而且，所述步骤⑸中高效液相色谱参数：C

如上所述的番泻苷A的纯化方法在番泻苷A分离纯化方面中的应用。

本发明取得的优点和积极效果为：

1、本发明旨在解决科学研究中番泻苷A样品中番泻苷A含量过低的问题。本发明方法建立了从现有的番泻叶原料经粉碎后提取得到番泻苷A粗品，经过大孔吸附树脂的初步纯化、硅胶柱层析等技术，由高效液相色谱法进行含量测定，最后冷冻干燥，得到纯度为68.35％的番泻苷A柱层析产品。本发明方法工艺步骤较为简单易行，耗时短，溶剂消耗量少，所得柱层析产品中番泻苷A纯度较高，可以满足科学研究中对番泻苷A样品的纯度要求。

2、本发明方法首先建立了一种联合大孔吸附树脂硅胶柱层析方法将番泻苷A粗品中番泻苷A的纯度提高到68.35％，同时具有较高的收率。并在最优的条件下实现工艺放大研究，可用于大批量番泻苷A样品的生产中。

附图说明

图1为本发明中番泻苷A的标准曲线，拟合的回归曲线方程为y＝5429.6x－126738，R

图2为本发明中番泻苷A粗品经硅胶柱层析分离纯化后得到的柱层析产品的液相色谱图；

图3为本发明中番泻苷A粗品分离纯化前的高效液相色谱图；二者比较可以看出本发明方法确实可以很大程度上提高番泻苷A样品中番泻苷A的含量，使样品中的番泻苷A得以富集，含量增加；

图4为本发明中得到的番泻苷A柱层析产品的实物图，外观为淡黄色粉末。

具体实施方式

下面结合实施例，对本发明进一步说明，下属实施例是叙述性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。

本发明中所使用的原料，如无特殊说明，均为常规市售产品，本发明中所使用的方法，如无特殊说明，均为本领域常规方法，本发明所用各物质质量均为常规使用质量。

一种番泻苷A的纯化方法，步骤如下：

将番泻叶制成中粉，加入5-10倍体积乙醇溶液，水浴加热提取，提取液减压旋蒸回收乙醇后，冻干成粉末；取冻干粉末，高纯水重新溶解定容后，加入大孔吸附树脂柱，进行动态吸附，动态吸附结束后，先用水洗至无色，后用5-8BV40-60％乙醇溶液洗脱有效成分，收集洗脱液，用高效液相色谱法监测洗脱液中番泻苷A的含量，合并番泻苷A含量高于50％的洗脱流分，减压旋蒸回收有机溶剂，冻干成粉末；干法上样，加入到硅胶柱顶端，氯仿甲醇梯度洗脱，用高效液相色谱法监测洗脱液中番泻苷A的含量，合并番泻苷A含量高于80％的洗脱流分，减压旋蒸回收有机溶剂，冻干成粉末即得番泻苷A柱层析产品。

较优地，具体步骤如下：

⑴番泻苷A的提取：精密称取番泻叶中粉，该中粉为65目-80目，加入5-10倍体积乙醇溶液，水浴加热提取，减压过滤，过滤压力为0.5-2.0MPa，除去残渣，得提取液；同法提取2-5次，合并提取液；提取液经减压浓缩，浓缩温度为30-60℃，浓缩压力为0.5-2.0MPa，回收有机溶剂后，冷冻干燥成粉末；

⑵大孔吸附树脂吸附：在玻璃柱中加入乙醇，后将大孔吸附树脂倒入，再加入乙醇，直至乙醇的高度高于树脂层，浸泡；然后，放净洗涤液，用同样的方法反复醇洗，直至试管中的洗涤液加入3-5倍质量的水，不显浑浊时为止；最后用清水充分洗涤，至洗涤液无醇味；取步骤⑴得到的冷冻干燥的粉末，高纯水溶解、定容，每2g-5g冻干粉末定容至1L-2.5L，后加入大孔吸附树脂柱，进行动态吸附，动态吸附结束后，先用水洗至无色后，再用40％-60％乙醇溶液洗脱有效成分，每2g-5g冻干粉末使用1.2L-3L40％-60％乙醇溶液洗，收集洗脱液，用高效液相色谱法监测洗脱液中番泻苷A的含量，合并番泻苷A含量高于50％的洗脱流分，减压浓缩，浓缩温度为30-60℃，浓缩压力为0.5-2.0MPa，回收有机溶剂后，冷冻干燥成粉末；

⑶洗脱液的配制：配置洗脱液A：纯氯仿，洗脱液B：体积比为1：9的甲醇和氯仿的混合液，洗脱液C：体积比为2：8的甲醇和氯仿的混合液，洗脱液D：体积比为3：7的甲醇和氯仿的混合液，洗脱液E：体积比为4：6的甲醇和氯仿的混合液，洗脱液F：体积比为5：5的甲醇和氯仿的混合液；洗脱液G：体积比为6：4的甲醇和氯仿的混合液；洗脱液H：体积比为7：3的甲醇和氯仿的混合液；

⑷装柱与上样：称取硅胶，湿法进行装柱，由洗脱液A平衡硅胶柱后，采用干法上样，于通风橱中将硅胶与番泻苷A样品混合均匀、充分干燥；

⑸洗脱：分别用B液、C液、D液、E液、F液、G液、H液梯度洗脱，收集洗脱液，由高效液相色谱法监测洗脱液中番泻苷A的含量；

⑹合并番泻苷A含量高于80％的洗脱流分，减压浓缩，浓缩温度为30-60℃，浓缩压力为0.5-2.0MPa，回收有机溶剂后，冷冻干燥成粉末，即得番泻苷A柱层析产品。

较优地，所述步骤⑴中水浴提取条件为：乙醇溶液为40％-70％的乙醇溶液，提取温度30-50℃，提取时间0.5-1小时。

较优地，所述步骤⑵中树脂层的高度为柱高的40％-60％。加入乙醇的高度高于树脂层20cm-40cm，浸泡时间为12-24小时。

较优地，所述步骤⑵中大孔吸附树脂为比表面积为480-520m

较优地，所述步骤⑷中硅胶为200-300目硅胶，柱径为50-100mm，径高比为1:7-1:12。

较优地，所述步骤⑸中高效液相色谱参数：C

如上所述的番泻苷A的纯化方法在番泻苷A分离纯化方面中的应用。

具体地，相关检测及制备实施例如下：

实施例1

一种番泻苷A的纯化方法，包括以下步骤：

(1)水浴提取：精密称取番泻叶中粉7g，加入5倍体积70％乙醇溶液，50℃水浴加热，提取40min，减压抽滤，过滤除去残渣，得提取液；同法提取3次，合并提取液；提取液减压浓缩，回收有机溶剂后，冷冻干燥，得到粉末。

(2)大孔吸附树脂吸附：在玻璃柱中加入适量乙醇，后将树脂倒入，树脂层的高度约为柱高的60％。再加入乙醇，直至乙醇的高度高于树脂层20cm，浸泡12h。然后，放净洗涤液，用同样的方法反复醇洗，直至试管中的洗涤液加入3倍量的水，不显浑浊时为止。最后用清水充分洗涤，至洗涤液无醇味。取2.5g冻干粉末，高纯水溶解、定容至2.5L，后加入大孔吸附树脂柱，进行动态吸附，动态吸附结束后，先用水洗至无色后，再用1.2L 60％乙醇溶液洗脱有效成分，收集洗脱液，用高效液相色谱法监测洗脱液中番泻苷A的含量，合并高含量的洗脱流分，减压浓缩，回收有机溶剂后，冷冻干燥成粉末；此种方式可吸附番泻苷A粗品中的部分杂质，如黄酮类、生物碱类、糖类、酚类及色素等。

(3)洗脱液的配制：配置1L洗脱液A：(氯仿)，0.5L洗脱液B：(甲醇：氯仿＝1：9)，0.5L洗脱液C：(甲醇：氯仿＝2：8)，0.5L洗脱液D：(甲醇：氯仿＝3：7)，0.5L洗脱液E：(甲醇：氯仿＝4：6)，0.5L洗脱液F：(甲醇：氯仿＝5：5)，1L洗脱液G：(甲醇：氯仿＝6：4)，1.5L洗脱液H：(甲醇：氯仿＝7：3)。

(4)装柱与上样：称取硅胶100g，湿法进行装柱，由洗脱液A平衡硅胶柱后，采用干法上样，于通风橱中将硅胶与番泻苷A样品混合均匀、充分干燥。

(5)洗脱：分别用B液、C液、D液、E液、F液、G液、H液梯度洗脱，收集洗脱液，由高效液相色谱法监测洗脱液中番泻苷A的含量。

(6)合并高含量的洗脱流分，减压浓缩，回收有机溶剂后，冷冻干燥成粉末。

实施例2

一种番泻苷A的纯化方法，包括以下步骤：

(1)水浴提取：精密称取番泻叶中粉10g，加入8倍50％乙醇溶液，40℃水浴加热，提取30min，减压抽滤，过滤除去残渣，得提取液；同法提取2次，合并提取液；提取液减压浓缩，回收有机溶剂后，冷冻干燥成粉末。

(2)大孔吸附树脂吸附：在玻璃柱中加入适量乙醇，后将树脂倒入，树脂层的高度约为柱高的40％。再加入乙醇，直至乙醇的高度高于树脂层40cm，浸泡24h。然后，放净洗涤液，用同样的方法反复醇洗，直至试管中的洗涤液加入4倍量的水，不显浑浊时为止。最后用清水充分洗涤，至洗涤液无醇味。取4g冻干粉末，高纯水溶解、定容至5L，后加入大孔吸附树脂柱，进行动态吸附，动态吸附结束后，先用水洗至无色后，再用3L 40％乙醇溶液洗脱有效成分，收集洗脱液，用高效液相色谱法监测洗脱液中番泻苷A的含量，合并高含量的洗脱流分，减压浓缩，回收有机溶剂后，冷冻干燥成粉末；此种方式可吸附番泻苷A粗品中的部分杂质，如黄酮类、生物碱类、糖类、酚类及色素等。

(3)洗脱液的配制：配置2L洗脱液A：(氯仿)，0.5L洗脱液B：(甲醇：氯仿＝1：9)，0.5L洗脱液C：(甲醇：氯仿＝2：8)，0.75L洗脱液D：(甲醇：氯仿＝3：7)，0.75L洗脱液E：(甲醇：氯仿＝4：6)，1L洗脱液F：(甲醇：氯仿＝5：5)，0.75L洗脱液G：(甲醇：氯仿＝6：4)，0.5L洗脱液H：(甲醇：氯仿＝7：3)。

(4)装柱与上样：称取硅胶200g，湿法进行装柱，由洗脱液A平衡硅胶柱后，采用干法上样，于通风橱中将硅胶与番泻苷A样品混合均匀、充分干燥。

(5)洗脱：分别用B液、C液、D液、E液、F液、G液、H液梯度洗脱，收集洗脱液，由高效液相色谱法监测洗脱液中番泻苷A的含量。

(6)合并高含量的洗脱流分，减压浓缩，回收有机溶剂后，冷冻干燥成粉末。

本发明方法所制得的番泻苷A柱层析产品的主要性能指标如下：

1)如图4所示，外观为淡黄色粉末；复溶后为淡黄色澄明液体，无浑浊现象。

2)番泻苷A柱层析产品中番泻苷A含量经液相检测，纯度为68.35％，总工艺回收率在60％以上。

表1流动相梯度设置

3)配制浓度分别为30、37.5、75、150、300μg/ml的番泻苷A标准品溶液，过0.45μm微孔滤膜，进HPLC。以番泻苷A的峰面积为纵坐标，质量浓度为横坐标，绘制标准曲线。见图1。拟合的回归曲线方程为y＝5429.6x－126738，R

4)取番泻苷A柱层析产品适量，置于棕色容量瓶中，50％乙醇溶解，超声助溶，定容至刻度。取续滤液，进HPLC，测定番泻苷A的含量。结果见图2，经计算，柱层析产品中番泻苷A的含量为68.35％。

5)取番泻苷A粗品适量，置于棕色容量瓶中，50％乙醇溶解，超声助溶，定容至刻度。取续滤液，进HPLC，测定番泻苷A的含量。结果见图3，经计算，番泻苷A的浓度为128.02μg/ml，粗品中番泻苷A的含量为6.38％。

尽管为说明目的公开了本发明的实施例，但是本领域的技术人员可以理解：在不脱离本发明及所附权利要求的精神和范围内，各种替换、变化和修改都是可能的，因此，本发明的范围不局限于实施例所公开的内容。