膀胱癌患者尿液表达的CD40蛋白的应用

技术领域

在本发明涉及提取正常人与膀胱癌患者的尿液蛋白，并证实膀胱癌患者尿液中CD40的含量显著高于正常人。

背景技术

膀胱癌易复发的特点已经成为临床根治膀胱癌的难点。化疗是防治膀胱癌复发的主要手段。以顺铂为基础的化疗药物是膀胱癌治疗中广泛使用的一线药物，但是膀胱癌耐药性强的特点使得膀胱癌化疗药物很难有效发挥作用。以根治性膀胱癌切除术联合顺铂为基础的化疗对膀胱癌患者进行治疗，患者复发和恶化情况明显，有20%的患者会进展成浸润性膀胱癌，50%的浸润性膀胱癌患者会进展成不可治愈的转移性疾病。及时监测耐药性膀胱癌的进展有助于膀胱癌复发的早期针对性治疗。然而，至今还没有对膀胱癌的进展进行监测的常规筛查试验和有效的监测手段，目前采用的膀胱癌检查方法主要是尿细胞学和膀胱镜检，但是检测的灵敏度和特异度较差，膀胱镜检容易给患者带来不必要的痛苦和经济负担。因此急需寻找能够快速、有效监测膀胱癌的手段，对患者的肿瘤进展进行监测。

CD40是一种存在于肿瘤细胞表面的重要标志物，已经证实在卵巢癌、肝细胞癌等多种肿瘤中存在预测疾病发展的作用。CD40在肿瘤的发生发展中具有差异性表达的特点，具有较高的诊断治疗价值。CD40具有抗增殖和促凋亡的作用。研究结果表明，CD40通路在肿瘤中具有多方面的抗肿瘤活性，为今后的临床应用提供了可能性。在动物实验中，小鼠重组CD40配体疗法对CD40阳性卵巢肿瘤具有显著的抗肿瘤作用，影响CD40的表达能够增强顺铂的作用效果，实验证实了CD40在肿瘤中是一种有价值的标志物。同时在外泌体的研究中，也证实了CD40在外泌体中具有表达活性，在泌尿系统疾病外泌体的研究中也证实了CD40存在诊断价值，我们已经通过质谱证实CD40在肾细胞癌中具有特征性表达，对疾病的进展存在一定的价值。但是在膀胱癌中，CD40的表达和预测价值并未得到验证，本发明将提供人尿液表达CD40在膀胱癌中的应用。

发明内容

本发明的目的在于提供人尿液表达蛋白的检测方式。

优选地，所述人尿液为正常人与膀胱癌患者的尿液。

优选地，所述蛋白为CD40。

发明人首先收集正常人和膀胱癌患者的尿液，之后对尿液的蛋白进行提取，收集得到的蛋白采用RIPA和加热的方法裂解提取蛋白质，并对尿液中的CD40采用western blot法进行验证，结果与患者的临床进展结合，证实尿液中CD40和疾病进展的相关性。

为让本发明的上述和其它目的、特征和优点能更明显易懂，下文特举较佳实施例，并配合附图，作详细说明如下。

附图说明 CD40在正常人与膀胱癌患者的尿液中的表达。

具体实施方式

取正常人和膀胱癌患者的新鲜晨尿，收集样本置于冰上，4℃下3000g离心10分钟，去除细胞或者细胞碎片，离心后将尿液吸入新管中，取5.0ml处理后的尿液于15ml离心管中，加入0.5ml的结合缓冲液，盖紧盖子，颠倒混匀。吸取300ul结合树脂，加入离心管中，室温颠倒混匀15min后，3000g室温离心2min，弃去5.2ml上清，将剩余上清液体和结合树脂悬起，并将液体和结合树脂一并转移至纯化柱中，3000g室温离心2min，弃掉收集管中的收集液，并取0.5ml洗涤液加到离心柱中，用移液器将洗涤液和结合树脂充分混匀，室温静置1min后，3000g，室温离心2min，将收集管和收集液一并弃去。之后将纯化柱放入低吸附蛋白的1.5ml离心管中，加入200ul洗脱液，混匀反应10min后，3000g，室温离心2min，离心管中所得液体即为浓缩后的蛋白溶液。

采用western blot对蛋白进行验证。提取的溶液加入RIPA蛋白裂解液（1：4）提取总蛋白并进行12%的SDS-PAGE电泳，电压12V转膜60 min，5%脱脂奶粉室温封闭2 h，加入1：1000一抗CD40、β-actin 4℃孵育过夜。PBST漂洗3次，每次20min，加入1：1000二抗，室温孵育90min，PBST漂洗，DAB显色。如图所示，应用western blot验证，与正常人相比膀胱癌复发患者尿液中的CD40明显上升。且和患者的疾病状态具有明显的相关性。

虽然本发明已以较佳实施例披露如上，然其并非用以限定本发明，任何所属技术领域的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，当可作些许的更动与改进，因此本发明的保护范围当视权利要求所界定者为准。