细胞穿透花青偶联抗体

本申请是2016年12月9日提交的，发明名称为“细胞穿透花青偶联抗体”的中国专利申请201680081218.1的分案申请。

相关申请的交叉引用

本申请要求2015年12月10日提交的美国临时申请号62/265,727的优先权，其对于所有目的以整体援引加入本文。

对于联邦资助的研发中所得出的发明权利的声明

此发明使用了国立卫生研究院(National Institutes of Health)所授予的项目编号RO1CA122976的政府支持。政府对此发明有一定的权利。

背景技术

抗体具有优异的结合特异性和极小的脱靶效应，由于其易于产生和生物持久性，已经证明抗体为有效的药物形态。然而，许多用于疾病治疗和疾病诊断的重要靶标是细胞内的。此外，将抗体运送至细胞中是耗费劳动的并且还可能损害细胞或抗体本身的结构和功能完整性。因此，本领域需要治疗性和诊断性细胞穿透抗体。本文提供了用于本领域中这些和其它需求的解决方案。

发明内容

在一方面，提供具有下式的细胞穿透缀合物：

在式(I)或(IV)中。Ar

在一方面，提供具有下式的细胞穿透缀合物：

在式(I)中，Ar

在一方面，提供细胞，其包含本文所述的细胞穿透缀合物(包括其实施方案)。

在一方面，提供药物组合物，其包含本文所述的细胞穿透缀合物(包括其实施方案)和药学上可接受的载体。

在一方面，提供将非细胞穿透蛋白递送至细胞内的方法。所述方法包括使细胞与本文所述的细胞穿透缀合物(包括其实施方案)接触。

在一方面，提供在有需要的个体中治疗疾病的方法。所述方法包括向个体给药有效量的本文所述的细胞穿透缀合物(包括其实施方案)，由此在所述个体中治疗疾病。

附图说明

图1.花青3(Cy3)和花青5(Cy5)经NHS酯对抗-Stat3抗体的共价连接。选择Cy3(左图，上面结构)和Cy5(左图，下面结构)以诱导共价酯结合至免疫球蛋白抗-Stat3。一旦酯结合反应完成，将抗-Stat3-Cy3和抗-Stat3-Cy5在非还原条件下进行SDS-PAGE并获得SDS-PAGE凝胶的图像，使在预测免疫球蛋白150kDa的分子范围内迁移的荧光标记的Stat3-IgG可视化(右图)。

图2A-2B.图2A左图：花青5-Stat3-抗体容易内化至细胞中。如所示的将人B细胞淋巴瘤Ly3细胞与花青-或磺酸基花青-Stat3-抗体以10μg/ml温浴1h。花青5的结构：左图上面；磺酸基花青5的结构：左图下面。图2A右图。人B细胞淋巴瘤Ly3细胞的共聚焦显微分析以评估细胞定位。比例尺，10μm。图2B.流式细胞分析显示抗-Stat3-Cy5人B细胞淋巴瘤Ly3细胞的细胞内化效力。抗-Stat3-磺酸基Cy5和任何Cy3标记都没有发挥细胞内化，表明细胞穿透限制于抗-Stat3-Cy5缀合物。

图3.通过抗-Stat3-Cy5缀合物进行靶标识别。如所示的将人B细胞淋巴瘤Ly3细胞与花青-或磺酸基花青-Stat3-抗体以10μg/ml温浴1h。制备全细胞裂解物并进行另外的免疫沉淀，其中一清除了细胞碎片就将蛋白偶联的琼脂糖珠添加至裂解物。如通过在预测的89kDa迁移的Stat3的蛋白质印迹法检测所示，通过抗-STAT3-Cy5缀合物专有地实现了靶标识别。

图4A-4B.通过抗-Stat3-Cy7缀合物进行靶标识别。图4A显示Cy7缀合物、花青7和磺酸基花青7。如所示的将人B细胞淋巴瘤Ly3细胞与花青-或磺酸基花青-Stat3-抗体以10μg/ml温浴指定的时间。制备全细胞裂解物并进行另外的免疫沉淀，其中一清除了细胞碎片就将蛋白偶联的琼脂糖珠添加至裂解物。如通过在预测的89kDa迁移的STAT3的蛋白质印迹法检测所示，通过抗-STAT3-Cy7缀合物专有地实现了靶标识别，如图4B所示。

具体实施方式

I.定义

虽然本文中显示和描述了本发明的各个实施方案和方面，但是对于本领域技术人员来说显然此类实施方案和方面仅仅是以实例的方式提供的。本领域技术人员现在将会想到许多的变体、改变、和替换而不偏离本发明。应当理解的是，在本发明的实施中可以使用本文所描述的本发明实施方案的各种变化。

本文所使用的章节标题仅仅是用于文字组织的目的，而不应理解为对所描述主体的限制。本申请中引用的所有文献、或文献的部分(包括但不限于专利、专利申请、文章、书、手册、以及专著)在此对于任何目的而言都以其整体援引加入本文。

本文所使用的缩写具有其在化学和生物学领域内的常规含义。本文所示的化学结构和化学式根据化学领域内已知的化学价标准规则来理解。

在取代基基团用其从左到右书写的常规化学式指定时，它们同样涵盖从右到左书写该结构而得到的在化学上相同的取代基，例如，-CH

除非另有说明，否则术语“烷基”本身或作为另一取代基的一部分，意指直链(即无支链)或支链非环状碳链(或碳)或其组合，它可以完全饱和、单不饱和或多不饱和，而且可以包括具有指定碳原子数(即，C

除非另有说明，否则术语“亚烷基”本身或作为另一取代基的一部分，意指衍生自烷基的二价基，例如但不限于-CH

除非另有说明，否则术语“杂烷基”本身或与另一术语组合，意指包括至少一个碳原子和至少一个选自O、N、P、Si和S的杂原子的稳定直链或支链非环状或其组合，并且其中氮和硫原子可以任选地氧化，并且氮杂原子可以任选地季铵化。杂原子O、N、P、S和Si可置于杂烷基基团的任何内部位置或置于烷基基团与分子其余部分连接的位置。实例包括但不限于：-CH

类似地，除非另有说明，否则术语“亚杂烷基”本身或作为另一取代基的一部分，意指衍生自杂烷基的二价基团，例如但不限于-CH

除非另有说明，否则术语“环烷基”和“杂环烷基”本身或与其它术语组合，分别意指“烷基”和“杂烷基”的非芳香族环状形式，其中由于所有参与非氢原子键联的碳价，构成一个或多个环的碳不一定需要与氢键合。另外，对于杂环烷基而言，杂原子可以占据杂环与分子其余部分连接的位置。环烷基的实例包括但不限于环丙基、环丁基、环戊基、环己基、1-环己烯基、3-环己烯基、环庚基、3-羟基-环丁-3-烯基-1,2,二酮、1H-1,2,4-三唑基-5(4H)-酮、4H-1,2,4-三唑基等。杂环烷基的实例包括但不限于1-(1,2,5,6-四氢吡啶基)、1-哌啶基、2-哌啶基、3-哌啶基、4-吗啉基、3-吗啉基、四氢呋喃-2-基、四氢呋喃-3-基、四氢噻吩-2-基、四氢噻吩-3-基、1-哌嗪基、2-哌嗪基等。单独的或作为另一取代基的一部分的“亚环烷基”和“亚杂环烷基”分别意指衍生自环烷基和杂环烷基的二价基。杂环烷基部分可包括一个环杂原子(例如，O、N、S、Si或P)。杂环烷基部分可包括两个任选不同的环杂原子(例如，O、N、S、Si或P)。杂环烷基部分可包括三个任选不同的环杂原子(例如，O、N、S、Si或P)。杂环烷基部分可包括四个任选不同的环杂原子(例如，O、N、S、Si或P)。杂环烷基部分可包括五个任选不同的环杂原子(例如，O、N、S、Si或P)。杂环烷基部分可包括至多8个任选不同的环杂原子(例如，O、N、S、Si或P)。“亚环烷基”和“亚杂环烷基”单独的或作为另一取代基的一部分分别意指衍生自环烷基和杂环烷基的二价基。除非另有说明，否则术语“环烯基”和“环炔基”本身或与其他术语组合，分别意指“烯基”和“炔基”的非芳香族环状形式。除非另有说明，否则术语“杂环烯基”和“杂环炔基”本身或与其他术语组合，分别意指“杂烯基”和“杂炔基”的环状形式。

除非另有说明，否则术语“卤代”或“卤素”本身或作为另一取代基的一部分，意指氟、氯、溴或碘原子。另外，诸如“卤代烷基”等术语意在包括单卤代烷基和多卤代烷基。例如，术语“卤代(C

除非另有说明，否则术语“酰基”意指-C(O)R，其中R是被取代或未被取代的烷基、被取代或未被取代的环烷基、被取代或未被取代的杂烷基、被取代或未被取代的杂环烷基、被取代或未被取代的芳基或被取代或未被取代的杂芳基。

除非另有说明，否则术语“芳基”意指多不饱和、芳族烃取代基，其可以是单环或稠合在一起(即，稠环芳基)或共价连接的多个环(优选1至3个环)。稠环芳基是指稠合在一起的多个环，其中至少一个稠环为芳环。术语“杂芳基”是指含有至少一个杂原子如N、O或S的芳基基团(或环)，其中氮原子和硫原子任选被氧化，且一个或多个氮原子任选被季铵化。因此，术语“杂芳基”包括稠环杂芳基基团(即稠合在一起的多个环，其中至少一个稠环是杂芳环)。5,6-稠环亚杂芳基是指两个稠合在一起的环，其中一个环为5元，另一个环为6元，并且其中至少一个环是杂芳环。同样，6,6-稠环亚杂芳基是指两个稠合在一起的环，其中一个环为6元，另一个环为6元，并且其中至少一个环是杂芳环。并且6,5-稠环亚杂芳基是指两个稠合在一起的环，其中一个环为6元，另一个环为5元，并且其中至少一个环是杂芳环。杂芳基基团可以通过碳或杂原子与分子的其余部分连接。芳基和杂芳基基团的非限制性实例包括苯基、1-萘基、2-萘基、4-联苯基、1-吡咯基、2-吡咯基、3-吡咯基、3-吡唑基、2-咪唑基、4-咪唑基、吡嗪基、2-噁唑基、4-噁唑基、2-苯基-4-噁唑基、5-噁唑基、3-异噁唑基、4-异噁唑基、5-异噁唑基、2-噻唑基、4-噻唑基、5-噻唑基、2-呋喃基、3-呋喃基、2-噻吩基、3-噻吩基、2-吡啶基、3-吡啶基、4-吡啶基、2-嘧啶基、4-嘧啶基、5-苯并噻唑基、嘌呤基、2-苯并咪唑基、5-吲哚基、1-异喹啉基、5-异喹啉基、2-喹喔啉基、5-喹喔啉基、3-喹啉基和6-喹啉基。上文提及的芳基和杂芳基环系中的每一个的取代基都选自下面描述的可接受的取代基。“亚芳基”和“亚杂芳基”单独的或作为另一取代基的一部分，分别意指衍生自芳基和杂芳基的二价基。杂芳基基团的非限制性实例包括吡啶基、嘧啶基、噻吩基(thiophenyl)、噻吩基(thienyl)、呋喃基、吲哚基、苯并噁二唑基、苯并间二氧杂环戊烯基(benzodioxolyl)、苯并二噁烷基、硫代十氢化萘基(thianaphthanyl)、吡咯并吡啶基、吲唑基、喹啉基、喹喔啉基、吡啶并吡嗪基、喹唑啉酮基、苯并异噁唑基、咪唑并吡啶基、苯并呋喃基、苯并噻吩基(benzothienyl)、苯并噻吩基(benzothiophenyl)、苯基、萘基、联苯基、吡咯基、吡唑基、咪唑基、吡嗪基、噁唑基、异噁唑基、噻唑基、呋喃噻吩基、吡啶基、嘧啶基、苯并噻唑基、嘌呤基、苯并咪唑基、异喹啉基、噻二唑基、噁二唑基、吡咯基、二唑基、三唑基、四唑基、苯并噻二唑基、异噻唑基、吡唑并嘧啶基、吡咯并嘧啶基、苯并三唑基、苯并噁唑基或喹啉基。上述实例可以是被取代或未被取代的，并且上述每个杂芳基实例的二价基是亚杂芳基的非限制性实例。

稠环杂环烷基-芳基是与杂环烷基稠合的芳基。稠环杂环烷基-杂芳基是与杂环烷基稠合的杂芳基。稠环杂环烷基-环烷基是与环烷基稠合的杂环烷基。稠环杂环烷基-杂环烷基是与另一个杂环烷基稠合的杂环烷基。稠环杂环烷基-芳基、稠环杂环烷基-杂芳基、稠环杂环烷基-环烷基或稠环杂环烷基-杂环烷基可以各自独立地为未被取代的或者被一个或多个本文描述的取代基取代。

如本文中所用，术语“氧代”意指与碳原子双键键合的氧。

术语“烷基亚芳基”为亚芳基部分共价结合至亚烷基部分(本文也称为亚烷基接头)。在实施方案中，烷基亚芳基具有式：

烷基亚芳基部分可以在亚烷基部分或亚芳基接头(例如，在碳2、3、4或6)上被以下取代(例如，具有取代基)：卤素、氧代、-N

如本文中所用，术语“烷基磺酰基”意指具有式-S(O

以上每个术语(例如，“烷基”、“杂烷基”、“环烷基”、“杂环烷基”、“芳基”和“杂芳基”)均包括指定基团的被取代和未被取代形式。下面提供每种类型的基团的优选取代基。

烷基和杂烷基(包括常常称为亚烷基、烯基、亚杂烷基、杂烯基、炔基、环烷基、杂环烷基、环烯基和杂环烯基的那些基团)的取代基可以是选自但不限于以下的多种基团中的一种或多种：-OR'、＝O、＝NR'、＝N-OR'、-NR'R”、-SR'、-卤素、-SiR'R”R”'、-OC(O)R'、-C(O)R'、-CO

类似于针对烷基描述的取代基，芳基和杂芳基基团的取代基是变化的并且选自例如：-OR'、-NR'R”、-SR'、-卤素、-SiR'R”R”'、-OC(O)R'、-C(O)R'、-CO

两个或更多个取代基可以任选地连接形成芳基、杂芳基、环烷基或杂环烷基基团。发现此类所谓的成环取代基通常(但不一定)与环状基础结构连接。在一个实施方案中，成环取代基与基础结构的相邻成员连接。例如，与环状基础结构的相邻成员连接的两个成环取代基产生稠环结构。在另一个实施方案中，成环取代基与基础结构的单个成员连接。例如，与环状基础结构的单个成员连接的两个成环取代基产生螺环结构。在又一个实施方案中，成环取代基与基础结构的非相邻成员连接。

芳环或杂芳环相邻原子上的两个取代基可以任选地形成式-T-C(O)-(CRR')

如本文中所用，术语“杂原子”或“环杂原子”意在包括氧(O)、氮(N)、硫(S)、磷(P)和硅(Si)。

如本文中所用，“取代基基团”意指选自以下部分的基团：

(A)氧代、卤素、-CF

(B)被至少一个选自以下的取代基取代的烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基：

(i)氧代、卤素、-CF

(ii)被至少一个选自以下的取代基取代的烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基：

(a)氧代、卤素、-CF

(b)被选自以下的至少一个取代基取代的烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基：氧代、卤素、-CF

如本文中所用，“大小受限的取代基”或“大小受限的取代基基团”意指选自以上针对“取代基基团”描述的所有取代基的基团，其中每个被取代或未被取代的烷基是被取代或未被取代的C

如本文中所用，“低级取代基”或“低级取代基基团”意指选自以上针对“取代基基团”描述的所有取代基的基团，其中每个被取代或未被取代的烷基是被取代或未被取代的C

在一些实施方案中，在本文的化合物中描述的每个被取代的基团被至少一个取代基基团取代。更具体地，在一些实施方案中，在本文的化合物中描述的每个被取代的烷基、被取代的杂烷基、被取代的环烷基、被取代的杂环烷基、被取代的芳基、被取代的杂芳基、被取代的亚烷基、被取代的亚杂烷基、被取代的亚环烷基、被取代的亚杂环烷基、被取代的亚芳基和/或被取代的亚杂芳基被至少一个取代基基团取代。在其它实施方案中，这些基团中的至少一个或全部被至少一个大小受限的取代基基团取代。在其它实施方案中，这些基团中的至少一个或全部被至少一个低级取代基基团取代。

在本文化合物的其它实施方案中，每个被取代或未被取代的烷基可以是被取代或未被取代的C

在一些实施方案中，每个被取代或未被取代的烷基是被取代或未被取代的C

除非另有定义，本文所使用的技术和科学术语具有本领域技术人员所通常理解的含义。参见，例如Singleton等人,DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY2nd ed.,J.Wiley&Sons(New York,NY 1994)；Sambrook等人,MOLECULAR CLONING,ALABORATORY MANUAL,Cold Springs Harbor Press(Cold Springs Harbor,NY 1989)。与本文所描述的那些类似或等同的方法、设备和材料可以用于本发明的实施。提供以下定义是用于辅助对本文经常使用的某些术语的理解，而不是意味着要对本公开的范围进行限定。

术语"外源的"是指源自给定细胞或生物体外部的分子或物质(例如，化合物、核酸或蛋白)。例如，如本文所提到的"外源启动子"，是并不来自表达其的植物的启动子。相反，术语"内源的"或"内源启动子"是指对于给定细胞或生物体是天然的、或者源自给定细胞或生物体内的分子或物质。

术语"分离的"，当应用于核酸或蛋白时，表示所述核酸或蛋白基本上没有在天然状态下其所关联的其它细胞成分。其可以例如是在均质状态，并且可以是干燥的或含水的溶液中。纯度和均质性通常是使用分析化学技术来确定的，如聚丙烯酰胺凝胶电泳或高效液相色谱。在制剂中是占主导地位的种类的蛋白，是基本上纯化的。

术语"多肽"、"肽"和"蛋白"在本文中可互换地用于指氨基酸残基的聚合物，其中所述聚合物在实施方案中，可以缀合至不含氨基酸的部分。该术语适用于其中一或多个氨基酸残基是相应天然发生的氨基酸的人工化学模拟物的氨基酸聚合物，以及适用于天然发生的氨基酸聚合物和非天然发生的氨基酸聚合物。"融合蛋白"是指编码两个或更多个分别的蛋白序列(其重组表达为单一部分)的嵌合蛋白。

术语"肽基"和"肽基部分"意指单价肽。

术语"氨基酸"是指天然发生的和合成的氨基酸，以及以与天然发生的氨基酸类似方式发挥作用的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然发生的氨基酸是由遗传密码所编码的那些，以及随后经修饰的那些，例如，羟基脯氨酸、γ-羧基谷氨酸、和O-磷酸丝氨酸。氨基酸类似物是指与天然发生的氨基酸具有相同基本化学结构(也即结合至氢的α碳、羧基基团、氨基基团、和R基团)的化合物，例如，高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸甲基硫。此类类似物具有经修饰的R基团(例如，正亮氨酸)或经修饰的肽骨架，但是却保留与天然发生的氨基酸相同的基本化学结构。氨基酸模拟物是指具有与氨基酸的一般化学结构不同的结构、但是却以与天然发生的氨基酸类似方式发挥作用的化合物。术语“非天然发生的氨基酸”和“非天然氨基酸”是指自然中未发现的氨基酸类似物、合成氨基酸、和氨基酸模拟物。

氨基酸在本文中可以其通常已知的三字母符号或IUPAC-IUB BiochemicalNomenclature Commission推荐的单字母符号来进行指代。同样，核苷酸可以通过其通常接受的单字母编码来进行指代。

"经保守修饰的变体"适用于氨基酸和核酸序列。对于特定的核酸序列，"经保守修饰的变体"是指编码相同或基本上相同氨基酸序列的那些核酸。由于遗传密码的简并性，许多的核酸序列将会编码任何给定的蛋白。例如，密码子GCA、GCC、GCG和GCU全都编码氨基酸丙氨酸。因而，在每个通过密码子指定为丙氨酸的位置处，该密码子可以改变为所述的任何相应密码子而不会改变所编码的多肽。此类核酸突变是"沉默突变"，其是一类保守修饰的突变。本文每个编码多肽的核酸序列，也都描述了该核酸的每种可能的沉默突变。本领域技术人员会意识到，核酸中的每个密码子(除了AUG，其一般是甲硫氨酸的唯一密码子，以及TGG，其一般是色氨酸的唯一密码子)都可以经修饰以产生功能上等同的分子。因此，编码多肽的核酸的每个沉默突变都暗含在每个所述的序列中。

对于氨基酸序列，本领域技术人员会意识到，对核酸、肽、多肽、或蛋白序列的个别取代、缺失或添加(其在编码的序列中改变、添加或缺失单一氨基酸或小百分比的氨基酸)，当改变导致氨基酸被化学上类似的氨基酸取代时，是"经保守修饰的变体"。提供功能上类似的氨基酸的保守取代表是本领域熟知的。此类经保守修饰的变体是在本发明的多态变体、种间同源、和等位基因之外的(并且并不排除)。

以下八组每组含有彼此互为保守取代的氨基酸：

1)丙氨酸(A)、甘氨酸(G)；

2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；

3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；

4)精氨酸(R)、赖氨酸(K)；

5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V)；

6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)；

7)丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；和

8)半胱氨酸(C)、甲硫氨酸(M)

(参见，例如Creighton,Proteins(1984))。

术语"相同的"或百分比"相同性"，在两个或更多个核酸或多肽序列的背景下，是指相同的或具有指定百分比的相同的氨基酸残基或核苷酸的两个或更多个序列或亚序列，其中指定百分比相同也即，当在比较窗口或指定区域进行比较或比对最大对应时，在指定的区域大约60％的相同性，优选65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或更高的相同性，其中是使用BLAST或BLAST 2.0序列比对算法(以下文所述默认参数)、或通过人工比对和肉眼检查来进行的测量(参见，例如NCBI网址http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/等)。此类序列则称之为"基本上相同的"。此定义也是指、或者可以适用于，测试序列的互补序列(compliment)。该定义还包括具有缺失和/或添加的序列、以及具有取代的那些。如下文所述，优选的算法可以考虑缺口等。优选地，相同性存在于长度至少约25个氨基酸或核苷酸的区域上，或更优选存在于长度50-100个氨基酸或核苷酸的区域上。

"抗体"是指包含来自免疫球蛋白基因的框架区的多肽或其片段(其特异性地结合并识别抗体)。所识别的免疫球蛋白基因包括κ、λ、α、γ、δ、ε、和μ恒定区基因，以及多种多样的免疫球蛋白可变区基因。轻链分类为κ或λ。重链分类为γ、μ、α、δ、或ε，其然后分别定义了免疫球蛋白的类别IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。通常，抗体的抗原结合区在结合的特异性和亲和性方面会是最关键的。在一些实施方案中，抗体或抗体的片段可以源自不同的生物体，包括人、小鼠、大鼠、仓鼠、骆驼等。本发明的抗体可包括已经在一或多个氨基酸位点进行了修饰或突变的抗体，以改善或调节抗体的期望功能(例如糖基化、表达、抗原识别、效应功能、抗原结合、特异性等)。

示例性的免疫球蛋白(抗体)结构单元包含四聚体。每个四聚体由相同的两对多肽链组成，每对具有一个"轻链"(大约25kD)和一个"重链"(大约50-70kD)。每个链的N末端定义大约100-110个或更多个氨基酸的可变区，其主要负责抗原识别。术语可变轻链(VL)和可变重链(VH)分别是指这些轻链和重链。Fc(也即可结晶片段区)是免疫球蛋白的"基础"或"尾部"并且通常由两个重链(为两个或三个恒定结构域贡献，取决于抗体的类别)组成。通过结合至特异性的蛋白，Fc区确保了每个抗体产生了对给定抗原的适宜免疫应答。Fc区还结合各种细胞受体(如Fc受体)、以及其它免疫分子(如补体蛋白)。

抗体，例如，作为完整的免疫球蛋白或作为许多经良好表征的片段(经各种肽酶的消化而产生)而存在。因而，例如，胃蛋白酶在铰链区中二硫连接之下消化抗体，以产生F(ab)’2，其是Fab(其本身是通过二硫键接合至VH-CH1的轻链)的二聚体。F(ab)’2在温和条件下可以被还原以破坏铰链区的二硫连接，由此将F(ab)’2二聚体转化为Fab’单体。Fab’单体基本上是具有部分铰链区的抗原结合部分(参见Fundamental Immunology(Paul ed.,3ded.1993)。虽然各种抗体片段是就完整抗体的消化而言来进行的定义，但是本领域技术人员会理解此类片段可以经化学重新合成或通过使用重组DNA方法来重新合成。因而，如本文所用，术语抗体也包括通过抗体的修饰而产生的抗体片段、或使用重组DNA方法重新合成的那些(例如，单链Fv)、或使用噬菌体展示文库所鉴别的那些(参见，例如McCafferty等人,Nature 348:552-554(1990))。

单链可变片段(scFv)通常是免疫球蛋白的重链(VH)和轻链(VL)的可变区的融合蛋白(用10至约25个氨基酸的短接头肽连接)。所述接头通常可富含甘氨酸以用于弹性、以及丝氨酸或苏氨酸以用于可溶性。所述接头可将VH的N末端与VL的C末端连接，或者反之。

为了制备适宜的本发明的抗体以及为了根据本发明的用途，例如重组、单克隆、或多克隆抗体，可以使用许多本领域已知的技术(参见，例如Kohler&Milstein,Nature 256:495-497(1975)；Kozbor等人,Immunology Today 4:72(1983)；Cole等人,pp.77-96Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,Alan R.Liss,Inc.(1985)；Coligan,Current Protocols in Immunology(1991)；Harlow&Lane,Antibodies,A LaboratoryManual(1988)；和Goding,Monoclonal Antibodies:Principles and Practice(2ded.1986))。可以从细胞克隆编码感兴趣抗体的重链和轻链的基因，例如，可以从杂交瘤细胞克隆编码单克隆抗体的基因，并用于产生重组单克隆抗体。也可以从杂交瘤或血浆细胞制备编码单克隆抗体的重链和轻链的基因文库。重链和轻链基因产物的随机组合，产生了具有不同抗原特异性的抗体的大汇集(参见例如Kuby,Immunology(3rd ed.1997))。可以对用于产生单链抗体或重组抗体的技术(美国专利4,946,778、美国专利号4,816,567)进行调整，以产生本发明多肽的抗体。还有，转基因小鼠、或其它生物体如其它哺乳动物，也可用于表达人源化的或人抗体(参见，例如美国专利号5,545,807；5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；5,661,016,Marks等人,Bio/Technology 10:779-783(1992)；Lonberg等人,Nature 368:856-859(1994)；Morrison,Nature 368:812-13(1994)；Fishwild等人,Nature Biotechnology 14:845-51(1996)；Neuberger,Nature Biotechnology 14:826(1996)；和Lonberg&Huszar,Intern.Rev.Immunol.13:65-93(1995))。或者，可以使用噬菌体展示技术来鉴别特异性结合选定抗原的抗体和异聚的Fab片段(参见，例如McCafferty等人,Nature 348:552-554(1990)；Marks等人,Biotechnology 10:779-783(1992))。抗体也可以制备为双特异性的，也即，能够识别两种不同的抗原(参见，例如WO 93/08829,Traunecker等人,EMBO J.10:3655-3659(1991)；和Suresh等人,Methods in Enzymology121:210(1986))。抗体也可以是异缀合物(heteroconjugate)，例如，两个共价接合的抗体、或免疫毒素(参见，例如美国专利号4,676,980、WO 91/00360；WO 92/200373；和EP 03089)。

用于将非人抗体人源化或灵长源化的方法是本领域熟知的(例如，美国专利号4,816,567；5,530,101；5,859,205；5,585,089；5,693,761；5,693,762；5,777,085；6,180,370；6,210,671；和6,329,511；WO 87/02671；欧洲专利申请0173494；Jones等人(1986)Nature 321:522；和Verhoyen等人(1988)Science 239:1534)。人源化的抗体在例如，Winter and Milstein(1991)Nature 349:293中有进一步描述。一般而言，人源化的抗体具有来自非人来源的一或多个氨基酸残基引入其中。这些非人氨基酸残基常常称作为输入残基，其通常取自输入的可变结构域。人源化基本上可以依照Winter与其合作者的方法来进行(参见，例如Morrison等人,PNAS USA,81:6851-6855(1984)；Jones等人,Nature321:522-525(1986)；Riechmann等人,Nature 332:323-327(1988)；Morrison and Oi,Adv.Immunol.,44:65-92(1988),Verhoeyen等人,Science 239:1534-1536(1988)和Presta,Curr.Op.Struct.Biol.2:593-596(1992),Padlan,Molec.Immun.,28:489-498(1991)；Padlan,Molec.Immun.,31(3):169-217(1994))，其中是通过用啮齿类CDR或CDR序列来取代人抗体的相应序列。因此，此类人源化的抗体是嵌合抗体(美国专利号4,816,567)，其中基本上少于完整的人可变结构域已经被来自非人物种的相应序列所取代。在实践中，人源化的抗体通常是其中一些CDR残基以及可能的一些FR残基被来自啮齿类抗体中类似位点的残基所取代的人抗体。例如，包含编码人源化的免疫球蛋白框架区的第一序列和编码期望的免疫球蛋白互补决定区的第二序列组的多核苷酸，其可以通过合成产生或者通过组合适宜的cDNA和基因组DNA区段来产生。人恒定区DNA序列可以依照公知的操作从多种人细胞分离。

"嵌合抗体"是这样的抗体分子，其中：(a)恒定区、或其部分经过改变、替代、或更换，从而使抗原结合位点(可变区)连接至不同的或改变的类别、效应功能和/或物种的恒定区，或者连接至完全不同的分子(其赋予嵌合抗体新的特性)，例如，酶、毒素、激素、生长因子、药物等；或者(b)可变区、或其部分经具有不同的或改变的抗原特异性的可变区改变、替代、或更换。本发明的(以及根据本发明使用的)优选抗体包括人源化的和/或嵌合的单克隆抗体。

用于将治疗剂缀合至抗体的技术是公知的(参见，例如Arnon等人,"MonoclonalAntibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy",MonoclonalAntibodies And Cancer Therapy；Reisfeld等人(eds.),pp.243-56(Alan R.Liss,Inc.1985)；Hellstrom等人,“Antibodies For Drug Delivery”,Controlled DrugDelivery(2

短语"特异性地(或选择性地)结合"至抗体或"特异性地(或选择性地)与"抗体免疫反应，当指的是蛋白或肽时，是指可确定蛋白存在(常常是在蛋白和其它生物制剂的异质性群体中)的结合反应。因而，在给定的免疫测定条件下，指定的抗体结合至特定的蛋白(至少是背景的两倍，且更通常是背景的超过10-100倍)。在此类条件下特异性结合至抗体，需要其对特定蛋白的特异性经过选择的抗体。例如，可以对多克隆抗体进行选择，以便仅获得与选定抗原(而不与其它蛋白)有特异性免疫反应的抗体的亚集。此选择可以通过排除与其它分子交叉反应的抗体来实现。许多的免疫测定形式可以用于选择与特定抗原有特异性免疫反应的抗体。例如，固相ELISA免疫测定常规用于选择与蛋白有特异性免疫反应的抗体(参见，例如Harlow&Lane,Using Antibodies,A Laboratory Manual(1998)for adescription of immunoassay formats and conditions that can be used todetermine specific immunoreactivity)。

"标记"或"可检测部分"是可通过光谱、光化学、生物化学、免疫化学、化学、或其它物理手段进行检测的成分。例如，可用的标记包括32P、荧光染料(例如花青)、电子致密试剂、酶(例如，通常用于ELISA的)、生物素、异羟基洋地黄毒苷元(digoxigenin)、或半抗原和蛋白或者其它可以使得能够检测的实体，例如，通过将放射性标记掺入至特异性地与靶标肽反应的肽或抗体中。可以使用本领域已知的用于将抗体缀合至标记的任何适当的方法，例如，使用Hermanson,Bioconjugate Techniques 1996,Academic Press,Inc.,San Diego中所描述的方法。

"接触"依照其惯常的含义使用，并且是指使至少两个不同的种类(例如化合物(包括生物分子)或细胞)足够接近以反应、相互作用或物理触碰的过程。然而，应当理解的是，所得的反应产物可以从所添加的试剂之间的反应直接产生，或者从可在反应混合物中产生的一或多种所添加试剂的中间体产生。

术语"接触"可包括使两个种类反应、相互作用或物理触碰，其中所述两个种类可以例如是如本文所述的抗体结构域和抗体结合结构域。在实施方案中，接触例如包括，使本文所述的抗体结构域与抗体结合结构域相互作用。

"患者"或"有需要的个体"是指患有(或易患)疾病或病征的活的生物体，所述疾病或病征可以通过使用本文所提供的组合物或药物组合物来进行治疗。非限制性实例包括人、其它哺乳动物、牛、大鼠、小鼠、狗、猴、山羊、绵羊、奶牛、鹿、和其他非哺乳类的动物。在一些实施方案中，患者是人。

术语"疾病"或"病征"是指能够用本文提供的化合物、药物组合物、或方法进行治疗的患者或个体的生存状态或健康状况。在实施方案中，所述疾病是癌症(例如肺癌、卵巢癌、骨肉瘤、膀胱癌、宫颈癌、肝癌、肾癌、皮肤癌(例如，Merkel细胞癌)、睾丸癌、白血病、淋巴瘤、头颈癌、结肠直肠癌、前列腺癌、胰腺癌、黑色素瘤、乳腺癌、成神经细胞瘤)。所述疾病可以是自身免疫疾病、炎症性疾病、癌症疾病、感染性疾病、代谢疾病、发育疾病、心血管疾病、肝病、肠病、内分泌疾病、神经疾病、或其它疾病。

如本文所用，术语"癌症"是指在哺乳动物中发现的所有类型的癌症、赘生物、或恶性肿瘤，包括白血病、淋巴瘤、黑色素瘤、神经内分泌肿瘤、癌变和肉瘤。可以用本文提供的化合物、药物组合物、或方法进行治疗的示例性的癌症包括淋巴瘤、肉瘤、膀胱癌、骨癌、脑肿瘤、宫颈癌、结肠癌、食道癌、胃癌、头颈癌、肾癌、骨髓瘤、甲状腺癌、白血病、前列腺癌、乳腺癌(例如三阴性的、ER阳性的、ER阴性的、化疗抗性的、赫赛汀抗性的、HER2阳性的、阿霉素抗性的、他莫昔芬抗性的、导管癌、小叶癌、原发的、转移的)、卵巢癌、胰腺癌、肝癌(例如肝细胞癌)、肺癌(例如非小细胞肺癌、鳞状细胞肺癌、腺癌、大细胞肺癌、小细胞肺癌、类癌、肉瘤)、多形性成胶质细胞瘤、神经胶质瘤、黑色素瘤、前列腺癌、去势难治性前列腺癌、乳腺癌、三阴性乳腺癌、胶质母细胞瘤、卵巢癌、肺癌、鳞状细胞癌(例如，头部、颈部、或食道)、结肠直肠癌、白血病、急性髓系白血病、淋巴瘤、B细胞淋巴瘤、或多发性骨髓瘤。另外的实例包括，甲状腺癌、内分泌系统癌症、脑癌、乳腺癌、宫颈癌、结肠癌、头颈癌、食道癌、肝癌、肾癌、肺癌、非小细胞肺癌、黑色素瘤、间皮瘤、卵巢癌、肉瘤、胃癌、子宫癌或成神经管细胞瘤、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤病、多发性骨髓瘤、成神经细胞瘤、神经胶质瘤、多形性成胶质细胞瘤、卵巢癌、横纹肌肉瘤、原发性血小板增多症、原发性巨球蛋白血症、原发性脑肿瘤、癌症、恶性胰岛素瘤、恶性类癌、膀胱癌、皮肤癌前病变、睾丸癌、淋巴瘤、甲状腺癌、成神经细胞瘤、食道癌、泌尿生殖道癌症、恶性高钙血症、子宫内膜癌、肾上腺皮质癌、胰腺内分泌或外分泌的赘生物、髓样甲状腺癌、髓样甲状腺癌变、黑色素瘤、结肠直肠癌、乳突状甲状腺癌、肝细胞癌、乳头Paget病、叶状肿瘤、小叶癌、导管癌、胰腺星状细胞癌、肝星状细胞癌、或前列腺癌。

术语"白血病"广泛的是指血液形成器官的进行性的、恶性疾病，并且一般特征在于血液中和骨髓中白细胞及其前体的异常增殖和发育。白血病一般在临床上基于以下而进行分类：(1)疾病急性或慢性的期间和特征；(2)所涉及的细胞类型；髓系的(髓性的)、淋巴系的(淋巴性的)、或单核细胞的；和(3)白血病或白细胞缺乏症(亚白血病)的血液中异常细胞数目的增加或不增加。可以用本文提供的化合物、药物组合物、或方法进行治疗的示例性白血病包括，例如，急性非淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、急性粒细胞白血病、慢性粒细胞白血病、急性早幼粒细胞白血病、成人T-细胞白血病、白细胞缺乏白血病、白血病性白血病、嗜碱性粒细胞白血病、母细胞白血病、牛白血病、慢性髓细胞白血病、皮肤白血病、胚胎性白血病、嗜酸性粒细胞白血病、Gross白血病、毛细胞白血病、血胚细胞白血病、成血细胞白血病、组织细胞白血病、干细胞白血病、急性单核细胞白血病、白细胞减少性白血病、淋巴性白血病、成淋巴细胞性白血病、淋巴细胞性白血病、淋巴生成型白血病、淋巴系白血病、淋巴肉瘤细胞白血病、肥大细胞白血病、巨核细胞性白血病、小成髓细胞性白血病、单核细胞性白血病、成髓细胞性白血病、髓细胞性白血病、髓样粒细胞白血病、髓单核细胞性白血病、Naegeli白血病、血浆细胞白血病、多发性骨髓瘤、浆细胞性白血病、早幼粒细胞白血病、Rieder细胞白血病、Schilling白血病、干细胞白血病、亚白血病性白血病、或未分化细胞白血病。

术语"肉瘤"一般是指由像胚性结缔组织这样的物质所构成的肿瘤，并且一般是由嵌入至纤维状或均质性物质内的紧密堆积的细胞所组成。可以用本文提供的化合物、药物组合物、或方法进行治疗的肉瘤包括软骨肉瘤、纤维肉瘤、淋巴肉瘤、黑色素肉瘤、粘液肉瘤、骨肉瘤、Abemethy肉瘤、脂肉瘤、脂肪肉瘤、腺泡状软组织肉瘤、成釉细胞肉瘤、葡萄样肉瘤、绿色瘤肉瘤、绒毛膜癌、胚胎性肉瘤、Wilms肿瘤肉瘤、子宫内膜肉瘤、间质肉瘤、Ewing肉瘤、筋膜肉瘤、成纤维细胞肉瘤、巨细胞肉瘤、粒细胞肉瘤、霍奇金肉瘤、特发性多发性色素沉着出血性肉瘤肉瘤、B细胞的成免疫细胞肉瘤、淋巴瘤、T细胞的成免疫细胞肉瘤、Jensen肉瘤、Kaposi肉瘤、Kupffer细胞肉瘤、血管肉瘤、白细胞肉瘤、恶性间叶瘤肉瘤、骨膜外肉瘤、网状细胞肉瘤、Rous肉瘤、浆液性囊肿肉瘤、华液肉瘤、或毛细血管扩张肉瘤。

术语"黑色素瘤"是用来指产生于皮肤和其它器官的黑色素细胞系统的肿瘤。可以用本文提供的化合物、药物组合物、或方法进行治疗的黑色素瘤包括，例如，肢端雀斑样痣性黑色素瘤、非黑色素性黑色素瘤、良性幼年黑色素瘤、Cloudman黑色素瘤、S91黑色素瘤、Harding-Passey黑色素瘤、幼年黑色素瘤、恶性雀斑样痣黑色素瘤、恶性黑色素瘤、结节性黑色素瘤、指甲下黑色素瘤、或表浅蔓延型黑色素瘤。

术语"癌变"是指由上皮细胞构成的恶性新生物，其中所述上皮细胞倾向于浸润周围的组织并引起转移瘤。可以用本文提供的化合物、药物组合物、或方法进行治疗的示例性癌变包括，例如，髓样甲状腺癌变、家族性髓样甲状腺癌变、腺泡状癌变、腺泡癌变、腺囊癌性变、腺样囊性癌变、腺瘤癌变、肾上腺皮质的癌变、肺泡癌变、肺泡细胞癌变、基底细胞癌变、基底样细胞癌变、基底细胞样癌变、基底鳞状细胞癌、细支气管肺泡癌变、细支气管癌变、支气管源的癌变、髓样癌变、胆管细胞癌变、绒毛膜癌变、胶样癌变、粉刺癌变、子宫体癌变、筛状癌变、铠甲状癌变、癌疮、柱状癌变、柱状细胞癌变、胆管癌变、导管癌变、硬癌变、胚胎性癌变、髓样癌变、表皮样癌变、腺样上皮癌变、外植癌变、溃疡性癌变、纤维癌变、胶样癌变、胶状癌变、巨细胞癌变、巨细胞癌、腺体癌变、粒膜细胞癌变、毛发基质癌变、血样癌变、肝细胞癌变、Hurthle细胞癌变、胶样癌变、肾上腺样癌变、婴儿胚胎性癌变、原位癌变、表皮内癌变、上皮内癌变、Krompecher癌变、Kulchitzky-细胞癌变、大细胞癌变、豆状癌变、豆状癌、脂肪瘤癌变、小叶癌、淋巴上皮癌变、骨髓癌变、骨髓癌、黑色素癌变、软癌变、粘液癌变、粘液癌、粘液细胞癌变、粘液表皮样癌变、粘膜癌、粘膜癌变、粘液瘤癌变、鼻咽癌变、燕麦细胞癌变、骨化性癌变、骨样癌变、乳突状癌变、门静脉周癌变、浸润前癌变、棘细胞癌变、脑样癌变、肾脏的肾细胞癌、储备细胞癌变、肉瘤样癌变、施耐德氏癌变、硬癌变、阴囊癌变、印指环状细胞癌变、单纯癌变、小细胞癌变、马铃薯状癌变、球状细胞癌变、皮质层细胞癌变、海绵体癌变、鳞状癌变、鳞状细胞癌变、绳捆癌变、毛细血管扩张癌变、毛细血管扩张癌、移行细胞癌变、结节性皮癌、管状癌变、结节性皮癌变、疣状癌变、或绒毛状癌变。

如本文所用，术语"转移"、"转移的"、和"转移癌"可互换使用，并且是指增殖性疾病或病征(例如癌症)从一个器官或另一非相邻器官或身体部分的扩散。癌症在初始位点(例如，乳房)发生，该位点称作原发性肿瘤，例如，原发性乳腺癌。原发性肿瘤或初始位点中的一些癌细胞获得了在局部区域穿透和浸润周围正常组织的能力、和/或穿透淋巴系统或血管系统的壁从而通过所述系统循环至身体其它位点和组织的能力。从原发性肿瘤的癌细胞所形成的第二个临床可检测的肿瘤则称作是转移肿瘤或继发性肿瘤。当癌细胞转移时，转移肿瘤及其细胞推定为与原始肿瘤的细胞类似。因而，如果肺癌转移至乳房，那么在乳房位点的继发性肿瘤由异常的肺细胞(而不是异常的乳房细胞)组成。乳房中的继发性肿瘤称作转移肺癌。因而，短语转移癌症是指这样的疾病，其中个体具有或曾具有原发肿瘤，并且其具有一或多个继发性肿瘤。短语非转移癌症或具有不是转移的癌症的个体是指这样的疾病，其中具有原发性肿瘤但却不具有一或多个继发性肿瘤。例如，转移肺癌是指个体中这样的疾病，其中所述个体具有原发性肺肿瘤(或其病史)，并且在第二部位或多个部位(例如，在乳房中)具有一或多个继发性肿瘤。

如本文所用，"自身免疫疾病"是指由个体免疫系统改变的免疫反应所产生的疾病或病征(例如针对通常存在于个体身体内的物质组织和/或细胞)。自身免疫疾病包括但不限于，关节炎、类风湿性关节炎、银屑病关节炎、幼年特发性关节炎、硬皮病、全身性硬皮病、多发性硬化、全身性红斑狼疮(SLE)、重症肌无力、幼发型糖尿病、1型糖尿病、吉兰-巴雷综合征、桥本氏脑炎、桥本氏甲状腺炎、强直性脊柱炎、银屑病、干燥综合征、脉管炎、肾小球性肾炎、自身免疫甲状腺炎、Behcet病、克罗恩病、溃疡性结肠炎、大疱性类天疱疮、肉状瘤病、银屑病、鱼鳞癣、Graves眼病、炎症性肠病、爱迪生氏病、白癜风、哮喘、和过敏性哮喘。

如本文所用，"炎症性疾病"是指与异常或改变的炎症相关的疾病或病征。炎症是由免疫系统所发起的生物学应答，作为应对病原体、损伤的细胞或组织或刺激物的愈合过程的一部分。慢性炎症可导致多种疾病。炎症性疾病包括但不限于，动脉粥样硬化、过敏、哮喘、类风湿性关节炎、移植排斥、乳糜泻、慢性前列腺炎、炎症性肠病、骨盆炎症性疾病、和炎症性肌病。

如本文所用，"代谢失调"是指涉及多种分子和物质的异常代谢的疾病或病征，所述分子和物质包括，例如，碳水化合物、氨基酸、有机酸。代谢失调包括但不限于，碳水化合物代谢的失调(例如糖原贮积症)，氨基酸代谢的失调(例如苯丙酮尿症、槭糖尿病、1型戊二酸血症)，尿素循环障碍或尿素循环缺陷(例如，氨甲酰磷酸合成酶I缺乏症)，有机酸代谢的障碍(有机酸尿症)(例如尿黑酸尿症)，脂肪酸氧化和线粒体代谢的障碍(例如中链酰基辅酶A脱氢酶缺乏症)，卟啉代谢的障碍(例如急性间歇性卟啉病)，嘌呤或嘧啶代谢的障碍(例如Lesch-Nyhan综合征)，类固醇代谢的障碍(例如类脂性肾上腺皮质增生症、先天性肾上腺皮质增生症)，线粒体功能的障碍(例如，Kearns-Sayre综合征)，过氧化物酶体功能的障碍(例如Zellweger综合征)，以及溶酶体贮积症(例如高雪氏症、和Niemann Pick病)。

如本文所用，"发育障碍"是指常常源自童年且与语言障碍、学习障碍、运动障碍和神经发育障碍相关联的疾病或病征。实例包括但不限于，自闭症谱系障碍和注意力缺陷障碍。

如本文所用，"心血管疾病"是指与心脏、血管或者二者相关的疾病。心血管疾病包括但不限于，冠心病、心肌病、高血压性心脏病、心脏衰竭、心脏节律不齐、炎症性心脏病、外周动脉疾病、脑血管疾病和炎症性心脏病。

如本文所用，"肝病"是指与肝脏和/或肝功能异常相关联的疾病。肝病包括但不限于，肝炎、酒精性肝病、脂肪肝、肝硬化、Budd-Chiari综合征、Gilbert综合征以及癌症。

如本文所用，术语"肠疾病"是指与肠(小肠或大肠)中的异常相关联的疾病或病征。肠疾病包括但不限于，肠胃炎、大肠炎、回肠炎、阑尾炎、乳糜泻、Chron病、肠道病毒、肠易激综合征、和憩室病。

如本文所用，术语"内分泌疾病"是指内分泌系统的疾病或病征，包括内分泌腺分泌不足、内分泌腺分泌过多以及肿瘤。内分泌疾病包括但不限于，爱迪生氏病、糖尿病、Conn综合征、Cushing综合征、糖皮质激素可抑制醛固酮增多症、低血糖症、甲状腺功能亢进、甲状腺功能减退、甲状腺炎、垂体功能减退、性腺功能减退、以及甲状旁腺病征。

如本文所用，术语"神经障碍"是指身体神经系统的疾病或病征，包括结构性的、生化的、或电性的异常。神经障碍包括但不限于，脑损伤、脑功能失调、脊髓病征、外周神经病变、颅神经病征、自主神经系统失调、癫痫症、运动障碍(例如帕金森病和多发性硬化)、以及中枢神经病变。

如本文所用，术语"感染性疾病"是指在宿主个体中与病原物质的感染、存在和/或生长相关联的疾病或病征。感染性病原物质包括但不限于，病毒、细菌、真菌、原生动物、多细胞寄生虫、以及异常蛋白(例如朊病毒)。与感染性疾病相关联的病毒包括但不限于，单纯疱疹病毒、巨细胞病毒、Epstein-Barr病毒、水痘-带状疱疹病毒、疱疹病毒、水泡性口炎病毒、肝炎病毒、鼻病毒、冠状病毒、流感病毒、麻疹病毒、多瘤病毒、人乳头瘤病毒、呼吸道合胞体病毒、腺病毒、柯萨奇病毒、登革病毒、腮腺炎病毒、脊髓灰质炎病毒、狂犬病病毒、Rous肉瘤病毒、黄热病病毒、埃博拉病毒、猿免疫缺陷病毒、人免疫缺陷病毒。与感染性疾病相关联的细菌包括但不限于，结核分歧杆菌(M.tuberculosis)、沙门氏菌(Salmonella)种类、大肠杆菌(E.coli)、衣原体(Chlamydia)种类、葡萄球菌(Staphylococcus)种类、芽孢杆菌(Bacillus)种类、以及假单胞菌(Psudomonas)种类。

术语"相关的"或"与……相关联的"在与疾病(例如，糖尿病、癌症(例如前列腺癌、肾癌、转移癌症、黑色素瘤、去势难治性前列腺癌、乳腺癌、三阴性乳腺癌、胶质母细胞瘤、卵巢癌、肺癌、鳞状细胞癌(例如，头部、颈部、或食道)、结肠直肠癌、白血病、急性髓系白血病、淋巴瘤、B细胞淋巴瘤、或多发性骨髓瘤))相关的物质或物质活性或功能的背景下，意味着所述疾病(例如肺癌、卵巢癌、骨肉瘤、膀胱癌、宫颈癌、肝癌、肾癌、皮肤癌(例如，Merkel细胞癌)、睾丸癌、白血病、淋巴瘤、头颈癌、结肠直肠癌、前列腺癌、胰腺癌、黑色素瘤、乳腺癌、成神经细胞瘤)、或者该疾病的症状，是(全部或部分)由所述物质或物质活性或功能所引起的。

术语"异常的"如本文所用是指与正常的不同。当用于描述酶活性的时候，异常是指活性大于或小于正常对照或正常非疾病对照样品的平均。异常的活性可以是指导致疾病的活性的量，其中将异常的活性恢复至正常的或非疾病相关的量(例如通过使用如本文所述的方法)，导致疾病或者一或多种疾病症状的减弱。

如本文所用，术语"细胞穿透的"或"细胞穿透"是指分子(例如，蛋白)以显著的或有效的量从细胞外环境穿入至细胞内的能力。因而，细胞穿透缀合物是从细胞外环境经过膜穿入至细胞内的分子。

如本文所用，术语"非细胞穿透的"或"非细胞穿透"是指分子(例如，蛋白或多肽)不具有以显著的或有效的量从细胞外环境穿入至细胞内的能力。因而，非细胞穿透肽或蛋白一般不能够从细胞外环境经过细胞膜穿入至细胞内以实现对细胞群体、器官或生物体的显著生物学作用。该术语并不排除一或多种小数目的肽或蛋白可以进入细胞的可能性。然而，该术语是指一般而言不能从细胞外环境以显著的程度进入细胞的分子。非细胞穿透分子和物质的实例包括但不限于大分子，如例如，高分子量蛋白。肽或蛋白可以使用本领域技术人员已知的方法来确定为非细胞穿透的。作为实例，肽或蛋白可以经荧光标记，并且可以通过流式细胞术分析或共聚焦显微镜在体外确定肽或蛋白从细胞外环境穿入细胞的能力。

如本文所用，"分子量"(M.W.)或"分子质量"是指分子中所有原子的原子重量之和。对于分子，具有高分子量的分子通常具有25kDa或更高的分子量。作为实例，高分子量蛋白可以具有从大约25kDa至1000kDa或更高的M.W.。

如本文所用，术语"细胞内"意味着在细胞之内。如本文所用，"细胞内靶标"是位于细胞之内的靶标，例如，核酸、多肽或其它分子(例如碳水化合物)，并且是本文所提供的非细胞穿透蛋白所结合的靶标。结合可以是直接的或间接的。在实施方案中，非细胞穿透蛋白选择性地结合细胞内靶标。术语"选择性结合(selectively binds、selectivelybinding)"或"特异性结合"，是指剂(例如，非细胞穿透蛋白)结合一种剂(例如，细胞内靶标)而部分或完全排除其它剂。对于结合意味着相对于测定方法的背景至少1.5倍的可检测结合。对于选择性或特异性结合，此种可检测结合对于给定剂是能够检测到而对于对照剂则不能。或者或另外，对结合的检测可以通过测定下游分子或事件的存在来进行确定。

如本文所用，术语"缀合"是指原子或分子之间的关联。该关联可以是直接的或间接的。例如，核酸和蛋白之间或蛋白和蛋白之间的缀合可以是直接的(例如，通过共价键)，或者是间接的(例如，通过非共价键(例如静电相互作用(例如离子键、氢键、卤键)、范德华相互作用(例如偶极-偶极、偶极诱导的偶极、伦敦色散)、环堆积(π效应)、疏水相互作用等)。在实施方案中，缀合物是使用缀合化学所形成的，所述缀合化学包括但不限于亲核取代(例如，胺和醇与酰基卤、活性酯的反应)、亲电取代(例如，烯胺反应)以及对碳-碳和碳-杂原子多重键的加成(例如，Michael反应、Diels-Alder加成)。这些以及其它可用的反应在例如以下中有讨论：March,ADVANCED ORGANIC CHEMISTRY,3rd Ed.,John Wiley&Sons,NewYork,1985；Hermanson,BIOCONJUGATE TECHNIQUES,Academic Press,San Diego,1996；和Feeney等人,MODIFICATION OF PROTEINS；Advances in Chemistry Series,Vol.198,American Chemical Society,Washington,D.C.,1982。

包括用于本文缀合化学的共价反应性部分或官能团的可用反应部分例如包括：

(a)羧基基团以及其各种衍生物，包括但不限于N-羟基琥珀酰亚胺酯、N-羟基苯并三唑酯、酰卤、酰基咪唑、硫酯、对硝基苯基酯、烷基酯、烯基酯、炔基酯和芳香酯；

(b)羟基基团，其可以被转化为酯、醚、醛等。

(c)卤代烷基基团，其中卤素可以随后被亲核基团替换，如例如，胺、羧酸阴离子、硫醇阴离子、碳负离子、或醇盐离子，由此导致新的基团共价连接在卤素原子的位点处；

(d)亲双烯基团，其能够参与Diels-Alder反应，如例如，马来酰亚胺基团；

(e)醛或酮基团，使得可以经过羰基衍生物(例如，亚胺、腙、缩氨基脲或肟)的形成、或者经过如Grignard加成或烷基锂加成这样的机制而进行随后的衍生化；

(f)磺酰卤基团，以用于随后与胺反应，例如以形成磺胺；

(g)硫醇基团，其能够被转化为二硫化物、与酰基卤反应、或结合至金属(如金)；

(h)胺或巯基基团，其例如可以是，经酰基化的、烷基化的或氧化的；

(i)烯烃，其例如可以进行环加成、酰基化、Michael加成等；

(j)环氧化物，其可以例如与胺和羟基化合物反应；

(k)亚磷酰胺和其它用于核酸合成的标准官能团；

(l)金属氧化硅键合(bonding)；

(m)金属，键合至反应磷基团(例如磷化氢)，以形成例如，磷酸二酯键；和

(n)砜，例如，乙烯砜。

反应官能团可以经过选择，使它们不会参与或者干扰本文所述蛋白的化学稳定性。

"对照"或"标准对照"是指用作参考(通常是已知参考)的样品、量度、或值，以用于与测试样品、量度、或值进行比较。例如，可以从疑似患有给定疾病(例如自身免疫疾病、炎症性自身免疫疾病、癌症、感染性疾病、免疫疾病、或其它疾病)的患者获取测试样品，并与已知正常(非疾病)个体(例如标准对照个体)比较。标准对照也可以代表从不具有给定疾病的相似个体(例如标准对照个体，例如，具有相似医学背景、相同的年龄、重量等的个体)的群体(也即标准对照群体)收集的平均量度或值。标准对照值也可以从同一个体获得，例如较早地从疾病发生前的该患者所获得。例如，对照可以设想为基于药理学数据(例如，半衰期)或治疗措施(例如，副作用的比较)来比较治疗价值。对照对于确定数据的显著性也是有价值的。例如，如果给定参数的值在对照中有广泛变化，那么测试样品中的差异就不会被认为是显著的。本领域技术人员会意识到，标准对照可以设计为用于评估任何数目的参数(例如RNA水平、蛋白水平、具体细胞类型、具体体液、具体组织、滑膜细胞、滑液、滑膜组织、成纤维细胞样滑膜细胞、巨噬细胞样滑膜细胞等)。

本领域技术人员会理解哪种标准对照在给定的情形中最适宜，并且能够就与标准对照值的比较来分析数据。标准对照对于确定数据的显著性(例如统计学显著性)也是有价值的。例如，如果给定参数的值在标准对照中有广泛变化，那么测试样品中的差异就不会被认为是显著的。

术语"诊断"是指个体中存在疾病(例如自身免疫、炎症性自身免疫、癌症、感染性的、免疫、或其它疾病)的相对可能性。类似地，术语"预后"是指个体中关于疾病状态某种未来结果会发生的相对可能性。例如，在本发明的背景下，预后可以是指个体发展出疾病(例如自身免疫、炎症性自身免疫、癌症、感染性的、免疫、或其它疾病)的可能性、或者是该疾病的可能的严重性(例如，疾病的持续期间)。该术语并不是绝对的，如医疗诊断领域内的技术人员会理解的那样。

"生物学样品"或"样品"是指从个体或患者获得或者源自个体或患者的材料。生物学样品包括组织的切片如活检或尸检样品，以及用于组织学目的而获取的冷冻切片。此类样品包括体液，如血液和血液部分或产品(例如，血清、血浆、血小板、红细胞等)、痰、组织、培养的细胞(例如，原代培养物、外植体、和转化的细胞)、粪便、尿液、滑液、关节组织、滑膜组织、滑膜细胞、成纤维细胞样滑膜细胞、巨噬细胞样滑膜细胞、免疫细胞、造血细胞、成纤维细胞、巨噬细胞、T细胞等。生物学样品通常得自真核生物体，如哺乳动物如灵长类，例如，黑猩猩或人类；奶牛；狗；猫；啮齿类，例如，豚鼠、大鼠、小鼠；兔；或鸟类；爬行动物；或鱼类。

"细胞"如本文所用，是指进行代谢或进行其它足以保持或复制其基因组DNA的功能的细胞。细胞可以通过本领域公知的方法来进行鉴别，包括例如，存在完整的膜、被特定的染料所染色、产生后代的能力、或者(在配子的情形中)与第二配子组合以产生存活后代的能力。细胞可包括原核细胞和真核细胞。原核细胞包括但不限于细菌。真核细胞包括但不限于酵母细胞和衍生自植物或动物的细胞，例如哺乳动物、昆虫(例如灰翅夜蛾)和人类细胞。细胞可以当其是天然非附着时而使用，或者其已经经过处理而不会附着至表面(例如通过胰蛋白酶化)。

本文所述的术语“花青”或“花青部分”指含有两个被聚次甲基链分开的氮基团的化合物。在实施方案中，花青部分具有3个次甲基结构(即花青3)。在实施方案中，花青部分具有5个次甲基结构(即花青5)。在实施方案中，花青部分具有7个次甲基结构(即花青7)。花青部分可以是未被取代的。花青部分可以是被取代的。

当部分是被取代的(例如，被取代的烷基、被取代的杂烷基、被取代的环烷基、被取代的杂环烷基、被取代的芳基、被取代的杂芳基、被取代的亚烷基、被取代的亚杂烷基、被取代的亚环烷基、被取代的亚杂环烷基、被取代的亚芳基和/或被取代的亚杂芳基)，该部分被至少一个取代基(例如，取代基、大小受限的取代基或低级取代基)取代，且各取代基任选地是不同的。另外，当部分上存在多个取代基时，各取代基可以任选地是不同的。

II.细胞穿透缀合物

本文提供的是(尤其是)细胞穿透缀合物，其包括非细胞穿透蛋白(例如，抗体)。本文提供的缀合物和方法提供高效的方式，用于递送非细胞穿透蛋白(例如，抗体)至细胞中用于治疗性和诊断性目的。本文提供的缀合物包括非细胞穿透蛋白，如抗体，通过接头(L

在一方面，提供具有下式的细胞穿透缀合物：

在式(I)或(IV)中，Ar

在实施方案中，细胞穿透缀合物具有式

其中Ar

其中Ar

在实施方案中，Ar

在实施方案中，Ar

在实施方案中，Ar

在实施方案中，Ar

在实施方案中，Ar

在实施方案中，Ar

在实施方案中，Ar

在实施方案中，Ar

在实施方案中，Ar

在实施方案中，Ar

在实施方案中，Ar

在实施方案中，Ar

在实施方案中，Ar

在实施方案中，Ar

在实施方案中，Ar

在实施方案中，Ar

在实施方案中，Ar

在实施方案中，Ar

在实施方案中，Ar

在实施方案中，Ar

在实施方案中，细胞穿透缀合物具有式：

在实施方案中，细胞穿透缀合物具有式：

其中R

在实施方案中，R

在实施方案中，细胞穿透缀合物具有式：

其中R

在实施方案中，细胞穿透缀合物具有式：

其中R

当氮通过L

在实施方案中，R

在实施方案中，R

在实施方案中，R

在实施方案中，R

在实施方案中，R

在实施方案中，R

在实施方案中，R

在实施方案中，R

在实施方案中，R

在实施方案中，R

在实施方案中，R

在实施方案中，R

在实施方案中，R

在实施方案中，R

在实施方案中，R

在实施方案中，R

在实施方案中，X是-F。在实施方案中，X是-Cl。在实施方案中，X是-Br。在实施方案中，X是-I。在实施方案中，n是1。在实施方案中，n是2。在实施方案中，符号z

在实施方案中，L

在实施方案中，L

在实施方案中，L

在实施方案中，L

在实施方案中，L

在实施方案中，L

在实施方案中，L

在实施方案中，L

-L

L

L

在实施方案中，L

L

在实施方案中，L

在实施方案中，L

L

在实施方案中，L

在实施方案中，L

在实施方案中，L

在实施方案中，L

在实施方案中，L

在实施方案中，细胞穿透缀合物具有式：

其中R

在实施方案中，细胞穿透缀合物具有式：

其中R

在实施方案中，非细胞穿透蛋白具有超过25kD的分子量。在实施方案中，非细胞穿透蛋白具有大约25kD至大约750kD的分子量。因而，非细胞穿透蛋白可以具有至少大约25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、205、210、215、220、225、230、235、240、245、250、255、260、265、270、275、280、285、290、295、300、305、310、315、320、325、330、335、340、345、350、355、360、365、370、375、380、385、390、395、400、405、410、415、420、425、430、435、440、445、450、455、460、465、470、475、480、485、490、495、500、505、510、515、520、525、530、535、540、545、550、555、560、565、570、575、580、585、590、595、600、605、610、615、620、625、630、635、640、645、650、655、660、665、670、675、680、685、690、695、700、705、710、715、720、725、730、735、740、745、750、或更多千道尔顿(kD)的分子量。在实施方案中，非细胞穿透蛋白具有至少大约25至100kD、至少大约25至150kD、至少大约25至200kD、至少大约25至250kD、至少大约25至300kD、至少大约25至350kD、至少大约25至400kD、至少大约25至450kD、至少大约25至500kD、至少大约25至550kD、至少大约25至600kD、至少大约25至650kD、至少大约25至700kD、或至少大约25至750kD的分子量。

在实施方案中，非细胞穿透蛋白是抗体。如上文中更详细地讨论的，抗体可以是全长抗体如IgG、IgA、IgM、IgD或IgE抗体或者其片段。在实施方案中，抗体是IgG抗体或者其片段。在实施方案中，抗体是IgG抗体或者其片段。在实施方案中，抗体是Fv片段或人源化的抗体。在实施方案中，抗体是IgA、IgM、IgD、或IgE抗体。在实施方案中，抗体是Fv片段。在实施方案中，抗体是人源化的抗体。在实施方案中，抗体是嵌合抗体。在实施方案中，抗体是治疗性抗体，也即，用于疾病的治疗的抗体。因而，还提供连接至细胞穿透缀合物的治疗性抗体，其中所述抗体结合细胞内靶标。

在实施方案中，非细胞穿透蛋白结合细胞内靶标。细胞内靶标可以是治疗性靶标或诊断性靶标或者位于细胞内的其它感兴趣的靶标，例如，要通过例如共聚焦显微镜来成像的靶标或结构，例如组蛋白。因而，提供结合至细胞内靶标的细胞穿透缀合物。在实施方案中，细胞内靶标是选自以下的疾病的靶标：自身免疫疾病、炎症性疾病、代谢失调、发育障碍、心血管疾病、肝病、肠疾病、感染性疾病、内分泌疾病、神经障碍和癌症。细胞内靶标的实例包括(而不局限于)致癌转录因子，包括但不限于STAT3、Myc、NFkB、AP1、HIF、突变体p53；癌蛋白，包括但不限于Ras、Raf、MAPK、PI3激酶、AKT、BTK、JAK、SRC家族成员；免疫调节分子，包括FOXp3，T-BET，GATA3，STAT1、2、3、4、5、6。疾病的靶标可以是诊断性靶标或治疗性靶标或者与疾病相关联的其它感兴趣的靶标。示例性的癌症细胞内靶标包括但不限于，STAT(例如STAT3)、NFκB、PKB/Akt、Myc家族成员、类固醇激素受体(例如雌激素受体)、类固醇激素受体的配体(例如细胞周期蛋白D1)、受体酪氨酸激酶(RTK)、HER2、EGFR、VEGFR、PDGFR、Src家族成员、Ras、Abl、BCR-Abl、NPM-Alk、Janus激酶(JAK)、Brutun酪氨酸激酶(BTK)、以及病毒癌蛋白(例如，EBV蛋白，或HPV蛋白，例如，E6和E7)。在实施方案中，感染性疾病的细胞内靶标是病毒蛋白或病毒转录物。因而，细胞内靶标可以是人免疫缺陷病毒(HIV)、流感病毒、单纯疱疹病毒、EB病毒、巨细胞病毒、人乳头瘤病毒、或肝炎病毒的病毒蛋白或病毒转录物。在实施方案中，细胞内靶标是DNA结合蛋白，包括但不限于转录因子、转录增强子、转录阻遏物、组蛋白或经翻译后修饰的组蛋白。在实施方案中，细胞内靶标为经表观遗传学修饰的DNA，例如，经甲基化的或羟甲基化的胞嘧啶(5mC或5hmC)、5-甲酰基胞嘧啶(5fC)和5-羧基胞嘧啶(5caC)。在实施方案中，细胞内靶标是核酸，例如，RNA转录物或核酸。例如，细胞内靶标可以是感染性病原体(例如，寄生虫、病毒或细菌)的核酸。在实施方案中，细胞内靶标是信号分子或转录因子。在实施方案中，信号分子是磷酸酶或激酶。在实施方案中，细胞内靶标是癌症靶标或是位于癌细胞内。在实施方案中，细胞内靶标是STAT，例如，STAT3、Src或输出蛋白7。在实施方案中，细胞内靶标是STAT3。在实施方案中，细胞内靶标选自以下：STAT3、输出蛋白7、和Src。在实施方案中，细胞内靶标是磷酸化的Src。在实施方案中，细胞穿透缀合物结合至细胞内靶标。在实施方案中，非细胞穿透蛋白还包括可检测部分。

III.细胞组合物

在一方面，包含细胞穿透缀合物的细胞如本文所述(包括实施方案)(例如在一方面，实施方案、实施例、图、表或权利要求书)。提供包括一或多个所提供的细胞穿透缀合物的细胞，例如，所述细胞可包括多个细胞穿透缀合物。在实施方案中，缀合物在细胞内结合至细胞内靶标。在实施方案中，所述细胞是癌细胞。在实施方案中，所述细胞是非癌细胞。

IV.药物组合物

一方面，提供药物组合物，其包含如本文所述的细胞穿透缀合物(包括实施方案)(例如在一方面，实施方案、实施例、图、表或权利要求书)和药学上可接受的载体。

本文提供药物组合物，其包含细胞穿透缀合物和药学上可接受的载体。所提供的组合物(尤其)适宜用于体外或体内的制剂和给药。适宜的载体和赋形剂以及其制剂在以下中有描述，Remington:The Science and Practice of Pharmacy,21st Edition,DavidB.Troy,ed.,Lippicott Williams&Wilkins(2005)。对于药学上可接受的载体，意味着在生物学上或其它方面并非是不期望的材料，也即，该材料给药至个体而不会引起不期望的生物学效应或者与含有其的组合物中其它成分之间以有害的方式相互作用。如果给药至个体，载体任选是经过选择的，以便在个体中使活性成分的降解最小化以及使不良副作用最小化。

本发明提供的药物组合物包括这样的组合物，其中以治疗有效的量(也即，以有效实现其所要达到的目标的量)含有活性成分(例如本文所述的组合物，包括实施方案或实施例)。对于特定应用有效的实际量会(尤其)取决于所治疗的病况。当在方法中给药来治疗疾病时，本文所述的重组蛋白会含有有效实现期望的结果的一定量的活性成分，例如，调节靶标分子的活性，和/或减少、消除、或减缓疾病症状的进展。对本发明化合物治疗有效量的确定在本领域技术人员的能力范围内，尤其是在参考本文的详细公开后。

所提供的组合物可以包括单一剂或者超过一种剂。用于给药的组合物会通常包括本文所述的剂(溶解于药学上可接受的载体，优选含水载体)。可以使用多种含水载体，例如，缓冲盐水等。这些溶液是无菌的并且一般没有不期望的物质。这些组合物可以用常规的、公知的消毒技术来进行消毒。所述组合物可根据需要含有药学上可接受的辅助物质，以接近生理学条件，如pH调节和缓冲剂、毒性调节剂等，例如，乙酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、乳酸钠等。这些制剂中的活性剂的浓度可以广泛变化，并且会依照所选择的特定给药模式以及个体的需求而主要基于液体体积、粘性、体重等来进行选择。

活性化合物作为游离碱或药理学可接受的盐的溶液可以在与表面活性剂(如羟丙基纤维素)适当混合的水中制备。也可以在甘油、液体聚乙二醇、和其混合物以及在油中制备分散系(dispersion)。在储存和使用的普通条件下，这些制剂可以含有防腐剂以防止微生物的生长。

药物组合物可以经鼻内或可吸入溶液或喷雾、气雾剂或吸入剂来进行递送。鼻溶液可以是设计为要以滴和喷雾来给药至鼻通道的含水溶液。可以制备鼻溶液，从而使其在许多方面都与鼻分泌物类似。因而，含水鼻溶液通常是等渗的并且稍经缓冲以保持5.5至6.5的pH。另外，可以在制剂中包括抗微生物的防腐剂(类似于眼科制剂中所用的那些)以及适当的药物稳定剂(如果需要的话)。各种商业鼻制剂是已知的，并且可包括例如抗生素和抗组胺剂。

口服制剂可以包括赋形剂，例如，药用级别的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。这些组合物采用溶液、混悬剂、片剂、丸剂、胶囊、缓释制剂或散剂的形式。在一些实施方案中，口服药物组合物会包含惰性稀释剂或可同化食用载体，或者其可以被封装在硬壳或软壳的明胶胶囊中，或者其可以被压缩成片剂，或者其可以直接与饮食的食品掺合。对于口服治疗性给药，活性化合物可以与赋形剂掺合，并以可摄取片剂、口含片剂、锭剂、胶囊、酏剂、混悬剂、浆液、饼剂(wafer)等形式来进行使用。此类组合物和制剂应当含有至少0.1％的活性化合物。组合物和制剂的百分比，当然可以变化，并且方便地可以是在大约2％至大约75％的重量单位之间(或者优选25-60％)。此类组合物中活性化合物的量是使得可以获得适宜剂量的。

对于以含水溶液肠胃外给药，例如，所述溶液应当经过适当缓冲，并且液体稀释剂首先用充足的盐水或葡萄糖赋予等渗。含水溶液，特别是无菌含水介质，尤其适宜用于静脉内、肌内、皮下和腹膜内给药。例如，一个剂量可以溶解在1ml的等渗NaCl溶液中，并加入至1000ml的皮下输液中或注射至建议的输注部位。

可以通过将活性化合物或构建物以所需的量掺入至适当的溶剂中，随后进行过滤消毒，来制备无菌注射溶液。一般来说，分散剂是通过将各种经消毒的活性成分掺入至无菌载体(其含有碱性分散介质)中来制备的。可以使用真空干燥和冷冻干燥技术(其产生活性成分外加另外期望的成分的粉末)，来制备无菌粉末以用于重构建无菌注射溶液。也涵盖了制备更加浓缩、或高度浓缩的溶液用于直接注射。DMSO可以作为用于极快速渗透的溶剂来使用，将高浓度的活性剂递送至小的区域。

化合物的制剂可以存在于单位剂量或多剂量封装的容器中，如安瓿和小瓶。因而，组合物可以是单位剂量的形式。以此种形式将制剂再细分为含有适当量活性组分的单位剂量。因而，组合物可以多种单位剂量形式(取决于给药方法)来给药。例如，适用于口服给药的单位剂量形式包括但不限于，散剂、片剂、丸剂、胶囊和锭剂。

施用至哺乳动物的剂量和频率(单次或多次剂量)可以根据多种因素而变化，例如，该哺乳动物是否患有另一种疾病、以及其给药途径；受体的大小、年龄、性别、健康、体重、身体质量指数、和饮食；所治疗疾病症状的性质和程度(例如癌症的症状以及此类症状的严重性)、同时进行的治疗的类型、所治疗疾病的并发症或其它健康相关的问题。其它治疗方案或剂可以与本发明的方法和化合物联合使用。对已经确立的剂量的调整和操作(例如，频率和持续时间)是在本领域技术人员能力范围之内的。

对于本文所述的任何组合物(例如，所提供的细胞穿透缀合物)，治疗有效量初始可以从细胞培养的测定来确定。目标浓度会是能够实现本文所述方法的那些活性化合物的浓度(使用本文所述方法或本领域已知方法测量)。如本领域所公知的那样，用于人类的有效量也可以从动物模型来确定。例如，可以配制用于人类的剂量，来实现在动物中已经发现有效的浓度。人类中的剂量可以通过检测有效性和向上或向下调整剂量来进行调整，如上文所述。基于上文所述的方法和其它方法来调整剂量以实现最大效力，是在本领域技术人员能力范围之内的。

剂量可以依据患者的需求以及所使用的化合物来进行变化。在本发明的背景下，给药至患者的剂量随着时间应当足以在患者中实现有益的治疗应答。剂量的大小还会通过任何不良副作用的存在、性质和程度来确定。对于特定情况确定适宜剂量是在从业者能力范围之内的。一般来说，用低于化合物最佳剂量的较小的剂量来起始治疗。之后，通过小的提升来提高剂量，直至达到情况下的最佳效果。

剂量的量和间隔可以进行个别调整，以提供对所治疗的特定临床适应症有效的给药化合物水平。这会提供与个体疾病状态的严重性相称的治疗方案。

利用本文所提供的教导，可以计划有效的预防性或治疗性的治疗方案，其不会引起严重的毒性并且治疗临床症状依然有效(通过特定患者证明)。此计划应当涉及对活性化合物的仔细选择，这是通过考虑以下因素，如化合物的效力、相对生物利用度、患者体重、不良副作用的存在及严重性，优选的

"药学上可接受的赋形剂"和"药学上可接受的载体"是指辅助活性物质给药至个体并被个体吸收的物质，并且其可以包括在本发明组合物中而不会对患者引起显著的不良毒理学作用。药学上可接受的赋形剂的非限制性实例包括水、NaCl、生理盐水溶液、乳酸林格液、正常蔗糖、正常葡萄糖、粘合剂、填充剂、崩解剂、润滑剂、包衣、甜味剂、调味剂、盐溶液(如林格液)、醇、油、明胶、碳水化合物(如乳糖、直链淀粉或淀粉)、脂肪酸酯、羟甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、和着色剂等。此类制剂可以经过消毒，以及在期望时与辅助剂混合，所述辅助剂如润滑剂、防腐剂、稳定剂、湿润剂、乳化剂、用于影响渗透压的盐、缓冲剂、着色剂、和/或芳香物质等(不会与本发明的化合物产生有害的反应)。本领域技术人员会意识到其它药物赋形剂可用于本发明。

术语"药学上可接受的盐"是指衍生自本领域公知的多种有机和无机反离子的盐，并且包括(仅仅是以实例的方式)钠、钾、钙、镁、铵、四烷基铵等；以及当分子含有碱性官能性的时候，有机或无机酸的盐，如盐酸盐、氢溴酸盐、酒石酸盐、甲磺酸盐、乙酸盐、马来酸盐、草酸盐等。

术语"制剂"意在包括活性化合物的制剂，其具有封装材料作为载体以提供胶囊，活性组分(有或无其它载体)在其中被载体(因而与其相关联)所围绕。类似地，包括扁囊剂(cachets)和锭剂。片剂、散剂、胶囊、丸剂、扁囊剂、和锭剂可以用作适于口服给药的固体剂量形式。

V.递送方法

在一方面，提供将非细胞穿透蛋白递送至细胞中的方法，包括使细胞与本文所述的细胞穿透缀合物(包括实施方案)(例如在一方面，实施方案、实施例、图、表或权利要求书)接触。所述方法包括使所述细胞与本文所提供的细胞穿透缀合物(包括其实施方案)接触。在实施方案中，非细胞穿透蛋白结合细胞质中的核蛋白，由此形成非细胞穿透蛋白-核蛋白复合物。在实施方案中，非细胞穿透蛋白-核蛋白复合物不能够进入细胞的细胞核。

在实施方案中，细胞穿透缀合物用于在个体中诊断疾病。因而，提供在个体中诊断疾病的方法，包括向所述个体给药有效量的本文所述的细胞穿透缀合物或包含细胞穿透缀合物的组合物。缀合物的给药在个体中诊断疾病或者疾病的一或多种症状。所公开的方法涉及将来自测试样品的生物标志物(例如疾病的细胞内靶标)的水平或活性与对照样品比较。如上文所讨论的，对照样品或值是指用作参考(通常是已知参考)的样品，以用于与测试样品进行比较。对照也可以代表从相似个体(例如具有相似医学背景、相同年龄、体重等的癌症患者或健康个体)的群体收集的平均值。对照值也可以从同一个体获得，例如，从较早获得的样品(在疾病之前、或在治疗之前)中获得。也如上文所讨论的，诊断是指疾病(例如自身免疫、炎症性自身免疫、癌症、感染性的、免疫、或其它疾病)在个体中存在的相对可能性。

针对疾病风险因素的确定，术语比较、关联和相关，是指将个体中风险因素的存在或量(例如疾病的细胞内靶标的量)，与已知患有该疾病(或已知有该疾病的风险)的人、或已知没有该疾病的人中的存在或量进行比较，并基于测定结果来给出个体患有/发展出该疾病的提高的或降低的可能性。

VI.检测方法

在实施方案中，提供如本文所述的化合物、或其药学上可接受的盐(包括实施方案)(例如在一方面，实施方案、实施例、图、表或权利要求书)连接至(例如键合、非共价连接、共价键合)可检测部分。在实施方案中，连接至可检测部分的化合物可用于检测蛋白的方法中(例如光亲和标记)。在实施方案中，可检测部分是共价连接至化合物的光化学活性物种。在实施方案中，光化学活性物种是包括氮宾、卡宾、酮、阳离子和/或自由基的化合物。在实施方案中，光化学活性物种是花青。在可检测部分中是成像剂，包括荧光和发光物质，包括但不限于各种有机或无机小分子，通常称为"染料"、"标签"或"指示剂"。实例包括荧光素、罗丹明、吖啶染料、Alexa染料和花青染料。可用作根据公开的实施方案的成像剂的酶包括但不限于辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、酸性磷酸酶、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶、β-葡糖醛酸糖苷酶或β-内酰胺酶。这样的酶可用于与色原、荧光化合物或发光化合物结合以产生可检测信号。

本文还提供了在细胞中检测细胞内靶标的方法，包括将所述细胞与本文提供的细胞穿透缀合物(包括其实施方案)接触，并检测所述细胞穿透缀合物对细胞内靶标的结合。所述细胞可以是经固定的细胞或者活细胞。在实施方案中，所述细胞位于体外或体内。结合可以直接或间接检测。本文中理解并涵盖的是，可以使用许多的方法来检测细胞穿透缀合物对其细胞内靶标的结合。例如，可以通过测定细胞穿透缀合物与其细胞内靶标之间的偶合来直接对结合进行检测。可以例如通过选择以下测定来对结合进行确定：免疫共沉淀测定、共定位测定、或荧光偏振测定，如下文所述。所述测定在本领域中是已知的，例如，参见Sambrook等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,3

在实施方案中，通过成像方法或系统来对结合进行确定。因而，本文提供的细胞穿透缀合物(包括其实施方案)也可以用于成像应用或其它应用来用于分析细胞内靶标水平和/或活性。例如，所提供的细胞穿透缀合物可以用于感兴趣的细胞内靶标的体外或体内成像。在实施方案中，所述细胞穿透缀合物用于活细胞成像。例如，可以使用活细胞成像来监测活细胞内的细胞内靶标分布和/或动力学，并且其也适用于检测靶标相互作用。例如，在实施方案中，在活细胞中，所述细胞穿透缀合物可用于免疫沉淀和免疫共沉淀测定，来研究细胞中的蛋白-蛋白相互作用。在实施方案中，所述细胞穿透缀合物用于通过流式细胞术来分析细胞内靶标。在成像应用中，在实施方案中，所述细胞穿透缀合物经过标记(适宜于所使用的应用)。如上文所述，标记或可检测部分是可以通过光谱、光化学、生化、免疫化学、化学、或其他物理手段来检测的成分。可用的标记包括但不限于，32P、荧光染料(例如花青)、电子致密试剂、酶(例如ELISA中通常使用的)、生物素、异羟基洋地黄毒苷元、或半抗原和蛋白或者其它实体，其可以通过例如将放射标记掺入与靶标肽特异性反应的肽或抗体而变得可检测。可以使用本领域已知的用于将抗体缀合至标记的任何方法，例如，使用Hermanson,Bioconjugate Techniques 1996,Academic Press,Inc.,San Diego中描述的方法。

VII.治疗方法

本文提供的细胞穿透缀合物(包括其实施方案)以及包括本文提供的细胞穿透缀合物(包括其实施方案)的组合物，可以用于预防性的和治疗性的治疗。对于预防性的用途，在发作前或在早期发作期间(例如在自身免疫疾病的初始迹象和症状时)将治疗有效量的本文所述剂给药至个体。治疗性的治疗涉及在疾病的诊断和发展之后将治疗有效量的本文所述剂给药至个体。因而，在另一方面，提供在有需要的个体中治疗疾病的方法。所述方法包括向个体给药有效量的本文所提供的细胞穿透缀合物(包括其实施方案)，由此在所述个体中治疗疾病。

在实施方案中，所述方法包括向个体给药第二治疗剂。在实施方案中，所述疾病选自以下：自身免疫疾病、发育障碍、炎症性疾病、代谢失调、心血管疾病、肝病、肠疾病、感染性疾病、内分泌疾病、神经障碍和癌症。在实施方案中，所述疾病是癌症。在实施方案中，所述癌症是B细胞淋巴瘤。在实施方案中，所述缀合物的非细胞穿透蛋白结合细胞内靶标，并且所述细胞内靶标是STAT3、输出蛋白7、或Src。在实施方案中，所述缀合物的非细胞穿透蛋白结合细胞内靶标，并且所述细胞内靶标是磷酸化的Src。在实施方案中，所述缀合物的非细胞穿透蛋白是特异性结合STAT3的抗体，且第二非细胞穿透蛋白是特异性结合输出蛋白7的抗体。在实施方案中，所述缀合物的非细胞穿透蛋白是抗体，且所述细胞内靶标是STAT3。

在所提供的治疗方法中，可以使用适宜于所治疗疾病的另外的治疗剂。因而，在一些实施方案中，所提供的治疗方法还包括向所述个体给药第二治疗剂。适宜的另外的治疗剂包括但不限于，选自以下的治疗剂：镇痛剂、麻醉剂、兴奋剂、皮质类固醇、抗胆碱剂、抗胆碱酯酶、抗痉挛剂、抗肿瘤剂、别构抑制剂、蛋白同化甾类、抗风湿剂、心理治疗剂、神经阻断剂、抗炎症剂、抗蠕虫剂、抗生素、抗凝血剂、抗真菌剂、抗组胺剂、抗毒蕈碱剂、抗分枝杆菌剂、抗原生动物剂、抗病毒剂、多巴胺类、血液学剂、免疫学剂、毒蕈碱类、蛋白酶抑制剂、维生素、生长因子、和激素。对于剂和剂量的选择可以由本领域技术人员基于给定的所治疗疾病来容易地确定。

剂或组合物的组合可以伴随地(例如作为混合物)、分别但同时地(例如经分别的静脉内线路)、或顺次地(例如首先给药一种剂随后再给药第二种剂)给药。因而，术语组合是用于指两种或更多种剂或组合物的伴随、同时或顺次给药。治疗的进程最好是在个体的基础上进行确定(取决于个体的特定特征和所选治疗的类型)。治疗(如本文所述的那些)，可以每日、每日两次、每双周、每月或任何治疗有效的适用基础来给药至个体。治疗可以单独给药、或者与本文公开的或本领域已知的任何其它治疗组合给药。另外的治疗可以与第一种治疗同时、在不同时间、或者以完全不同的治疗方案(例如第一种治疗可以是每天的，而另外的治疗是每周的)来给药。

根据本发明提供的方法，个体给药了有效量的一或多种本文所提供的剂。术语有效量和有效剂量可互换使用。术语有效量定义为产生期望的生理应答(例如炎症的减少)所必须的任何量。对于给药剂的有效量和方案可以由本领域技术人员依照经验来确定。用于给药的剂量范围为足够大以产生期望效果(其中疾病或病征的一或多种症状受到影响，例如减少了或延缓了)的那些。剂量不应太大以致于引起重大的不良副作用，如不期望的交叉反应、过敏反应等。一般来说，剂量会随着年龄、条件、性别、疾病类型、疾病或病征的程度、给药途径、或方案中是否包括其它药物而变化，并且其可以由本领域技术人员确定。剂量可以由个别医师在任何禁忌症的事件中进行调整。剂量可以变化并且可以每天以一或多个剂量来给药，并进行一或若干天。对于给定类别的药物产品适宜的剂量可以在文献中找到指引。例如，对于给定的参数，有效量会显示出至少5％、10％、15％、20％、25％、40％、50％、60％、75％、80％、90％、或至少100％的增加或减少。效力可以表示为“-倍”增加或减少。例如，治疗有效量可以具有对照至少1.2-倍、1.5-倍、2-倍、5-倍、或更多倍的作用。确切的剂量和制剂会取决于治疗的目标，并且会可以由本领域技术人员使用已知的技术来确定(参见，例如Lieberman,Pharmaceutical Dosage Forms(vols.1-3,1992)；Lloyd,The Art,Science and Technology of Pharmaceutical Compounding(1999)；Remington:TheScience and Practice of Pharmacy,20th Edition,Gennaro,Editor(2003)，和Pickar,Dosage Calculations(1999))。

公开了材料、组合物和组分，其可用于所公开的方法和组合物、可以与所公开的方法和组合物联合使用、可用于制备所公开的方法和组合物、或者是所公开的方法和组合物的产品。本文公开了这些和其它材料，并且应理解当公开了这些材料的组合、亚集、相互作用、分组等的时候，而各种个别的和集体的组合中每个的具体提及以及这些化合物的排序可能并未明确公开，但是每个都具体在本文中得到涵盖和描述。例如，如果公开了并讨论了方法，并且讨论了可以对一些分子包括所述方法所进行的一些修改，那么所述方法的每种组合和排序、以及可能的修改都具体得到了涵盖，除非有明确的相反陈述。同样地，这些的任何亚集或组合也都具体得到涵盖和描述。此概念适用于本公开的所有方面，包括但不限于使用所公开组合物的方法中的步骤。因而，如果有许多可以进行的额外的步骤，那么应理解这些额外的步骤的每一个都可以与所公开方法的任何具体的方法步骤或方法步骤得组合一起进行，并且每个此种组合或组合的亚集都具体得到涵盖且应认为是得到了公开。

术语"个体(subject)"、"患者"、"个体(individual)"等并不是要进行限制，并且一般可以互换。也就是说，描述为“患者”的个体并不必然具有给定的疾病，而是可能仅仅在寻求医疗建议。

如本文所用，"治疗"病况、疾病或病征(或与病况、疾病或病征相关联的症状)、或者病况、疾病或病征(或与病况、疾病或病征相关联的症状)"的治疗"，是指用于获得有益的或期望的结果(包括临床结果)的手段。有益的或期望的临床结果可包括但不限于，一或多种症状或病况的缓解或改善，病况、病征或疾病程度的减轻，病况、病征或疾病状态的稳定，防止病况、病征或疾病的发展，防止病况、病征或疾病的扩散，病况、病征或疾病进展的延迟或减缓，病况、病征或疾病发作的延迟或减缓，病况、病征或疾病状态的改善或缓和，以及减轻(部分或全部)。"治疗"也可以意味着延长个体的存活超过缺乏该治疗时的预期。"治疗"也可以意味着抑制病况、病征或疾病的进展，暂时减缓病况、病征或疾病的进展，但在某些情形中，其涉及永久地停止病况、病征或疾病的进展。如本文所用，术语治疗是指减少特征在于表达蛋白酶的疾病或病征的一或多种症状的作用、或者减少特征在于表达蛋白酶的疾病或病征的症状的方法。因而在所公开的方法中，治疗可以是指以确立的疾病、病征、或者疾病或病征的症状的严重性降低了10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、或100％。例如，如果与对照相比，个体中疾病的一或多种症状减少了10％，则认为用于治疗疾病的方法是治疗。因而所述减少可以是与天然或对照水平相比，减少了10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、或10％至100％的任何百分比的减少。应理解治疗并不必然是指疾病、病况、或者疾病或病况的症状的治愈或完全消除。另外，如本文所用，对于降低、减少、或抑制的提及，其包括与对照水平相比10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多的变化，并且此类术语可以包括但并不必然包括完全的去除。

如本文所用，术语“药学上可接受的”与“生理学可接受的”和“药理学可接受的”作为同义词使用。药物组合物通常会包含用于缓冲和储藏中防腐的剂，并且可以包括用于适宜的递送的缓冲液和载体(取决于给药途径)。

"有效量"是足以实现一定目标的量(例如实现其所给药的作用、治疗疾病、降低酶活性、减少疾病或病征的一或多种症状)。"有效量"的实例是足以促成疾病的一或多种症状的治疗、预防或减少的量，其也称作"治疗有效量"。一或多种症状的"减少"(以及此短语语法上的等同)意味着症状严重性或频率的降低、或症状的去除。药物的"预防有效量"是当药物给药至个体时，会具有所要的预防作用的量，例如，防止或延迟损伤、疾病、病理或病况的发作(或复发)，或者减少损伤、疾病、病理或病况(或其症状)发作(或复发)的可能性。通过给药一个剂量并不必然发生完全的预防效果，并且可能仅在给药一系列剂量之后才可发生。因而，预防有效量可以在一或多次给药中进行给药。如本文所用，"活性降低量"是指降低酶或蛋白的活性(相对于缺乏拮抗剂时)所需拮抗剂的量。如本文所用，"功能干扰量"是指干扰酶或蛋白的功能(相对于缺乏拮抗剂时)所需拮抗剂的量。对于给定类别的药物产品适宜的剂量可以在文献中找到指引。例如，对于给定的参数，有效将会显示出至少5％、10％、15％、20％、25％、40％、50％、60％、75％、80％、90％、或至少100％的增加或减少。效力可以表示为“-倍”增加或减少。例如，治疗有效量可以具有对照至少1.2-倍、1.5-倍、2-倍、5-倍、或更多倍的作用。确切的量会取决于治疗的目的，并且会可以由本领域技术人员使用已知技术来确定(参见，例如Lieberman,Pharmaceutical Dosage Forms(vols.1-3,1992)；Lloyd,The Art,Science and Technology of Pharmaceutical Compounding(1999)；Pickar,Dosage Calculations(1999)；和Remington:The Science and Practiceof Pharmacy,20th Edition,2003,Gennaro,Ed.,Lippincott,Williams&Wilkins)。

如本文所用，术语"给药"意味着向个体口服给药、作为栓剂给药、局部接触、静脉内给药、腹膜内给药、肌肉内给药、病灶内给药、鞘内给药、鼻内给药或皮下给药、或者植入缓释装置(例如，微量渗透泵)。给药是通过任何途径，包括肠胃外和穿粘膜的途径(例如，口腔颊、舌下、腭部、齿龈、鼻、阴道、直肠、或经皮)。肠胃外给药包括，例如，静脉内、肌内、微动脉内、皮内、皮下、腹膜内、心室内、以及颅内。其它递送模式包括但不限于，使用脂质体制剂、静脉输注、透皮贴片等。对于"共给药"，其意味着本文所述的组合物与一或多种另外的疗法给药的同时、紧接在其之前、或紧接在其之后，来进行给药，所述一或多种另外的疗法例如为癌症疗法如化疗、激素疗法、放疗、或免疫疗法。本发明的化合物可以单独给药，或者可以共给药至患者。共给药意味着包括个别地或者组合地(超过一种化合物)同时或顺次给药化合物。因而，当期望的时候，制剂也可以是与其它活性物质组合的(例如以降低代谢降解)。本发明组合物可以通过经皮递送，通过外用途径递送，配制为敷药棒、溶液、混悬剂、乳剂、凝胶、霜剂、软膏、糊剂、胶状物、涂料、散剂、和气雾剂。

本发明组合物可以另外包括成分来提供持续释放和/或舒适性。此类成分包括高分子量的、阴离子拟粘膜聚合物(anionic mucomimetic polymer)，凝胶多糖和细碎的药物载体底物。这些成分在美国专利号4,911,920；5,403,841；5,212,162；和4,861,760中有大量详细讨论。这些专利的全部内容对于所有目的都以其整体援引加入本文。本发明组合物也可以作为微球递送，以用于在身体内缓慢释放。例如，微球可以经含药微球(其缓慢皮下释放)的皮内注射来给药(参见Rao,J.Biomater Sci.Polym.Ed.7:623-645,1995；可以作为生物可降解和可注射凝胶制剂(参见，例如Gao Pharm.Res.12:857-863,1995)；或者，可以作为微球用于口服给药(参见，例如Eyles,J.Pharm.Pharmacol.49:669-674,1997)。在实施方案中，本发明组合物的制剂可以通过使用与细胞膜融合或被细胞吞噬的脂质体来递送，也即，通过使用连接至脂质体(其结合至导致细胞吞噬的表面膜蛋白受体)的受体配体。通过使用脂质体，特别是当脂质体表面携带有特异于靶细胞的受体配体的时候、又或者优先涉及具体的器官的时候，则可以在体内将本发明组合物的递送集中在靶细胞中(参见，例如Al-Muhammed,J.Microencapsul.13:293-306,1996；Chonn,Curr.Opin.Biotechnol.6:698-708,1995；Ostro,Am.J.Hosp.Pharm.46:1576-1587,1989)。本发明组合物也可以作为纳米颗粒来进行递送。

利用本文提供的教导，可以计划有效的预防性或治疗性的治疗方案，其不会引起严重的毒性并且治疗临床症状依然有效(通过特定患者证明)。此计划应当涉及对活性化合物的仔细选择，这是通过考虑以下因素，如化合物效力、相对生物利用度、患者体重、不良副作用的存在和严重性、优选的给药模式、以及选定剂的毒性特征。

"抗癌剂"依照其惯常含义使用，并且是指具有抗肿瘤特性或抑制细胞生长或增殖能力的组合物(例如化合物、药物、拮抗剂、抑制剂、调节剂)。在实施方案中，抗癌剂是化疗剂。在实施方案中，抗癌剂是本文鉴定的在治疗癌症的方法中有作用的物质。在实施方案中，抗癌剂是由FDA(或美国之外其它国家类似的监管机构)所许可的用于治疗癌症的物质。

实施方案

实施方案P1.细胞穿透缀合物，其具有式：

其中

Ar

Ar

L

P是非细胞穿透蛋白；

n是1或2；且

z

实施方案P2.实施方案P1的细胞穿透缀合物，其中Ar

实施方案P3.实施方案P1或P2的细胞穿透缀合物，其中该细胞穿透缀合物具有式：

其中

R

X是-F、-Cl、-Br或-I。

实施方案P4.实施方案P3的细胞穿透缀合物，其中R

实施方案P5.实施方案P3或P4的细胞穿透缀合物，其中R

实施方案P6.实施方案P3-P5之一的细胞穿透缀合物，其中R

实施方案P7.实施方案P3-P6之一的细胞穿透缀合物，其中R

实施方案P8.实施方案P1-P7之一的细胞穿透缀合物，其中L

实施方案P9.实施方案P1-P8之一的细胞穿透缀合物，其中L

实施方案P10.实施方案P1-P7之一的细胞穿透缀合物，其中L

-L

其中L

L

实施方案P11.实施方案P1-P10之一的细胞穿透缀合物，其中L

实施方案P12.实施方案P1至P11之一的细胞穿透缀合物，其中L

实施方案P13.实施方案P1-P12之一的细胞穿透缀合物，其中n是1。

实施方案P14.实施方案P1-P12之一的细胞穿透缀合物，其中z

实施方案P15.实施方案P1-P14之一的细胞穿透缀合物，其中所述非细胞穿透蛋白具有超过25kD的分子量。

实施方案P16.实施方案P1-P15之一的细胞穿透缀合物，其中所述非细胞穿透蛋白具有25至750kD的分子量。

实施方案P17.实施方案P1-P15之一的细胞穿透缀合物，其中所述非细胞穿透蛋白是抗体。

实施方案P18.实施方案P17的细胞穿透缀合物，其中所述抗体是IgG抗体。

实施方案P19.实施方案P17的细胞穿透缀合物，其中所述抗体是IgA、IgM、IgD或IgE抗体。

实施方案P20.实施方案P17的细胞穿透缀合物，其中所述抗体是Fv片段。

实施方案P21.实施方案P17至P19之一的细胞穿透缀合物，其中所述抗体是人源化的抗体。

实施方案P22.实施方案P1-P21之一的细胞穿透缀合物，其中所述非细胞穿透蛋白结合细胞内靶标。

实施方案P23.实施方案P22的细胞穿透缀合物，其中所述细胞内靶标是选自以下的疾病的靶标：自身免疫疾病、炎症性疾病、代谢失调、发育障碍、心血管疾病、肝病、肠疾病、感染性疾病、内分泌疾病、神经障碍和癌症。

实施方案P24.实施方案P22或P23的细胞穿透缀合物，其中所述细胞内靶标是信号分子或转录因子。

实施方案P25.实施方案P24的细胞穿透缀合物，其中所述信号分子是磷酸酶或激酶。

实施方案P26.实施方案P22的细胞穿透缀合物，其中所述细胞内靶标是癌症靶标。

实施方案P27.实施方案P26的细胞穿透缀合物，其中所述细胞内靶标选自STAT3、输出蛋白7和Src。

实施方案P28.实施方案P27的细胞穿透缀合物，其中所述细胞内靶标是STAT3。

实施方案P29.实施方案P1-P28之一的细胞穿透缀合物，其中所述非细胞穿透蛋白还包含可检测部分。

实施方案P30.实施方案P1-P29之一的细胞穿透缀合物，其中所述缀合物结合至细胞内靶标。

实施方案P31.细胞，其包含实施方案P1-P30之一的细胞穿透缀合物。

实施方案P32.药物组合物，其包含实施方案P1-P30之一所述的细胞穿透缀合物和药学上可接受的载体。

实施方案P33.将非细胞穿透蛋白递送至细胞中的方法，其包括使细胞与实施方案P1-P30之一的细胞穿透缀合物接触。

实施方案P34.实施方案P33的方法，其中所述非细胞穿透蛋白结合细胞质中的核蛋白，由此形成非细胞穿透蛋白-核蛋白复合物。

实施方案P35.实施方案P34的方法，其中所述非细胞穿透蛋白-核蛋白复合物不能进入所述细胞的核内。

实施方案P36.在有需要的个体中治疗疾病的方法，所述方法包括向个体给药有效量的实施方案P1-P30之一所述的细胞穿透缀合物，由此在所述个体中治疗所述疾病。

实施方案P37.实施方案P36的方法，其还包括向所述个体给药第二治疗剂。

实施方案P38.实施方案P36或P37的方法，其中所述疾病选自自身免疫疾病、发育障碍、炎症性疾病、代谢失调、心血管疾病、肝病、肠疾病、感染性疾病、内分泌疾病、神经障碍和癌症。

实施方案P39.实施方案P38的方法，其中所述疾病是癌症。

实施方案P40.实施方案P39的方法，其中所述缀合物的所述非细胞穿透蛋白结合细胞内靶标并且所述细胞内靶标是STAT3、输出蛋白7或Src。

实施方案P41.实施方案P39的方法，其中所述缀合物的所述非细胞穿透蛋白结合细胞内靶标并且所述细胞内靶标是磷酸化的Src。

实施方案P42.实施方案P39的方法，其中所述缀合物的所述非细胞穿透蛋白是抗体并且其中所述细胞内靶标是STAT3。

附加实施方案

实施方案1.细胞穿透缀合物，其具有式：

其中

Ar

Ar

L

P是非细胞穿透蛋白；

n是1或2；且

z

实施方案2.实施方案1的细胞穿透缀合物，其中Ar

实施方案3.实施方案1或2的细胞穿透缀合物，其中所述细胞穿透缀合物具有式：

其中

R

X是-F、-Cl、-Br或-I。

实施方案4.实施方案3的细胞穿透缀合物，其中R

实施方案5.实施方案3或4的细胞穿透缀合物，其中R

实施方案6.实施方案3-5之一的细胞穿透缀合物，其中R

实施方案7.实施方案3-6之一的细胞穿透缀合物，其中R

实施方案8.实施方案1-7之一的细胞穿透缀合物，其中L

实施方案9.实施方案1-8之一的细胞穿透缀合物，其中L

实施方案10.实施方案1-7之一的细胞穿透缀合物，其中L

-L

其中L

L

实施方案11.实施方案1-10之一的细胞穿透缀合物，其中L

实施方案12.实施方案1至11之一的细胞穿透缀合物，其中L

实施方案13.实施方案1-12之一的细胞穿透缀合物，其中n是1。

实施方案14.实施方案1-12之一的细胞穿透缀合物，其中z

实施方案15.实施方案1-14之一的细胞穿透缀合物，其中所述非细胞穿透蛋白具有超过25kD的分子量。

实施方案16.实施方案1-15之一的细胞穿透缀合物，其中所述非细胞穿透蛋白具有25至750kD的分子量。

实施方案17.实施方案1-16之一的细胞穿透缀合物，其中所述非细胞穿透蛋白是抗体。

实施方案18.实施方案17的细胞穿透缀合物，其中所述抗体是IgG抗体。

实施方案19.实施方案17的细胞穿透缀合物，其中所述抗体是IgA、IgM、IgD或IgE抗体。

实施方案20.实施方案17的细胞穿透缀合物，其中所述抗体是Fv片段。

实施方案21.实施方案17至19之一的细胞穿透缀合物，其中所述抗体是人源化的抗体。

实施方案22.实施方案1-21之一的细胞穿透缀合物，其中所述非细胞穿透蛋白结合细胞内靶标。

实施方案23.实施方案22的细胞穿透缀合物，其中所述细胞内靶标是选自以下的疾病的靶标：自身免疫疾病、炎症性疾病、代谢失调、发育障碍、心血管疾病、肝病、肠疾病、感染性疾病、内分泌疾病、神经障碍和癌症。

实施方案24.实施方案22或23的细胞穿透缀合物，其中所述细胞内靶标是信号分子或转录因子。

实施方案25.实施方案24的细胞穿透缀合物，其中所述信号分子是磷酸酶或激酶。

实施方案26.实施方案22的细胞穿透缀合物，其中所述细胞内靶标是癌症靶标。

实施方案27.实施方案26的细胞穿透缀合物，其中所述细胞内靶标选自STAT3、输出蛋白7和Src。

实施方案28.实施方案27的细胞穿透缀合物，其中所述细胞内靶标是STAT3。

实施方案29.实施方案1-28之一的细胞穿透缀合物，其中所述非细胞穿透蛋白还包含可检测部分。

实施方案30.实施方案1-29之一的细胞穿透缀合物，其中所述缀合物结合至细胞内靶标。

实施方案31.细胞，其包含实施方案1-30之一的细胞穿透缀合物。

实施方案32.药物组合物，其包含实施方案1-30之一所述的细胞穿透缀合物和药学上可接受的载体。

实施方案33.将非细胞穿透蛋白递送至细胞中的方法，其包括使细胞与实施方案1-30之一的细胞穿透缀合物接触。

实施方案34.实施方案33的方法，其中所述非细胞穿透蛋白结合细胞质中的核蛋白，由此形成非细胞穿透蛋白-核蛋白复合物。

实施方案35.实施方案34的方法，其中所述非细胞穿透蛋白-核蛋白复合物不能进入细胞的核内。

实施方案36.在有需要的个体中治疗疾病的方法，所述方法包括向个体给药有效量的实施方案1-30之一所述的细胞穿透缀合物，由此在所述个体中治疗所述疾病。

实施方案37.实施方案36的方法，其还包括向所述个体给药第二治疗剂。

实施方案38.实施方案36或37的方法，其中所述疾病选自自身免疫疾病、发育障碍、炎症性疾病、代谢失调、心血管疾病、肝病、肠疾病、感染性疾病、内分泌疾病、神经障碍和癌症。

实施方案39.实施方案38的方法，其中所述疾病是癌症。

实施方案40.实施方案39的方法，其中所述癌症是B细胞淋巴瘤。

实施方案41.实施方案39的方法，其中所述缀合物的所述非细胞穿透蛋白结合细胞内靶标并且所述细胞内靶标是STAT3、输出蛋白7或Src。

实施方案42.实施方案39的方法，其中所述缀合物的所述非细胞穿透蛋白结合细胞内靶标并且所述细胞内靶标是磷酸化的Src。

实施方案43.实施方案39的方法，其中所述缀合物的所述非细胞穿透蛋白是抗体并且其中所述细胞内靶标是STAT3。

VIII.实施例

提供以下实施例以说明但不限制请求保护的发明。

A.

在实施方案中，抗-Stat3抗体共价结合至花青3，其中未结合的花青3具有式：

在实施方案中，抗-Stat3抗体共价结合至花青5，其中未结合的花青5具有式：

一旦抗-Stat3抗体共价结合至花青3(红外光谱中红色放射)或花青5(红外光谱中“蓝色”放射)，将花青修饰的抗体在非还原条件下进行SDS-PAGE以评估抗体与花青的成功的共价结合。有利的是花青3和5在人眼可见的光谱中具有荧光活性，从而可以通过目视检查看到荧光IgG蛋白而无需进一步的实验分析(图1)。

将纯化的抗-Stat3-Cy3和抗-Stat3-Cy5进行基于细胞的试验以评估细胞内定位和细胞穿透效力(图2A-2B)。作为抗-Stat3-Cy3的阴性对照，将抗-Stat3抗体共价结合至磺酸基Cy3以形成抗-Stat3-磺酸基Cy3。用作抗-Stat3-Cy5的阴性对照，将抗-Stat3抗体共价结合至磺酸基Cy5，其中未结合的磺酸基Cy5具有式：

将纯化的抗-Stat3-Cy3和抗-Stat3-Cy5以及他们的对照抗-Stat3-磺酸基Cy3和抗-Stat3-磺酸基Cy5与人B细胞淋巴瘤Ly3细胞温浴以测试其对细胞内靶标Stat3的识别。一旦分离了全细胞裂解物并清除了细胞碎片，进行另外的免疫沉淀以测定花青-Stat3-抗体的靶标识别(图3)。

在实施方案中，抗-Stat3抗体共价结合至Cy7，其中未结合的Cy7具有式：

在实施方案中，抗-Stat3抗体共价结合至磺酸基Cy7，其中未结合的磺酸基Cy7具有式：

使用抗-Stat3-Cy7抗体在人U251胶质瘤细胞中测试严格的细胞内抗原STAT3识别。抗-Stat3-磺酸基Cy7抗体用作阴性对照。细胞在10mg/ml温浴2小时。一旦分离了全细胞裂解物并清除了细胞碎片，进行另外的免疫沉淀以测定花青-Stat3-抗体的靶标识别(图4)。