一株多粘类芽孢杆菌LCP-01及其与胆汁酸复配的复合菌剂与应用

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株多粘类芽孢杆菌LCP-01及其与胆汁酸复配的复合菌剂与应用。

技术背景

我国人口数量庞大，因肉鸭的吃法多样，肉质紧实深受大家的喜爱，因此我国对于肉鸭的需求量也比较大，进而肉鸭养殖成为养殖业中的热门。而且肉鸭养殖周期短，一年可多次养殖，也使得肉鸭的逐渐走向了规模化养殖。

但目前，肉鸭的养殖存在几种风险，一是肉鸭的销售渠道比较窄，容易因市场造成较大的波动，二是肉鸭的疫病比较多，如果防治不及时，可能造成大面积的死亡。例如，在肉鸭养殖初期，幼龄小鸭会因为其自身肠道发育的不完善而产生代谢问题，或在养殖过程中因养殖环境、非常规原料过多等原因，造成肉鸭体内霉菌毒素超标，再结合环境等应激而导致发病。因此，为了提高促进肉鸭的健康生长，开发一种高效的、对肉鸭无害的天然制剂是非常有必要的。

发明内容

本发明提供了一株多粘类芽孢杆菌LCP-01及其与胆汁酸复配的复合菌剂与应用。本发明在土壤中筛选到一株具有抑菌作用，并促进肉鸭生长的多粘类芽孢杆菌LCP-01，其与胆汁酸复配而成的复合菌剂，能够清除肉鸭苗的母源毒素，保护肉鸭的肝肠，提高肉鸭的出栏体重。

为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案予以实现：

本发明提供了一株多粘类芽孢杆菌LCP-01，其分类名为多粘类芽孢杆菌Paenibacillus polymyxa，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.20819。

进一步的，所述多粘类芽孢杆菌LCP-01的菌落呈圆形、类圆形或椭圆形，米黄色，直径3-5mm，扁平，表面光滑无光泽，不透明，边缘呈不规则的波状且具半透明镶边。

本发明还提供了含有所述的多粘类芽孢杆菌LCP-01的复合菌剂。

进一步的，所述多粘类芽孢杆菌LCP-01菌粉和胆汁酸。

进一步的，所述多粘类芽孢杆菌LCP-01菌粉和胆汁酸的体积质量比为1∶1-3。

进一步的，所述复合菌剂中多粘类芽孢杆菌LCP-01的菌含量不少于5×10

本发明还提供了所述的复合菌剂在用于制备肉鸭养殖的饲料添加剂中的应用。

进一步的，所述复合菌剂的应用方法为：所述复合菌剂的应用方法为：将所述复合菌剂溶于水中制成复合菌液，再将复合菌液每天连续8小时给肉鸭饮用，饮用7-10天；或将所述复合菌剂混合均匀到肉鸭的养殖饲料中，连续投喂10-40天，每天投喂3次。

进一步的，所述复合菌剂与水的质量体积比为1∶8-12。

进一步的，所述复合菌剂在肉鸭养殖饲料中的添加量为0.5-1kg/t饲料。

本发明与现有技术相比，具有以下优点和有益效果：

本发明从土壤中筛选出一株多粘类芽孢杆菌LCP-01，其具有很好的抗菌作用，并且能够促进肉鸭的生长，该菌也不会对动物人体造成伤害，也不会影响环境。本发明将多粘类芽孢杆菌LCP-01发酵制备成菌粉，并与胆汁酸以优化的比例复配制备得到复合菌剂，该复合菌剂成分天然，无毒副作用，不会影响肉鸭的正常生长，且能够帮助肉鸭苗清除母源毒素，保护肉鸭的肝肠，促进肉鸭肠道内消化液的分泌和肠道完整性功能，进而使得肉鸭生长速度变快，活力更强，长得更健壮，还可以提高肉鸭出栏体重，降低料肉比，提高肉鸭的养殖效益。

附图说明

图1为所述多粘类芽孢杆菌LCP-01在营养琼脂培养基上的菌落图片。

图2为复合菌剂对肉鸭肝肠的影响结果；左侧图为对照组肉鸭肝肠，右侧图为试验组虾肉鸭肝肠。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明的技术方案做进一步详细的说明。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1：多粘类芽孢杆菌LCP-01的筛选和鉴定

以土壤为样品，将土壤和无菌水混匀混匀制成土壤的10

如图1所示，所述菌株LCP-01在营养琼脂培养基的菌落呈圆形、类圆形或椭圆形，米黄色，直径3-5mm，扁平，表面光滑无光泽，不透明，边缘呈不规则的波状且具半透明镶边。

提取所述菌株LCP-01的基因组DNA，并以此为模板，使用16S rRNA通用引物进行PCR扩增，获得16S rRNA扩增序列后测序，然后将该序列进行Blast比对，结果显示菌株LCP-01与GenBank基因库中的多粘类芽孢杆菌Paenibacilluspolymyxa同源性最高，因此判定菌株LCP-01为多粘类芽孢杆菌。

将筛选到的多粘类芽孢杆菌LCP-01进行菌种保藏，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)；地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；保藏日期：2020年09月25日；多粘类芽孢杆菌Paenibacillus polymyxa的保藏编号为CGMCC No.20819。

实施例2：复合菌剂的制备

1、胆汁酸的制备

所述胆汁酸的制备工艺步骤如下：

(1)皂化：将粉碎过40目筛的1kg猪胆粉加入反应釜中，再加入质量浓度为10％的氢氧化钠溶液10L，加热搅拌至沸腾，并保持沸腾状态搅拌14h，然后将反应生成的皂化液冷却至固液分层，去除上清液，剩余固体即为胆汁酸皂化品；

(2)脱色：向胆汁酸皂化品中加6L水，加热至80℃使胆汁酸皂化品完全溶解，然后将其打入脱色罐中，加入300mL双氧水搅拌均匀后，常温反应24h，然后将反应溶液过滤至酸化槽中，得到滤液；

(3)酸化：将滤液冷却至室温，缓慢加入10％盐酸溶液，边加入边搅拌，待溶液pH值在3时停止加酸，离心过滤得到白色固形物；

(4)纯化：将白色固形物不断加水冲洗，将附着在白色固形物表面的水溶性杂质去除，待滤出的水检测呈中性后结束水洗；将离心过滤后的白色固形物放入烘箱中，100℃干燥至水分少于10％，得胆汁酸粗品；

(5)重结晶：将胆汁酸粗品投入萃取罐中，加入胆汁酸粗品重量10倍体积的乙酸乙酯搅拌至完全溶解，再加入0.08g无水硫酸钠脱水，过滤收集过滤液，将过滤液进行减压浓缩并回收乙酸乙酯，得到液体胆汁酸；

(6)干燥：将液体胆汁酸放入烘箱，在100℃下干燥至水分不超过1％时，得到成品胆汁酸。

成品胆汁酸中包含了78.6％的猪胆酸和猪去氧胆酸以及20.0％的鹅去氧胆酸。

2、多粘类芽孢杆菌LCP-01菌粉的制备

将多粘类芽孢杆菌LCP-01在营养液体培养基(牛肉膏3.0g，蛋白胨10.0g，NaCl5.0g，蒸馏水1.0L，pH 7.0)中，37℃培养36h后，再将得到的菌悬液利用真空冷冻干燥法制备成多粘类芽孢杆菌LCP-01菌粉，保证菌粉的菌含量不少于1×10

3、复合菌剂的制备

将制得的胆汁酸与多粘类芽孢杆菌LCP-01菌粉以1∶1-3的质量比均匀混合，即可得到含多粘类芽孢杆菌的复合菌剂；在使用时，复合菌剂中粘类芽孢杆菌LCP-01的菌含量不少于5×10

实施例3

浙江某肉鸭养殖场来苗1万只，随机选取其中400只肉鸡进行复合菌剂效果试验。将实施例2中制备的500g复合菌剂均匀溶于4500g水中制成复合菌液，其中200只肉鸭每天连续8小时饮用该复合菌液；另外200只肉鸭作为对照组，每天相同时间饮用等量的清水，其他均按照常规养殖进行，连续饮用7天后，观察两组肉鸭的生长情况。

结果如表1显示，饮用复合菌液的肉鸭与对照组相比，7天后平均体重增幅更多，且肉鸭患肝炎率更少，活力更强。此时的肉鸭处于转肝期，容易因进食缺乏消化液带来的肝肠压力，而且此时肉鸭体内还会残留母源毒素，而使用了本发明复合菌剂能够促进脂溶性物质吸收，并且帮助稚嫩的肉鸭排出母源毒素，保护肉鸭的肝肠胆，促进消化液的分泌和肠道完整性功能，进而使得肉鸭生长速度变快，活力更强，长得更健壮。

表1复合菌剂对肉鸭体重和肝炎发病的影响

实施例4

山东某养殖场，养殖肉鸭1万只，养殖期间，肉鸭出现生长发育缓慢、呆立，采食徘徊不前，甚至死亡的问题，经兽医解剖发现肉鸭肝脏出现肿大，且肝脏和肠道颜色变深，有的表面出现很小的灰白色坏死点，诊断是由肉鸭代谢出现问题而导致的花肝、脾脏坏死等。

将本发明的复合菌剂以1kg的质量比拌于1吨肉鸭饲料中，每天3次喂养患病的肉鸭，连续喂养10天后，肉鸭的食欲增加，骨架拉长速度变快，如图2所示，肉鸭的肝脏的肿大减小，并且肝脏和肠道颜色恢复正常，说明本发明的复合菌剂能够保护肉鸭的肝脏和肠道，恢复肉鸭的正常代谢和功能。本发明的复合菌剂能够促进肉鸭胆汁的分泌，使胆道畅通，消除胆汁淤滞，起到利胆作用，且促进肉鸭体内毒素的排出，减轻肝脏的负担。

实施例5

在某肉鸭企业，选择肉鸭品种樱桃谷7954只，随机分为两组，一组为试验组3009只，二组为对照组4945只；选择四系肉鸭9302只，随机分为两组，一组为试验组3240只，二组为对照组6064只。试验组在饲料中添加500g/t复合菌剂，对照组不添加。现场饲养管理和饲料管理按照本场常规要求进行，饲养过程中做好数据记录。结果由表2结果可以看出，樱桃谷和四系肉鸭出栏体重试验比对照组分别高88g/只和21g/只；料肉比分别比对照组低0.27％和2.84％，说明肉鸭饲料中添加复合菌剂能够提高肉鸭的出栏体重，降低料肉比，进而提高肉鸭的养殖效益。

表2复合菌剂对肉鸭生产性能影响

备注：肉鸭校正：日龄*7.5＝当日采食量，饲料转化率2.5计。第41天采食：41*7.5＝307.5g＝0.3075kg；第41天增重：0.03975/2.5＝0.123kg。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。