中间球海胆精子的低温保存液及保存方法

技术领域

本发明属于水产动物精子低温保存技术领域，尤其涉及一种中间球海胆精子的低温保存液及保存方法。

背景技术

中间球海胆(strongylocentrotus intermedius)，隶属于棘皮动物门、海胆纲、正形目、球海胆科，是由日本引进的优良品种，该种海胆是唯一可进行全人工育苗的海胆种类，也是我国海胆养殖的主要种类。

精子的保存技术对水产动物的增养殖、良种培育、资源保护以及生物学研究都有重要意义。在海胆的种质保存和良种繁育工作中，由于需从不同地区引种或培育新种，不同地区的海胆繁殖期不尽相同，长途运输又易导致种海胆死亡，且雌雄亲海胆性腺发育不同步，因此在科研与生产实践中需要对精液进行保存。精子保存技术通常为低温保存和超低温冻存，低温保存原理是低温能够降低精子的代谢活动，从而将精子寿命延长几天或十几天；超低温冻存则是使精子处于-196℃条件下，其代谢与运动完全停止，生命以静止的状态得以长期保存。相较于冷冻保存而言，精子的低温(4℃)保存具有操作简单、保存条件易满足和重复性强的优点，也能够防止速冻导致细胞内冰晶的形成导致超微结构受损。目前，国内有关于水产经济鱼类精子低温保存的研究较多，而棘皮动物尤其是中间球海胆精子低温保存技术尚未见报道。

发明内容

本发明要解决的技术问题在于提供一种中间球海胆精子的低温保存液及保存方法，使用所述低温保存液及方法能够提高中间球海胆精子的存活时间，为中间球海胆种质资源进行开发和改良、遗传育种研究提供技术支持。

为解决上述技术问题本发明采用如下技术方案：

一种中间球海胆精子的低温保存液，所述低温保存液的成分及质量百分比为氟苯尼考0.02g/L，多西环素0.02g/L，氯化钠26.72g/L，氯化钾0.72g/L，氯化钙1.15g/L，碳酸氢钠0.20g/L，氯化镁2.26g/L；

精子激活剂的成分及质量百分比为0.7％NaCl、0.05％KCl、0.2％CaCl

本发明还提供利用上述低温保存液保存中间球海胆精子的方法，所述方法包括如下步骤：

1)收集中间球海胆精液于离心管中，在4℃、1000r/min下离心五分钟，弃上清液；

2)使用20μg/ml的低温保存液将离心后的海胆精浆稀释到原来体积的100倍，然后在4℃、1000r/min条件下离心5min，弃上清液；加入与上清液同等体积的20μg/ml的低温保存液，再次离心；反复操作2～3次；

3)最后一次离心操作完成，加入与上清液同体积的20μg/ml的低温保存液后，在离心管上标记好日期，即可放入4℃冰箱中进行精子保存；

4)保存后使用时，将低温保存液与精子混合摇匀，并加入相同体积的精子激活剂，激活精子并使之与新鲜卵子结合完成受精。

进一步，所述步骤1)在中间球海胆的围口膜附近注射0.5mol/L的KCL溶液后，轻轻擦拭海胆表面，以刺激中间球海胆排出精液。

进一步，在收集中间球海胆精子时，由于产精时间不同，将先一步收集好的精浆保存在14℃条件下，避免其活力降低。

进一步，所述的精子激活剂的成分及质量百分比为0.7％NaCl、0.05％KCl、0.2％CaCl

进一步，使用的低温保存液保存的中间球海胆精子在30天内使用。

进一步，所述步骤3)精子保存过程中应避免震动，保存精子的离心管需保持密封。

进一步，步骤4)低温保存液与精子与卵子的数量比在10000：1精卵比下仍能够达到95.67％的受精率。

具体实施方式

下面通过实施例来对本发明的技术方案做进一步解释，但本发明的保护范围不受实施例任何形式上的限制。

实施例1

1.中间球海胆精子的低温保存液的筛选

1.1.精子保存液制备和保存：

无菌海水准备，取天然海水经0.2μm微孔滤膜过滤后，保存于灭菌过的锥形瓶中备用。

低温保存液准备，称量低温保存液试剂置于无菌海水中，配置成20μg/ml的低温保存液，使用磁力搅拌器混合均匀后，经0.2μm微孔滤膜过滤，在低温冰箱中4℃保存。

低温保存液A：过滤海水作为对照组；

低温保存液B1：氟苯尼考0.04g/L，氯化钠26.72g/L，氯化钾0.72g/L，氯化钙1.15g/L，碳酸氢钠0.20g/L，氯化镁2.26g/L

低温保存液B2：氟苯尼考0.02g/L，氯化钠26.72g/L，氯化钾0.72g/L，氯化钙1.15g/L，碳酸氢钠0.20g/L，氯化镁2.26g/L

低温保存液B3：氟苯尼考0.01g/L，氯化钠26.72g/L，氯化钾0.72g/L，氯化钙1.15g/L，碳酸氢钠0.20g/L，氯化镁2.26g/L

低温保存液C1：多西环素0.04g/L，氯化钠26.72g/L，氯化钾0.72g/L，氯化钙1.15g/L，碳酸氢钠0.20g/L，氯化镁2.26g/L

低温保存液C2：多西环素0.02g/L，氯化钠26.72g/L，氯化钾0.72g/L，氯化钙1.15g/L，碳酸氢钠0.20g/L，氯化镁2.26g/L

低温保存液C3多西环素0.01g/L，氯化钠26.72g/L，氯化钾0.72g/L，氯化钙1.15g/L，碳酸氢钠0.20g/L，氯化镁2.26g/L

低温保存液D1：氟苯尼考0.02g/L，多西环素0.02g/L，氯化钠26.72g/L，氯化钾0.72g/L，氯化钙1.15g/L，碳酸氢钠0.20g/L，氯化镁2.26g/L

低温保存液D2：氟苯尼考0.01g/L，多西环素0.01g/L，氯化钠26.72g/L，氯化钾0.72g/L，氯化钙1.15g/L，碳酸氢钠0.20g/L，氯化镁2.26g/L

低温保存液D3：氟苯尼考0.005g/L，多西环素0.005g/L，氯化钠26.72g/L，氯化钾0.72g/L，氯化钙1.15g/L，碳酸氢钠0.20g/L，氯化镁2.26g/L

精子激活剂的成分及质量百分比为0.7％NaCl、0.05％KCl、0.2％CaCl

1.2.精子活力观察

取少量精液与天然海水均匀混合后，立即在显微镜下观察精子的状态，以精子摆动的频率、运动的速度以及方向等作为指标来评价精子的活力。精子活力与授精能力呈正相关，精子活力越高受精能力越强。将精子用5g/L的台盼蓝溶液在室温下染色15min，在显微镜的镜子下观察精子死亡率。死亡精子的顶体部或核体部呈蓝色，活精子不着色。每次统计200个精子，重复3次。计算精子死亡率:

精子死亡率(％)＝(染色精子数/总精子数)×100％。

精子存活率(％)＝1-精子死亡率％

将激活后的精子与新鲜卵子混合受精，确定精卵比，每次统计100个卵子，重复3次，计算其受精率。受精率以发育至原肠胚的卵子数占全部统计数的百分比来表示。上述试验选取新鲜精子的存活率均在90％以上。

3.数据分析

用SPSS 18.0软件对实验结果进行数据分析，使用单因素方差分析进行分析，若差异有统计学意义，则进行事后比较，方差齐使用SNK法，方差不齐使用Duncan's法，P<0.05为差异有统计学意义。

结果显示，保存液A为过滤海水对照组，精子在7d时存活率大幅降低，而以B、C、D为保护液的实验组仍能够使大多数精子存活。经过30d的保存期过后，各组别的精子成活如表1所示：D1保存液效果最佳，B2次之，其余保存液内精子几乎全部死亡。

表1 100倍稀释4℃低温保存条件下的海胆精子成活率

标志不同字母表示差异有统计学意义(P<0.05)，标志相同字母表示差异无统计学意义(P>0.05)

4.人工授精效果验证

4℃低温保存30天后，将D1保存液中的海胆精子与保存液充分混合，并加入相同体积的精子激活剂激活精子，将其与中间球海胆成熟卵子结合，并以新鲜海胆精子与中间球海胆成熟卵子结合作对照，记录在不同精卵比下的受精率，实验结果见表2：精卵数量比在10000：1条件下能够使将95.67％的卵子受精并发育至囊胚期，即足量保存精液的受精效果可以达到新鲜精子水平。

表2 不同条件保存下的海胆精子受精率

通过上述精子低温保存方式与添加不同抗生素保存液的保存效果显示，显示D1保存条件具有较好的保存效果。通过长达30天的低温保存下，在10000：1精卵比下仍能够达到95.67％的受精率。

实施例2

(1)无菌海水准备：取经沉淀过滤的天然海水，通过0.2μm微孔滤膜进行细菌过滤，经高温蒸汽灭菌锅灭菌，保存于1000ml锥形瓶中，并使用锡箔纸封口。

(2)中间球海胆精子的低温保存液准备：使用电子天平准确称量药剂，将其倒入1000ml无菌海水中，低温保存液的成分及质量百分比为氟苯尼考0.02g/L，多西环素0.02g/L，氯化钠26.72g/L，氯化钾0.72g/L，氯化钙1.15g/L，碳酸氢钠0.20g/L，氯化镁2.26g/L。所有成分均使用磁力搅拌器与海水混合均匀后，经0.2μm微孔滤膜过滤，在低温冰箱中4℃保存。

(3)取健康且性腺发育良好的中间球海胆，向其围口膜注射0.5ml/LKCL溶液1-2ml，用吸水纸将海胆表面擦干，倒置于培养皿中。待海胆产精后，用巴斯德吸管采集精液于5ml离心管中，暂存于冰块中保持低温。

(4)待精液全部收集完成后，置于离心机，在4℃、1000r/min条件下离心五分钟，弃上清液。

(5)使用1000μL移液枪取10μL离心后的海胆精浆于1mL离心管中，再向其中加入990μL精子保存液，反复吹打混匀。在4℃、1000r/min条件下离心五分钟，弃上清液，反复操作三次。

(6)最后一次离心操作后，取与上清液体积相同的精子低温保存液加入离心管，使其达到1ml离心管刻度线，并保存在4℃低温冰箱中，即可完成中间球海胆精子低温保存操作，保存过程中应避免震动，保存精子的离心管需保持密封。

(7)使用时，将精子保存液与精子混合摇匀，并加入相同体积的精子激活剂，此时显微镜下观察，精子运动有活力即为激活成功，此时应尽快使之与新鲜卵子结合完成受精。

4℃保存30d后，取上述保存液保存的海胆精液，经精子激活剂激活后加入新鲜卵子中，并统计海胆卵子的受精率。结果表明，经保存的海胆精子具有受精能力，加入足量的精子可使卵子的受精率达到95.67％，并能正常发育至囊胚期。