一种溶菌酶蛋白质变性过程的监测方法

技术领域

本发明属于生物细胞分子监测技术领域，尤其涉及一种溶菌酶蛋白质变性过程的监测方法。

背景技术

蛋白质是生命的物质基础，是生命活动的主要承担者。蛋白质作为生命信息的表达载体,其功能很大程度上取决于它的三维空间结构。蛋白质只有通过正确地折叠形成固有的三维空间结构，才能保持正常的生理活性，并在生命体中发挥其正常的生物学功能。若蛋白质发生错误折叠、展开或异常聚集，会降低或改变其生物学功能，导致阿尔兹海默症、帕金森症、亨廷顿氏舞蹈症等神经退行性疾病以及癌症的发生，对生命健康构成了严重的威胁。所以，解析蛋白质折叠过程已成为生命科学研究中最具有挑战性的课题之一。蛋白质折叠过程是将氨基酸链折叠形成特定的空间结构，从展开态到折叠态是一个多步转变的过程。因此，深入了解蛋白质的折叠机理，对于探索蛋白质错误折叠的致病机制和治疗方法具有重要的指导作用，对于临床医学有较高应用价值。

溶菌酶是由129个氨基酸残基组成的小尺寸的球形蛋白分子，分子中含有4对二硫键，分子结构较为稳定。它广泛存在于人的体液及组织中，具有抗菌、消炎和抗病毒等作用。溶菌酶在药物传递、肿瘤标志物研究等方面有重要的应用，同时它还是基因工程、细胞工程中细胞融合操作必不可少的工具酶。研究溶菌酶的折叠，对于保持溶菌酶活性，维持溶菌酶稳定性和包涵体蛋白质折叠复性都具有重要的指导意义。目前，监测溶菌酶分子折叠过程和研究溶菌酶变性机理的方法有示差扫描热量法、液相色谱法、荧光光谱法、傅里叶红外光谱法、核磁共振光谱法、拉曼光谱法、小角X射线散射、圆二色谱法以及分子动力学模拟，然而，上述方法仪器价格昂贵，实验操作复杂，又受限于时间及空间分辨率。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供一种溶菌酶蛋白质变性过程的监测方法，所述监测方法包括以下基本步骤：

步骤一：电解池的构建：采用两电极体系电解池系统，两个电极腔体中均加入100mM KCl溶液作为支持电解质，两支Ag/AgCl电极分别对称地插入两个电极腔体中，并且将两个电极腔体用含有一个锥形纳米通道的聚对苯二甲酸乙二醇酯膜隔开，且两个电极腔体仅用纳米通道相连通，其中纳米通道的小口端一侧作为顺式腔，大口端一侧作为反式腔；

步骤二：溶菌酶蛋白分子折叠过程检测：将未变性或不同变性条件下的溶菌酶溶液加入到电解池的反式腔中，施加+1000mV的跨膜电压，驱动溶菌酶分子迁移通过纳米通道,并采用膜片钳放大器测量并同步采集不同折叠态的溶菌酶分子迁移通过锥形纳米通道的电流信号数据；

步骤三：数据处理：使用Clampfit和origin软件对上述电流信号数据的脉冲频率、振幅、滞留时间及事件间隔进行统计；

步骤四：溶菌酶蛋白分子变性前后脉冲信号对比分析：通过对比变性前后脉冲信号的频率、振幅、滞留时间及事件间隔信息的变化，可判断蛋白质分子是否变性、变性的比例以及蛋白质的复性能力，同时，可以依据变性前后脉冲形态变化，推演蛋白质分子的折叠方式，进而解析蛋白质折叠过程。

优选的，所述聚对苯二甲酸乙二醇酯膜的厚度为12μm。

优选的，所述纳米通道的小口端尺寸控制在5-8nm，纳米通道的大口端尺寸控制在390-410nm。

优选的，所述KCl溶液中包含10mM的Tris-HCl，且所述KCl溶液的pH值为7.0。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

(1)本发明采用锥形聚合物纳米通道为电化学传感器，有效地提高了溶菌酶蛋白质变性过程的监测的灵敏度，可在单分子水平上实现溶菌酶蛋白质分子变性过程的超灵敏检测分析。

(2)本发明得到的电流信号数据对比明显、便于识别分析，可同时获取包括蛋白质分子是否变性、变性的比例以及蛋白质是否具有复性能力之类的多重信息。

(3)本发明制样简单，操作便捷，数据信息重现性好，成本较低，易于实现动态实时监测。

附图说明

图1为本发明的实施例中变性前折叠态溶菌酶蛋白分子迁移通过锥形纳米通道对应的脉冲信号图；

图2为本发明的实施例在3M盐酸胍变性剂中折叠态溶菌酶蛋白分子迁移通过锥形纳米通道对应的脉冲信号图；

图3为本发明的实施例在6M盐酸胍变性条件下展开态的溶菌酶蛋白分子对应的脉冲信号图。

具体实施方式

以下结合附图对本发明做进一步描述：

实施例：

本发明提供一种溶菌酶蛋白质变性过程的监测方法，其特征在于，所述监测方法包括以下基本步骤：

步骤一：电解池的构建：采用两电极体系电解池系统，两个电极腔体中均加入100mM KCl溶液作为支持电解质，所述KCl溶液中包含10mM的Tris-HCl，且所述KCl溶液的pH值为7.0，两支Ag/AgCl电极分别对称地插入两个电极腔体中，并且将两个电极腔体用含有一个锥形纳米通道的聚对苯二甲酸乙二醇酯膜隔开，所述聚对苯二甲酸乙二醇酯膜的厚度为12μm，且两个电极腔体仅用纳米通道相连通，其中纳米通道的小口端一侧作为顺式腔，所述纳米通道的小口端尺寸控制在6nm，大口端一侧作为反式腔，所述纳米通道的大口端尺寸控制在390nm；

步骤二：溶菌酶蛋白分子折叠过程检测：

1、溶菌酶蛋白分子正常样品的获取：将溶菌酶分子溶解于水中，配制浓度为0.10mg/mL的溶菌酶分子水溶液；

2、溶菌酶蛋白分子化学变性样品的获取：分别采用浓度为3M和6M的盐酸胍溶解稀释0.10mg/mL溶菌酶分子至0.01mg/mL，其中变性时间为8h；

再将未变性或不同变性条件下的溶菌酶溶液加入到电解池的反式腔中，施加+1000mV的跨膜电压，驱动溶菌酶分子迁移通过纳米通道,并采用膜片钳放大器测量并同步采集不同折叠态的溶菌酶分子迁移通过锥形纳米通道的电流信号数据，其中采样频率为20kHz，滤波器频率为5kHz。

步骤三：数据处理：使用Clampfit和origin软件对上述电流信号数据的脉冲频率、振幅、滞留时间及事件间隔进行统计；

步骤四：溶菌酶蛋白分子变性前后脉冲信号对比分析：通过对比变性前后脉冲信号的频率、振幅、滞留时间及事件间隔信息的变化，可判断蛋白质分子是否变性、变性的比例以及蛋白质的复性能力，同时，可以依据变性前后脉冲形态变化，推演蛋白质分子的折叠方式，进而解析蛋白质折叠过程。

如附图1所示，折叠态溶菌酶蛋白分子所对应的脉冲信号，其形态为在电流基线上出现的电流下降之后电流又迅速上升的两相脉冲。

如附图2所示，在3M盐酸胍变性条件下所监测到的折叠中间态溶菌酶蛋白分子所对应的脉冲信号，相比变性前的脉冲信号，尽管它仍然是一个双相脉冲，但其电流下降部分和电流上升部分的形态已发生明显改变，其原因在于，在变性过程中，溶菌酶分子的形态和表面电荷的分布均已发生了显著变化。

如附图3所示，在6M盐酸胍变性条件下，展开态的溶菌酶蛋白分子所对应的脉冲信号，这时已变成一系列仅有电流下降的单相脉冲，通过统计分析脉冲信号的形态和频率，可分析溶菌酶蛋白分子是否变性以及变性的比例多少，通过监测整个变性过程脉冲信号的变化可以推演蛋白质分子的折叠方式和变化途径，蛋白质变性后，通过某些药物或者改变相应环境条件可能使蛋白质折叠结构复原，通过本方法也可以观察外界干预对变性后蛋白质分子折叠复性能力的影响。

以上结果表明，本发明所提供的方法可用于蛋白质错误折叠致病机制的研究以及蛋白质相关疾病药物的研发。

利用本发明所述的技术方案，或本领域的技术人员在本发明技术方案的启发下，设计出类似的技术方案，而达到上述技术效果的，均是落入本发明的保护范围。