一种靶向敲除斑点叉尾鮰zbtb38基因的sgRNA序列及其筛选方法

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体涉及斑点叉尾鮰突变体制备技术领域，尤其涉及一种靶向敲除斑点叉尾鮰zbtb38基因的sgRNA序列及其筛选方法。

背景技术

CRISPR/Cas系统是存在于细菌和古细菌中的获得性免疫防御系统，当细菌遭受病毒的侵染时，会在自身基因组里留下外源基因片段作为“记忆抗体”以识别再次侵入的病毒。CRISPR/Cas系统由CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromicrepeats)元件和编码一系列Cas蛋白的基因组成，其中CRISPR元件由多个相同的重复序列(repeat)与不同的间隔序列(spacer)交替排列组成。CRISPR/Cas9是CRISPR/Cas系统中应用最为广泛的一种类型，Cas蛋白由单一的Cas9蛋白构成，Cas9蛋白主要功能的发挥依赖于：(1)Cas9在细菌内需要crRNA和反式激活RNA(trans-activating crRNA,tracrRNA)共同引导其靶向目标序列，现基因工程中已将两个RNA分子进行适当改造，序列整合为一条单链引导RNA(single guide RNA,sgRNA)；(2)Cas9特异性识别靶向DNA 3’端的3～7bp的碱基对，即PAM(protospacer adjacent motif)区。现由于gRNA设计合成方便，且此系统对靶基因敲除效率的高效性，使得CRISPR/Cas9系统被广泛应用于细胞与动物模型的遗传学改造。

ZBTB38又被称为CIBZ、ZNF921或PPP1R171，属于ZBTB蛋白家族(zinc finger andBTB domain-containing protein family)成员，其N端含有1个115个氨基酸左右的BTB结构域，C端都含有多个锌指结构域。该蛋白家族C端的锌指结构具有识别固定的顺式作用元件或与DNA甲基化位点结合的作用，N端的BTB结构域一般介导同源或异源蛋白-蛋白二聚体或多聚体的形成，改变染色质结构，从而起到基因转录调控的作用。ZBTB蛋白家族中部分成员已证实在精子发生、性别决定、神经和器官发育、肿瘤发生等多种生物学过程扮演重要角色。在前期研究中发现斑点叉尾鮰zbtb38基因上存在多个性别连锁SNP位点，猜测其在斑点叉尾鮰性别决定过程扮演一定角色。如何利用CRISPR/Cas9对斑点斑点叉尾鮰zbtb38基因进行有效编辑是需要解决的技术难题。

发明内容

发明目的：为了克服现有技术中存在的不足，本发明提供一种靶向敲除斑点叉尾鮰zbtb38基因的sgRNA序列及其筛选方法。

技术方案：为实现上述目的，本发明提供一种靶向敲除斑点叉尾鮰zbtb38基因的sgRNA序列的筛选方法，其包括，设计CRISPR序列，所述CRISPR序列如序列SEQ NO.1～SEQNO.8所示；用所述CRISPR序列制备含目标基因片段的PCR扩增产物，所述目标基因片段如序列SEQ NO.9所示；将所述含目标基因片段的PCR扩增产物与载体连接、转化后筛选阳性转化子，经克隆摇菌并抽提出包含目的基因的质粒；根据设计的CRISPR序列，采用体外转录方法制备sgRNA；将所述sgRNA、所述包含目的基因的质粒和Cas9蛋白显微注射斑马鱼受精卵，以斑马鱼受精卵作为反应器筛选编辑斑点叉尾鮰zbtb38基因的sgRNA序列。

优选的，所述CRISPR序列位于zbtb38基因外显子393bp之前。

优选的，所述sgRNA，其序列包括如序列SEQ NO.21～SEQ NO.28中所示的一种或几种。

优选的，所述用体外转录方法制备sgRNA，其使用的正向引物序列包括序列SEQNO.12～SEQ NO.19所示中的一种或几种。

优选的，所述经克隆摇菌并抽提出包含目的基因的质粒，其使用的引物序列包括序列SEQ NO.10、SEQ NO.11所示中的一种或几种。

优选的，所述经克隆摇菌并抽提出包含目的基因的质粒，其使用的载体为pGEM-TEasy载体。

优选的，所述显微注射，其使用的所述sgRNA在注射液中的终浓度为100ng/μL，Cas9蛋白的终浓度为250ng/μL。

作为本发明的另一方面，本发明提供一种用于靶向敲除斑点叉尾鮰zbtb38基因的序列，其包括，CRISPR序列，如序列SEQ NO.7所示；引物，包括序列SEQ NO.10～SEQ NO.20中所示的一种或几种；sgRNA序列，包括序列SEQ NO.21～SEQ NO.28中所示的一种或几种。

本发明的有益效果如下：

本发明首次在斑点叉尾鮰中筛选出有效编辑zbtb38基因的sgRNA序列，根据筛选出的CRISPR序列制备的sgRNA特异性强且敲除效率高，敲除流程简单快捷，可为后续解析斑点叉尾鮰zbtb38基因功能提供动物材料。

附图说明

图1为扩增的目标基因组DNA片段电泳结果图；

图2为纯化后sgRNA体外转录模板的电泳结果图；

图3为体外合成制备的sgRNA质量电泳鉴定结果图；

图4为zbtb38基因敲除效率鉴定的PCR扩增产物电泳结果图；

图5为突变检测的CRISPR2典型峰；

图6为突变检测的CRISPR7典型峰。

具体实施方式

下面结合附图对本发明作更进一步的说明。

实施例1：CRISPR序列设计

1、设计打靶位点

从NCBI数据库获取斑点叉尾鮰zbtb38基因组序列，本次实验将在外显子393bp之前的区域上设计8个CRISPR序列，并进行活性CRISPR筛选。zbtb38基因的CRISPR设计采用人工方法，其候选脱靶预测采用将CRISPR序列与GenBank中的斑点叉尾鮰基因组序列通过BLAST比对的方法实现。

表1基于zbtb38基因设计的CRISPR序列

2、PCR扩增目标基因组DNA片段

1)目标基因组序列如SEQ NO.9：

ATGATGGTGGTCCATTCCAGCTGCAATGGGATGATGGACAACTTGCACCCCCACACTGTTCTTTCTCGACTCAGCGAACAACGATCACTTGGCCTGTTCTGTGATGTTACCATTGTTGTGGAGGACATCAAATTCCGTGCTCACAGAAATGTCTTGGCTGCGACTAGCGGATATTTCCGCAACGCTTTCACAGCCTCTGAGACTTGTGGTTCCAGCCAGGTGCTGGAAATTCCAGATCTCAAGTCAGAGGTGTTTGCCAGCATCCTTAATTTCATTTACTCCTCCAAAGTGGATTTAGCAAGTAAAGGGGACAACAAGTCCTTAATAGCTGCAGGGAAAAGGTTAGGGATCCCCTTTCTTGAGAAACTTCTTGAGATTGAAAGGCAAGACTCT。

2)PCR扩增的引物设计

表2 zbtb38基因片段扩增引物

3)PCR反应体系及条件

PCR反应体系(40μL)为：2×Mastermix(诺唯赞)20μL、16μL的超纯水、1μL的正反向(zbtb38-F1、zbtb38-R1)引物(5μM)和2μL的斑点叉尾鮰目标基因组DNA模板。

PCR反应的条件为：96℃ 3min，35×(96℃ 30s,60℃ 30s,72℃ 30s)，72℃10min，4℃保存。

扩增的含目标基因DNA片段电泳结果图如图1所示。自左向右第2泳道为DNAMarker：从下向上依次为100bp、250bp、500bp、750bp、1000bp、2000bp、3000bp、5000bp；第1泳道为PCR外侧扩增产物。

4)PCR产物回收

将上述PCR产物利用无核酸酶污染的PCR clean up(Axygen)试剂盒进行回收。将38μL PCR外侧扩增产物与无核酸酶污染的Buffer PCR-A 114μL混合后，置于回收柱后12,000g，离心1min，弃去废液后，加入Buffer W2，12,000g，离心1min，弃去废液后，重复该步骤，弃去废液后，12,000g，空甩离心1min，最后加入回收溶剂为无核酸酶污染的DEPC水(南京尧顺禹生物公司)，回收体积均为30μL。

5)目标基因PCR扩增产物的连接

将回收的PCR扩增产物连接入pGEM-T Easy载体(5μL总体积的反应)，反应组成为：

反应时间为：室温孵育60min

6)转化

将上述5μL连接产物用50μL大肠杆菌DH5α感受态细胞(pfu≥108)进行转化。然后涂布于含氨苄(50μg/mL)的LB板，37℃下倒置培养过夜。

7)目标基因片段的重组子筛选

(1)PCR模板的快速制备：所涂平板，以10μL无菌枪头各随机挑选8个克隆。分别将其放入含20μL液态LB的PCR 8联管中，快速手工混匀，用作PCR的模板。

(2)PCR验证体系反应组成

反应体系一：

反应体系二：

(3)PCR反应条件：

95℃ 3min，35×(95℃ 30s,56℃ 30s,72℃ 40s)，72℃ 10min，4℃保存。

(4)转化子的测序

经过上述PCR验证，将阳性转化子经商业公司测序，测序引物T7，得到正确克隆3个，选取其中一个克隆摇菌并抽提出质粒(浓度224ng/μL,OD值：1.93)。

实施例2：sgRNA体外转录

1、sgRNA模板的制备(PCR法)

正向引物序列如下表2：

表3正向引物序列

注：下划线序列表示T7启动子。

反向引物R-Common：AAAAAAAGCACCGACTCGGTGCCAC，SEQ NO.20。

PCR反应体系(80μL)：2×Mastermix(诺唯赞)40μL、35μL的超纯水、2μL的正向(zbtb38-sgRNA(1～8)-F分别和R-Common)引物(5μM)和1μL的pYSY-sgRNA质粒(南京尧顺禹生物公司,10ng/μL)。

PCR反应条件：95℃ 3min，35×(95℃ 30s，56℃ 30s，72℃ 30s)，72℃ 10min，4℃保存。

2、sgRNA体外转录模板的纯化

将上述PCR产物利用无核酸酶污染的PCR clean up(Axygen)试剂盒进行回收。回收溶剂为无核酸酶污染的超纯水，回收体积均为14μL。分别取1μL进行琼脂糖凝胶(1％)电泳，检测回收质量。纯化后sgRNA体外转录模板的电泳结果图如图2。自左向右第9泳道为DNAMarker：从下向上依次为100bp、250bp、500bp、750bp、1000bp、2000bp、3000bp、5000bp；第1～8泳道为zbtb38-sgRNA1～8纯化后的sgRNA体外转录模板。

3、sgRNA的体外转录

1)体外转录过程

将得到的纯化后sgRNA体外转录模板用T7 RNA聚合酶进行体外转录。使用RNA体外转录试剂盒(MAXIscript SP6/T7,Ambion,USA)，按试剂盒说明书要求依次加入10×Transcription Buffer 2μL、10mM ATP 1μL、10mM CTP 1μL、10mM GTP 1μL、10mM UTP 1μL、T7 RNA polymerase mix 2μL、模板DNA 12μL，轻弹混匀离心后，37℃水浴1h。

加入DNase I(Ambion,USA)1μL，37℃水浴15min，以去除模板。之后加入80μL DEPC水扩大体积至100μL，同时加入10μL无核酸酶3M醋酸钠(pH 5.2)和3倍体积的无水乙醇(国产分析纯)，-80℃沉淀过夜。4℃ 12,000g离心20min，去除上清后，加入无核酸酶75％乙醇，4℃ 12,000g离心20min，去除上清后，沉淀在通风橱晾干，然后以12μL无核酸酶超纯水重悬后储存于-80℃冰箱备用。

2)sgRNA质量的电泳鉴定

分别取1μL进行琼脂糖凝胶电泳(1％)鉴定其完整性，结果如下：体外合成制备的sgRNA质量电泳鉴定结果图见图3。图中自左向右第9泳道为DNA Marker：从下向上依次为100bp、250bp、500bp、750bp、1000bp、2000bp、3000bp、5000bp；第1～8泳道依次为zbtb38-sgRNA1～8。

表4 sgRNA浓度测定结果

表5 sgRNA序列

实施例3：斑马鱼受精卵的显微注射

1、按常规方法收取斑马鱼受精卵。将上述sgRNA分为奇数组(1、3、5、7)和偶数(2、4、6、8)组(终浓度约为100ng/μL)分别和含斑点叉尾鮰zbtb38目标基因片段的质粒(终浓度约为50ng/μL)与Cas9蛋白(终浓度为200ng/μL)混合后，显微注入斑马鱼受精卵，注射量为1nL每胚胎。

2、斑马鱼胚胎DNA提取：待注射斑马鱼胚胎发育至24hpf时，奇偶数组各取16枚胚胎制备基因组DNA模板(共32枚胚胎样品)，使用《斑马鱼基因型鉴定试剂盒》制备基因组DNA模板，具体反应条件为：65℃ 30min,95℃ 5min,16℃ 1min，4℃保存。

3、PCR扩增反应体系(30μL)

PCR体系：2×Mastermix(Vazyme)15μL、11μL的超纯水、1μL的正反向(zbtb38-F1和zbtb38-R1)引物(5μM)、和2μL的由3.4.1制备好的基因组DNA模板。

PCR反应条件为：95℃ 3min，30×(95℃ 30s,60℃ 30s,72℃ 30s)，72℃ 10min，4℃保存。

4、PCR产物电泳结果

分别取2μL进行琼脂糖凝胶电泳(1％)鉴定其完整性。斑点叉尾鮰zbtb38基因敲除效率鉴定的PCR扩增产物电泳结果图如图4。第9泳道为DNA Marker：从下向上依次为100bp、250bp、500bp、750bp、1000bp、2000bp、3000bp、5000bp。第一行为斑点叉尾鮰zbtb38基因偶数组sgRNA活性鉴定的PCR扩增产物电泳结果；第二行为斑点叉尾鮰zbtb38基因奇数组sgRNA活性鉴定的PCR扩增产物电泳结果。

上述PCR产物经过电泳确认条带大小后，将阳性扩增产物(选送8个)送商业公司测序，测序引物zbtb38-R1，测序结果如下：

sgRNA偶数(2、4、6、8)组：共反馈8个测序结果，都没有出现明显的Indel突变，典型峰图如图5框内指示CRISPR2)；sgRNA奇数组(1、3、5、7)组：共反馈8个zbtb38-R1测序结果，其中有4个测序结果在CRISPR7附近出现明显的Indel突变，典型峰如图6所示。

将验证出有编辑活性的sgRNA7对应的所有测序结果与野生型序列进行相互比较后(https://tide.deskgen.com/)，得到相对的活性数值，取平均值，得到最终的活性率为3.562％。综合以上实验结果，以斑马鱼胚胎为反应器，体外转录合成的sgRNA7对斑点叉尾鮰zbtb38基因可进行有效编辑，活性为3.562％。建议基因组编辑工具使用的浓度建议为：sgRNA的工作浓度(在注射液中的终浓度)为100ng/μL、Cas9蛋白的终浓度为250ng/μL。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 江苏省淡水水产研究所

<120> 一种靶向敲除斑点叉尾鮰zbtb38基因的sgRNA序列及其筛选方法

<141> 2020-10-16

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