提高蚕丝纤维力学性能的方法及其产品

文献发布时间：2023-06-19 09:54:18

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及提高蚕丝纤维力学性能的方法，还涉及由该方法制得的产品。

背景技术

蚕丝在纺织业，医药、生物技术及军事等领域一直受到广泛的关注，蚕丝纤维的成纤机制以及如何获得更多更好的蚕丝，改造蚕丝性能一直是蚕业科学研究的热点。与其他材料相比，蚕丝的韧性和延展性较好，但是强度和刚性却较弱。正是由于蚕丝存在这些力学性能上的缺陷，使得蚕丝的应用范围和价值受到一定的限制。对蚕丝力学性能的改良成为了目前拓展蚕丝应用，提升蚕丝价值，振兴蚕桑产业的重中之重。目前研究者通过添食外源物，人工拉丝，蚕丝后处理，以及将蜘蛛丝蛋白基因转入家蚕中等方法，取得了一些进展。但不管是通过人工拉丝还是对蚕丝进行各种处理，这些方法都耗时耗力并且成本较大，并不适合大规模应用于产业。为了获得能够稳定遗传的高性能蚕丝纤维家蚕品系，需要从源头产出高性能蚕丝，而丝纤维的形成是纺丝管道内的生理生化环境和物理因素共同决定的，已有通过在家蚕丝腺过表达钙离子蛋白，提升钙离子含量改变了蚕丝性能，但其力学性能的提升并不高，因此，需要能更加高效提高蚕丝纤维力学性能的方法。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的之一在于提供提高蚕丝纤维力学性能的方法；本发明的目的之二在于提供由所述的方法获得的蚕丝；本发明的目的之三在于提供家蚕铁蛋白亚基在提高蚕丝纤维力学性能中的应用。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

1、提高蚕丝纤维力学性能的方法，通过在家蚕前部丝腺过量表达家蚕铁蛋白亚基，结茧，获得力学性能好的蚕丝；所述家蚕铁蛋白亚基的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；或SEQ ID NO.1所示核苷酸经过一个或几个碱基的取代和/或缺失和/或添加且表达具有与家蚕铁蛋白亚基相同功能的核苷酸序列。

优选的，所述在家蚕前部丝腺过量表达家蚕铁蛋白亚基的方法是使用家蚕表皮蛋白BmCP231启动子调控家蚕铁蛋白亚基表达。

优选的，在家蚕前部丝腺过量表达家蚕铁蛋白亚基的方法是将含有由家蚕表皮蛋白BmCP231启动子调控家蚕铁蛋白亚基的转基因表达载体，注射蚕卵，培养并筛选转基因家蚕，结茧获得力学性能好的蚕丝。

优选的，所述转基因表达载体由家蚕表皮蛋白BmCP231启动子、家蚕铁蛋白亚基和SV40终止信号组成的表达框连入穿梭载体pSLfa1180fa的多克隆位点中获得重组载体，再用Asc I酶切重组载体，然后连入同样经Asc I酶切的pBac[3xP3-dsRed Pafm]载体获得。

优选的，所述注射蚕卵的方法为：将摩尔比为1:1转基因表达载体与辅助载体pHA3PIG混合，在显微镜下，使用显注射仪将质粒混合液注入早期胚胎中。

优选的，所述培养并筛选转基因家蚕是将注射后的蚕卵封口后，催青至孵化，孵化的幼虫饲育至成虫后进行自交得到G1代蚕卵，筛选家蚕胚胎的眼睛和神经中表达红色荧光的转基因阳性个体，即获得转基因家蚕。

2、由所述的方法获得的蚕丝。

优选的，所述蚕丝中含有过表达的家蚕铁蛋白亚基。

优选的，所述蚕丝断裂应变提高至少43％，断裂强度提高至少57.8％；杨氏模量提高至少48.9％，韧性提高至少95％。

3、家蚕铁蛋白亚基在提高蚕丝纤维力学性能中的应用，所述家蚕铁蛋白亚基的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；或SEQ ID NO.1所示核苷酸经过一个或几个碱基的取代和/或缺失和/或添加且表达具有与家蚕铁蛋白亚基相同功能的核苷酸序列。

本发明的有益效果在于：本发明公开了一种制备新型的蚕丝纤维的方法，通过在家蚕前部丝腺表达家蚕铁蛋白亚基，对获得的转基因家蚕的蚕丝进行力学拉伸测试发现转基因蚕丝纤维的强度、延展性和韧性均得到提高，表明获得的蚕丝力学性能得到显著提高。

本发明研究过程采用过表达载体显微注射到家蚕蚕卵，对该转基因家蚕阳性个体的研究发现，所述的家蚕铁蛋白亚基在mRNA和蛋白水平上都得到了过量表达，利用同步辐射红外光谱分析发现转基因蚕丝二级结构含量发生变化。表明了家蚕铁蛋白亚基对丝纤维的形成有影响，因此可以将家蚕铁蛋白亚基用于提高蚕丝力学性能。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：

图1为转基因家蚕的获得(A表示转基因载体示意图；B表示荧光筛选图)。

图2为转基因家蚕的荧光定量PCR检测。

图3为转基因家蚕的Western Blot检测。

图4为茧丝的力学性能结果(A和B表示非转基因茧丝和转基因茧丝的原始应力应变曲线；C表示非转基因茧丝和转基因茧丝的应力应变平均曲线；D-G表示各项力学性能指标统计结果)。

图5为转基因家蚕茧丝的红外光谱扫描图(A表示非转基因茧丝和转基因茧丝红外扫描图；B和C表示非转基因茧丝和转基因茧丝酰胺I区域分峰图；D茧丝各二级结构含量结果)。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。

实施例中使用的家蚕品种为实用品种芙蓉，由中国西南大学家蚕基因资源库提供。

实施例1、家蚕铁蛋白亚基基因BGIBMGA008768的克隆

根据家蚕基因组数据库中BGIBMGA008768基因CDS序列(SEQ ID NO.1)，设计1对上下游引物。设计的引物委托生工生物工程(上海)有限公司进行合成。引物序列如下：

Bm-FerritinH MluI-F：5’-cgacgcgtatgagggctgttttctttgc-3’(SQE ID NO.2)(加粗字体部分为Mlu I酶切位点)；

Bm-FerritinH NotI-R：5’-atttgcggccgcttatacgttcaatccgagga-3’(SQE IDNO.3)(加粗字体部分为Not I酶切位点)。

以五龄第三天的芙蓉马氏管cDNA为模板，采用引物Bm-FerritinH MluI-F和Bm-FerritinH NotI-R扩增BGIBMGA008768的CDS片段。PCR反应条件为：98℃预变性30秒；然后98℃变性10秒，65℃退火30秒，72℃延伸30秒，共30个循环；最后72℃延伸2分钟。PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳分离，利用试剂盒切胶回收纯化目的片段，再克隆入载体pMD19-TSimple(TaKaRa)，获得重组载体pMD19-BGIBMGA008768。

实施例2、含有家蚕BGIBMGA008768基因的重组表达载体的构建

将重组载体pMD19-BGIBMGA008768用Mlu I和Not I双酶切，回收BGIBMGA008768CDS片段，再与同样经Mlu I和Not I双酶切的载体pSL[BmCP231-DsRed-SV40]进行连接(pSL[BmCP231-DsRed-SV40]为公开号为CN102604954A中pSL[含信号肽BmCP231-DsRed-SV40])，获得重组载体pSL[BmCP231-BGIBMGA008768-SV40]。所述载体pSL[BmCP231-DsRed-SV40]系参照文献方法(Horn and Wimmer,2000)，利用pSLfa1180fa克隆穿梭载体，构建而得，具体构建方法见中国专利ZL201210085897.3，其中含信号肽BmCP231的序列如SQE ID NO.8所示。

将重组载体pSL[BmCP231-BGIBMGA008768-SV40]用Asc I酶切，回收BmCP231-BGIBMGA008768-SV40片段，再与同样经Asc I酶切的载体pBac[3xP3-dsRed]进行连接，获得重组载体pBac[3xP3-dsRed，BmCP231-BGIBMGA008768-SV40]。所述载体pBac[3xP3-dsRed]系参照文献方法(Horn and Wimmer,2000)构建而得。

实施例3、在家蚕前部丝腺过量表达铁蛋白亚基的转基因家蚕的获得

将重组载体pBac[3xP3-dsRed，BmCP231-BGIBMGA008768-SV40]与编码piggyBac转座酶的转基因辅助载体pHA3PIG按照摩尔比1:1混合，通过显微注射仪注入实用性品种芙蓉(FR)的早期胚胎(产卵后2～4小时，G0代)中，注射后的蚕卵用无毒胶水封口，25℃催青至孵化，孵化的幼虫采用桑叶饲育，至成虫后进行自交制种，获得的卵期于第6-7天的蚕卵(G1代)在宏观体视荧光显微镜(Olympus MVX10)下利用波长为460～490nm的激发光检测红色荧光，筛选出在眼睛或神经特异激发红色荧光的转基因阳性个体，即获得过量表达铁蛋白亚基的转基因家蚕(图1)。

实施例4、新型蚕丝纤维的获得及检测

(1)转基因家蚕中铁蛋白亚基的分子检测：

分别取五龄第三天转基因家蚕和非转基因家蚕前部丝腺样品，在液氮中快速研磨并提取总RNA，反转录成cDNA，并采用BGIBMGA008768特异引物[Ferritin-qPCR-F：5'-cgatgctgcgactgaaga-3'(SQE ID NO.4)；Ferritin-qPCR-R：5'-ttgatgacctcccggatg-3'(SQE ID NO.5)；进行荧光定量PCR检测，以sw作为内参sw-F：5'-ttcgtactggctcttctcgt-3'(SQE ID NO.6)；sw-R：5'-caaagttgatagcaattccct-3'(SQE ID NO.7)，反应仪器为ABI7500Fast(美国)，反应条件为：95℃预变性30s，之后进行40个循环，每个循环为95℃变性3s，60℃退火30s，其中每个组织进行3次重复实验，收集目的基因Ct值和内参Ct mean进行数据分析，结果如图2所示。结果显示，BGIBMGA008768基因在转基因品系的前部丝腺中得到了过量表达。

分别取五龄第三天的转基因家蚕和非转基因家蚕的前部丝腺，在液氮中快速研磨溶于RIPA裂解液中，4℃放置1h，离心取上清，测定总蛋白浓度，再与5×加样缓冲液混合，37℃孵育30分钟，进行12％SDS-聚丙稀酰胺胶凝胶电泳，电泳完毕后，以Anti-BGIBMGA008768抗体为一抗、Tubulin抗体为内参照抗体进行Western blot分析，结果如图3所示。结果显示，铁蛋白亚基在转基因品系的前部丝腺成功过量表达。

(2)新型蚕丝纤维的获得及检测

对转基因家蚕和非转基因家蚕的蚕茧进行匀速缫丝，选取相同的区段(0-100m)，将一部分丝纤维固定在力学测试的模具上利用万能测试仪(岛津)进行拉伸试验。实验在25℃，60％空气湿度下进行，使用50N传感器，拉伸速度为1mm/min，记录拉伸时蚕丝的载荷及位移。另一部分丝纤维进行电镜扫描(日本电子)，并测量丝纤维的直径。利用以上数据绘制应力应变曲线，结果如图4。结果显示，在转基因品系中，蚕丝断裂应变为47.86％，断裂强度为540.19MPa；杨氏模量为5.66GPa，韧性为135.57MJm

另外，将非转基因茧丝和转基因茧丝脱胶烘干后进行同步红外光谱检测(ThermoScientific)，实验在22℃，46％空气湿度下进行，采用红外透射扫描，采集时间为51s，采集次数为256次。结果如图5，对红外谱图酰胺I(1600cm

以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。

序列表

<110> 西南大学

<120> 提高蚕丝纤维力学性能的方法及其产品

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 630

<212> DNA

<213> 家蚕(Bombyx mori L.)

<400> 1

atgagggctg ttttctttgc tgtcctcgga ctcgttgctg ccctagctcc tgccacagct 60

acacagtgtt acgtcagccc cgtcaccatc agggatgagt ggctcaccat ggagcagact 120

tgctacaaca tgatgaggaa acagatccag gaggaagtgg ccgcgtcaat ccagtactta 180

gccatggggg cttacttctc gatcgatacg gtgaaccgcc ccggcttcgc gaagctattc 240

ttcgatgctg cgactgaaga acgcgagcac gcgaccaagc tcattgacta cctgctcatg 300

aggggaaagc tgacaggctc cgtaaccgac ctcatcacgt acagggcccc cgcaaacacg 360

tcgtgggaga gcggcgcatc agccctcgag cacgccctca agctggagag tgacgtcacc 420

aacagcatcc gggaggtcat caagacctgc gagagcagct tcaacgacta ccacctggtc 480

gactatttgt ccggggaatt cctcgacgaa cagtacaagg gccaacgcga cctcgccggc 540

aaggcctcga ccctcaagaa gatgatggac aaacacgccg ccctcggaga gttcatcttc 600

gacaagaaac tcctcggatt gaacgtataa 630

<210> 2

<211> 28

<212> DNA