IRX4及其诱导剂在筛选/制备保护心脏的药物中的应用

技术领域

本发明属于基因的功能与应用领域，特别涉及一种IRX4及其诱导剂在筛选/制备保护心脏的药物中的应用。

背景技术

心肌肥厚是高血压，血管疾病和慢性心力衰竭等多种心血管疾病发生发展的共同病理过程，是心脏对压力或容积负荷增加，血管紧张素，生长因子以及激素等多种心血管刺激因素做出的代偿反应。长期的刺激会导致病理性心肌肥大，主要表现为心肌细胞体积增大、蛋白合成增多、细胞外基质增多，发生纤维化等特征，最终引发扩张性心肌病，室性心律失常，心肌缺血，心力衰竭甚至猝死等。心肌肥厚已成为心力衰竭等多种心血管疾病的独立危险因素及不良预后的信号，心肌肥厚继而导致的心力衰竭等心血管疾病是全世界死亡的主要原因。目前关于心肌肥厚的治疗可以延缓这些疾病的进展，但却不能逆转或阻止此类疾病的发生。研究心肌肥厚的发生发展机制，发现参与心肌肥厚的特异性因子及信号转导通路，探索新的治疗靶点，具有重要的理论与实践意义。

易洛魁家族同源盒4(iroquois homeobox 4，IRX4)，是易洛魁家族同源盒转录因子中的一员，主要在发育中心脏的心室表达，并在心脏发育过程中作为心室分化的重要中介。Irx4在各个心室区域表达同样丰富，且其表达在胚胎，新生儿和成年心脏中观察到的水平相同，其可用于专门标记心室祖细胞。在心室肌中，IRX4可与维生素D受体的异源二聚体(VDR)和维甲酸X受体(RXR)相互作用,调节其靶基因在心肌细胞中的表达。IRX4亦可通过激活心室肌球蛋白重链-1(VMHC1)基因，抑制心房肌球蛋白重链-1(AMHC1)表达，正向调节心室的特定基因表达。此外，研究表明，大鼠心室中大量的Irx4表达，与左心室壁的Irx5和Kv4.2水平之间呈负相关。Irx4抑制细胞中Irx5诱导的通道启动子活性的增加，当内源性Irx4表达被siRNA抑制时，Irx5会增加新生儿心肌细胞中的通道启动子活性。在小鼠中,Irx4基因的破坏导致心室特异性表达的肌球蛋白重链基因受到抑制，导致心室基因表达异常，从而诱导成年期心肌肥厚。在没有基因受Irx4控制的情况下，心室功能恶化，继而发生心肌病。Irx4虽不足以形成心室，但需要建立心室特异性基因表达程序的某些组件。

已有临床研究发现Irx4基因突变与肥厚性心肌病之间存在关联，在IRX4基因中发现了4种多态性，A381>G多态性AA基因型具有更高的最大左心室流出道梯度，和延长的校正QT离散度，表明IRX4可能会对间隔厚度产生调节作用，从而导致校正后的QT离散度增加和流出梯度增加。Ban,K等通过靶向IRX4分子的RNA，可以从胚胎干细胞中纯化心室心肌细胞，这表明基于分子信标的方法生成的同质且功能正常的心室心肌细胞可用于疾病的研究，药物发现和基于细胞的疗法。那么靶向心肌细胞IRX4，特异性过表达IRX4是否可以在病理性心肌肥厚中发挥作用，值得我们深入研究。

发明内容

为解决临床防治心肌肥厚疾病现有技术的缺陷和不足，本发明的目的在于确定IRX4基因的表达与心肌肥厚之间的相互关系，且发现了一种用于治疗心肌肥厚的靶基因IRX4的新用途，进而把IRX4基因应用于心肌肥厚相关疾病的治疗。本发明提供了一种IRX4及其诱导剂在筛选/制备保护心脏的药物中的应用，即IRX4在治疗心肌肥厚中的功能和应用，具体是在IRX4作为靶基因在制备抗心肌纤维化和/或预防、缓解和/或治疗心肌肥厚药物中的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

本发明以野生型小鼠及心脏特异性IRX4过表达的小鼠为实验对象，通过AB手术诱导的心肌肥厚模型来研究IRX4基因的功能。结果发现AB刺激，小鼠心功能显著恶化，显著促进了心肌肥厚和心肌纤维化。较野生型+AB组小鼠，AB+IRX4过表达组小鼠心功能有所改善，心肌细胞面积及纤维化面积显著减少。这表明IRX4过表达显著减轻压力负荷诱导的心肌肥厚，即IRX4基因能够对心肌肥厚及相关疾病起保护作用。

为实现上述目的，本发明的技术方案如下：

第一方面，本发明提供一种IRX4作为药物靶标在筛选/制备保护心脏的药物中的应用，其特征在于：所述保护心脏的药物活性成分是IRX4，或者是提高IRX4表达量的试剂。

作为优选方案，所述应用包括利用IRX4作为药物靶标筛选/制备抗心肌纤维化和/或预防、缓解和/或治疗心肌肥厚及相关疾病的药物。

进一步地，所述预防、缓解和/或治疗心肌肥厚及其相关疾病药物是提高IRX4表达量的试剂，或者促进IRX4表达，或者增强IRX4作用的药物。

更进一步地，所述提高IRX4表达量的试剂给药方式为直接裸DNA注射法、脂质体包裹DNA直接注射法、金包被DNA基因枪轰击法、繁殖缺陷细菌携带质粒DNA法、复制缺陷腺病毒携带目的DNA法、PEG修饰蛋白药物注射法、脂质体包裹蛋白静脉注射法或蛋白微球制剂皮下注射法中任一种。

更进一步地，所述心肌肥厚及其相关疾病包括肥厚性心肌病，缺血性心肌病，心肌缺血和慢性心力衰竭。

第二方案，本发明提供一种IRX4的诱导剂在制备保护心脏功能的药物中的应用，其特征在于：所述应用包括利用IRX4的诱导剂制备预防、缓解和/或治疗心肌肥厚及其相关疾病药物。

作为优选方案，所述IRX4的诱导剂是促进蛋白质活性或蛋白质水平的激动剂、或者促进IRX4的mRNA水平的激动剂，其促进活性是可逆的或不可逆的。

进一步地，所述促进IRX4蛋白质活性或蛋白质水平的激动剂包括促进IRX4蛋白质活性或蛋白质水平的蛋白质、多肽、酶、天然化合物、合成化合物、有机物和无机物。

更进一步地，所述心肌肥厚及其相关疾病包括肥厚性心肌病，缺血性心肌病，心肌缺血和慢性心力衰竭。

本发明的药物可施用于会发生或已经发心肌肥厚及相关疾病的任何动物。这些动物包括人类和非人类的动物，例如宠物或牲畜等。

本发明的药物可以本领域已知的途径施用于受试者，包括但不限于口服，胃肠外，皮下，肌内，静脉内，腹腔内，肝内，心肌内，肾内，阴道，直肠，颊，舌下，鼻内，透皮方式等。施用的剂量将取决于接受者的年龄、健康和体重，联用药物的种类，治疗频率，给药途径等。药物可以单一日剂量施用，或者总日剂量以每天两次，三次或四次的分开剂量施用。剂量可以施用一次或多次，施药时间可以单日至几个月或更长时间。

本发明所述心肌肥厚及相关疾病包括但不限于：肥厚性心肌病，缺血性心肌病，心肌缺血，慢性心力衰竭等。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

(1)本发明发现IRX4的新功能，即IRX4具有抑制心肌肥厚及心肌纤维化，改善心功能，保护肥厚性心肌病的作用。

(2)基于IRX4在保护心脏中的功能，其可以为研制预防、缓解和/或治疗肥厚性心肌病和制备抗心肌纤维化的药物提供靶标。

(3)IRX4的诱导剂可用于制备预防、缓解和/或治疗肥厚性心肌病的药物。

附图说明

图1：PCR检测结果显示心脏特异性过表达IRX4基因小鼠构建成功，且AB术后IRX4表达量下降(*：p＜0.05)

图2：WT和TG-IRX4小鼠AB模型4W后，心重体重比(HW/BW)，肺重体重比(LW/BW)及心重胫骨长度比(HW/TL)的统计柱状图，结果显示IRX4过表达显著降低HW/BW、LW/BW及HW/TL(*：p＜0.05)。

图3：是WT和TG-IRX4组小鼠AB模型4W后，心脏大体照，心脏组织HE染色和心肌细胞横截面积统计柱状图，结果显示IRX4过表达显著改善心肌细胞肥大(*：p＜0.05)。

图4：是WT和TG-IRX4小鼠AB模型4W后，心脏组织天狼猩红染色图，结果显示IRX4过表达显著改善心肌的纤维化(*：p＜0.05)。

图5：是WT和TG-IRX4小鼠AB模型4W后心脏组织中心肌肥厚标志物ANP，BNP，αMHC，βMHC以及心肌纤维化标志物Collagen1，Collagen3，CTGF的mRNA水平。结果表明IRX4过表达显著减少心肌肥厚标志物ANP，BNP，βMHC以及心脏纤维化标志物Collagen1，Collagen3，CTGF的mRNA水平(*：p＜0.05)。

图6：是WT和TG-IRX4小鼠AB模型4W后超声检测心功能结果统计柱状图，结果显示IRX4过表达显著改善AB手术诱导的心室扩张和心功能恶化；其中，LVEDD为左室舒张末期内径、LVESD为左室收缩末期内径、LVEF为左室射血分数、FS为短轴缩短率(FS＝(LVEDD-LVESD)/LVEDD)(*：p＜0.05)。

具体实施方式

通过以下详细说明结合附图可以进一步理解本发明的特点和优点。所提供的实施例仅是对本发明方法的说明，而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。

1.实验动物的饲养与构建

心肌特异性IRX4过表达小鼠的构建：将TG-IRX4小鼠与心脏特异性α-MHC-Cre(购自Jackson Laboratory)转基因小鼠交配，筛选得到IRX4/α-MHC-Cre小鼠，待该小鼠长至6周龄左右后，腹腔注射Tamoxifen，诱导Cre酶的表达，最后得到心脏细胞特异性IRX4基因过表达的小鼠。

选用8-10周龄、体重在23.5-27.5g，雄性，野生型小鼠和心脏特异性IRX4基因过表达小鼠(TG-IRX4)为实验对象。所有实验小鼠均饲养在武汉大学SPF级实验动物中心，室温在22-24℃之间，湿度在40-70％之间，明暗交替照明时间为12h，自由饮水摄食。

实施例1：

根据基因小鼠构建方式，建立IRX4心肌细胞特异性过表达的小鼠。WB验证IRX4的表达情况。结果如图1所示，可见IRX4过表达小鼠，IRX4的表达显著升高，表明基因小鼠构建成功。

实施例2：

IRX4过表达显著改善了AB诱导的心肌肥厚，纤维化和对心功能恶化

1、实验分组：WT+sham组，WT+AB组，TG-IRX4+sham组，TG-IRX4+AB

2、心肌肥厚模型的建立和检测：

AB组小鼠给予主动脉弓缩窄术(AB)。具体方法：①麻醉，称重并用3％戊巴比妥钠麻醉小鼠；②备皮：将手术区域的毛发去除；③气管插管；④主动脉弓降支结扎手术：小鼠取右侧卧位，皮肤消毒，打开胸腔，游离主动脉弓降至，用7-0手术锋线穿过血管病结扎，之后关闭胸腔，缝合皮肤。

Sham组小鼠：在游离出主动脉降支后，只穿线不结扎，其余步骤同AB术。

实施例3：

术后四周测定各组小鼠的心功能，心肌肥厚和纤维化，研究IRX4基因过表达对主动脉弓给诱导的心肌肥厚的影响。

超声心功能的检测：小鼠用异氟烷麻醉后剃毛备皮，小鼠取左侧卧位或仰卧位，并在剃毛区均匀涂抹超声耦合剂，采用高频超声诊断仪，频率为15MHz，选取标准左心室乳头肌短轴切面，测量左室舒张末期内径(LVEDD)、左室收缩末期内径(LVESD)、射血分数(EF)及短轴缩短率(FS)。

血流动力学检测：①仪器准备：预热加热垫，打开计算机，打开MPVS-400生物信号釆集系统软件，润洗Millar 1.4F超微导管，打开麻醉机及氧气通道；②消毒颈部皮肤，异氟烷吸入麻醉；③小鼠颈部纵切0.5cm切口，分离出颈总动脉，血管下方穿双线，结扎远心端，活结结扎近心端，于血管结扎区近远心端处，用显微剪作1/3-1/2管径的横切口；将Millar1.4F超微导管插入颈总动脉，解开近心端活结，沿颈总动脉走行，将导管插入左心室；④数据釆集与分析：信号稳定后记录数值：小鼠心率(heart rate，HR)、左心室舒张末期压力(end-diastolic pressure，EDP)、收缩末期压力(end-systolic pressure，ESP)、舒张末期容积(end-diastolic volume，EDV)、收缩末期容积(end-systolic volume，ESV)、左心室射血分数(LVEF)、等容收缩期左室压力上升最大速率(maximal rate ofpressuredeve10pment，dp/dt max)以及等容舒张期左室压力下降最大速率(maximal rateofpressure decay，dp/dt min)等。

取材：将做过超声和血流动力学检测的小鼠，称重，颈椎断颈的方法处死，打开胸腔，取出心脏。随机分为两组。一组将剪下来的心脏迅速置于10％的KCL中，使心脏停跳在舒张期之后，取出心脏，擦干，称重并将其放入福尔马林中固定，48h后用于病理学的检测；另一组心脏减下来挤干心腔中的血液，称重，去除心房，保留左心室并保存在冻存管置于液氮中，以用于后期分子生物学的检测。同时，称重小鼠的肺重和胫骨长度。

病理学检测：

1、制备石蜡标本切片：将福尔马林中的心脏取出，拍大体照之后，脱水，包埋并切片后烘干备用

2、HE苏木精-伊红染色：55℃烘烤30min→二甲苯5min，3次→100％酒精1min→95％酒精1min→70％酒精1min→双蒸水1min→苏木素溶液5min→水洗1min→1％盐酸酒精1-3s→水洗1min→Scott液1min→水洗1min→伊红溶液3-5min→蒸馏水洗去浮色→70％酒精1s→95％酒精1s→100％酒精30s，3次→二甲苯2min，3次→趁二甲苯未干立即封片→通风橱内吹干，显微镜拍照。每张图片选择3个以上边界清楚，核大致位于中央的细胞，用Image-Pro Plus 6.0软件圈细胞面积。

3、天狼猩红(PSR)染色：55℃烘烤30min→二甲苯2min，3次→100％酒精1min→95％酒精1min→70％酒精1min→流水冲洗10min→双蒸水1min→质量分数0.2％磷钼酸2min→0.1％天狼猩红苦味酸溶液滴于组织上，湿盒中染色90min→去除残液→0.01N盐酸4s→70％酒精1次→90％酒精1次→100％酒精30s，3次→二甲苯2min，3次→趁二甲苯未干立即盖玻片封片，显微镜拍照。

分子生物学检测：

1.蛋白Western blot检测方法：

①组织蛋白的提取：组织样品加入裂解液，离心取上清，BCA定量将组织蛋白样品浓度定量在5000ng/ml；②SDS-PAGE凝胶电泳：将10uL组织蛋白样品上样至电泳槽里配置好的电泳凝胶中，75V电泳2h左右；③转膜：4℃冰浴中，恒流200mA转1h40min，将凝胶转至PVDF膜上；④封闭：TBST洗去转膜液之后，将PVDF膜放入封闭液中，封闭1h；⑤孵育一抗：TBST将PVDF膜洗涤5min/次，3次后，将蛋白膜置入一抗孵育盒中，4℃冰箱摇床孵育过夜；⑥第二天，将蛋白膜从一抗中取出，TBST洗三次后，孵育对应的二抗，摇床孵育1h；⑦TBST洗蛋白膜三次后，用显影A液+B液混合液，显影。

2.心肌肥厚指标mRNA的表达：

①提取RNA，每组样品中加入1ml Trizol，静置10min；

②每管加入200ul三氯甲烷抽提，静置5min后，4℃，12000g离心15min；

③RNA沉淀：吸取上层水相至新的EP管中，并加入等体积的异丙醇，混匀后静置10min，12000g，4℃离心10min；

④离心后，可见管底有白色絮状沉淀(RNA)，去除上清，用75％乙醇充分漂洗RNA沉淀后，7500g，4℃离心5min；

⑤RNA沉淀的溶解：去除上清，诗文干燥10min，待沉淀变为无色后，用20ulDEPC水溶解RNA沉淀；

⑥测定每个样品的RNA浓度；

⑦反转录PCR；

⑧RT-PCR：用cDNA模板，特定引物序列测定指标的RNA水平

RNA所用序列如下表：

序列表

<110> 武汉大学

<120> IRX4及其诱导剂在筛选/制备保护心脏的药物中的应用

<160> 18

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 易洛魁类同源域蛋白4(iroquois homeobox 4)

<400> 1

gggctatggc aactacgtga 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 易洛魁类同源域蛋白4(iroquois homeobox 4)

<400> 2

gcagatcccg aaccatcctt 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 脑钠肽(natriuretic peptide B)

<400> 3

tttgggctgt aacgcactga 20

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 脑钠肽(natriuretic peptide B)

<400> 4

cacttcaaag gtggtcccag a 21

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 心房钠尿肽(atrial natriure ticpeptide )

<400> 5

attgacagga ttggagccca g 21

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 心房钠尿肽(atrial natriuretic peptide)

<400> 6

tcaagcagaa tcgactgcct t 21

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> α-肌球蛋白重链(alpha myosin heavy chain)

<400> 7

acattggtgc caagaagatg c 21

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> α-肌球蛋白重链(alpha myosin heavy chain)

<400> 8

ggcagagtcg aacgtttatg t 21

<210> 9

<211> 19

<212> DNA

<213> β-肌球蛋白重链(β-myosin heavy chain)

<400> 9

ccgagtccca ggtcaacaa 19

<210> 10

<211> 19

<212> DNA

<213> β-肌球蛋白重链(β-myosin heavy chain)

<400> 10

cttcacgggc acccttgga 19

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> I型胶原蛋白(Collagen-I)

<400> 11

agcacgtctg gtttggagag 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> I型胶原蛋白(Collagen-I)

<400> 12

gacattaggc gcaggaaggt 20

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> I型胶原蛋白(Collagen-III)

<400> 13

tgactgtccc acgtaagcac 20

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> I型胶原蛋白(Collagen-III)

<400> 14

gagggccata gctgaactga 20

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> 结缔组织生长因子(connective tissue growth factor )

<400> 15

agacctgtgc ctgccattac 20

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> 结缔组织生长因子(connective tissue growth factor )

<400> 16

acgccatgtc tccgtacatc 20

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> 磷酸甘油醛脱氢酶(glyceraldehyde-3phosphate dehydrogenase)

<400> 17

actccactca cggcaaattc 20

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<213> 磷酸甘油醛脱氢酶(glyceraldehyde-3phosphate dehydrogenase)

<400> 18

tctccatggt ggtgaagaca 20