快速早期鉴定杂草稻的PCR引物及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种快速早期鉴定杂草稻的PCR引物及其应用。

背景技术

杂草稻是一种在水稻田不断自生、危害水稻生产、具有杂草特性的水稻，它早熟、易落粒、多数红米粒，具有较强生物竞争性，是水田中仅次于稗草、千金子的第三大恶性杂草。近年来，在我国江苏、湖南、广东、辽宁等省的一些稻区，杂草稻发生越来越重，严重影响水稻产量和质量，威胁着我国水稻生产和粮食安全。杂草稻发生趋重的主要原因，是麦套稻、直播稻、免耕或少耕等水稻轻型栽培措施的广泛推广应用；其次，随着农业机械化水平的提高，水稻机械收割越来越普遍，机械收割携带杂草稻种子，导致杂草稻的不断扩散。杂草稻具有与野生稻一样的落粒和休眠性状，使其在稻田中持续的繁衍生存并入侵栽培稻田，难以治理，水稻田一旦发生杂草稻入侵，就很难彻底根除。到目前为止，尚无有效的杂草稻控制技术和专门针对杂草稻的、具有选择性杀灭效果的除草剂以及配套技术。

杂草稻与栽培稻的形态、生理和遗传背景都极其相似，从外形上极难区分。但杂草稻出苗和成熟早于栽培稻，分蘖数更多，植株高于或矮于栽培稻，谷壳黑色或黄色，种皮大部分为红色，易落粒。传统的杂草稻鉴定方法主要是基于株型、粒型、落粒性等生物学性状的分析，因此只能在水稻生长后期进行鉴定，而这时杂草稻造成的危害已经不可避免。因此，亟需在水稻的幼苗期快速准确的鉴定出杂草稻，及早移除，以降低水稻田间的杂草稻危害。

目前，已报道的早期杂草稻鉴定的方法均是通过PCR等分子技术来鉴定，主要通过红色果皮基因Rc的缺失标记设计PCR鉴定引物，但白色果皮的杂草稻则无法检测出来；另有通过巢式PCR及酶切检测杂草稻SNP位点鉴定杂草稻的方法，但这种方法步骤较繁琐。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供了一种快速早期鉴定杂草稻的PCR引物及其应用，能在水稻苗期(水稻种植早期)有效鉴定杂草稻。

为实现上述目的，本发明所设计一种快速早期鉴定杂草稻的RCR引物，所述引物为P-Bh4引物：

正向引物P-Bh4-F为：5’-TGATATGCTTCCTGCTGTGCAC-3’，反向引物P-Bh4-R为：5’-GACGGCCACGTTGAGCATCGAT-3’。

本发明还提供了一种上述RCR引物在水稻苗期快速鉴定杂草稻中的应用(其通过检测水稻的颖壳颜色从而鉴定杂草稻)。

上述应用的方法：

1)DNA提取，提取待检测的水稻基因组DNA；

2)PCR扩增：以步骤1)提取的DNA为模板，采用权利要求1所述的RCR引物进行PCR扩增；

3)PCR产物电泳观察鉴定：

若泳道上出现一条356bp的条带时，则判定待检测水稻为杂草稻。

本发明还提供了一种快速早期鉴定杂草稻和栽培稻的双重PCR引物组合，所述组合引物由P-Bh4引物和P-Rc引物的两对引物组成，其中，P-Bh4引物为：

正向引物P-Bh4-F为：5’-TGATATGCTTCCTGCTGTGCAC-3’，反向引物P-Bh4-R为：5’-GACGGCCACGTTGAGCATCGAT-3’。

P-Rc引物为：

正向引物P-Rc-F为：5’-CATTCTCCAGATGGACTACTCC-3’，反向引物P-Rc-R为：5’-GATGGCACCGACTTTTCGCGT-3’。

(P-Bh4引物为根据Bh4基因的22bp缺失标记设计，Bh4野生型基因能扩增出一条356bp的条带，Bh4缺失型则不能得到扩增；P-Rc引物为根据Rc基因的14bp缺失标记设计，Rc野生型基因能扩增出一条191bp的条带，Rc缺失型则不能得到扩增)。

本发明还提供了一种快速早期鉴定杂草稻和栽培稻的检测试剂盒，所述试剂盒包括上述的双重PCR引物组合。

本发明还提供了一种上述双重PCR引物组合或上述的试剂盒在水稻苗期快速鉴定杂草稻和栽培稻中的应用(通过检测水稻的颖壳和果皮颜色来鉴定杂草稻和栽培稻)。

本发明还提供了一种在水稻苗期快速鉴定杂草稻和栽培稻的方法，包括以下步骤：

1)DNA提取，提取待检测的水稻基因组DNA；

2)PCR扩增：以步骤1)提取的DNA为模板，采用权利要求4所述的双重PCR引物组合进行双重PCR扩增；

3)PCR产物电泳观察鉴定：

若泳道上有两条或一条目标条带时，则判定该待检测水稻均为杂草稻，

若无特异性条带的为栽培稻。

作为优选方案，所述步骤3)中，

若泳道上同时出现一条356bp和一条191bp的条带时，则判定待检测水稻为黑色颖壳红色果皮的杂草稻；

若泳道上出现一条356bp的条带时，则判定待检测水稻为黑色颖壳白色果皮的杂草稻；

若泳道上出现一条191bp的条带时，则判定待检测水稻为黄色颖壳红色果皮的杂草稻；

若泳道上无特异性条带时，则判定待检测水稻为栽培稻。

作为优选方案，所述步骤2)中，双重PCR反应体系为：

双重PCR扩增条件为：95℃预变性5min；95℃30s，64℃30s，72℃30s，共30个循环；72℃延伸7min。

本发明的原理：

黑色颖壳和红色果皮是普通野生稻的基本特征，栽培稻主要为黄色颖壳和白色果皮。颖壳颜色和红色果皮是野生稻和栽培稻分化的重要表型鉴定指标之一。Bh4是控制水稻黑色颖壳的基因，绝大部分黄色颖壳栽培稻的Bh4基因含有一个22bp的缺失，导致该蛋白功能的丧失，使得颖壳变为黄色。Rc是调控水稻红色果皮最重要的基因，绝大部分水稻白米品种中的Rc基因含有一个14bp的缺失，导致花青素无法合成，从而表现为白色果皮。野生型Bh4和Rc基因表现为黑色颖壳和红色果皮性状，而缺失型Bh4和Rc基因则表现为黄色颖壳和白色果皮性状。杂草稻的许多性状均介于栽培稻和野生稻之间。前期田间调查研究发现，我国杂草稻的表型丰富多样，一些杂草稻与野生稻相似，具有黑色颖壳或红色果皮的特征，另一些杂草稻则具有栽培稻的黄色颖壳或白色果皮的特征，绝大多数的杂草稻均为黑壳红皮、黄壳红皮和黑壳白皮。

本发明的有益效果：

1.本发明将Bh4野生型基因应用于杂草稻的鉴定，只要Bh4野生型基因能扩增出来目标条带，可鉴定为杂草稻。

2.本发明将Bh4野生型基因和Rc野生型基因的检测相结合，应用于杂草稻的鉴定，只要Bh4野生型基因和(或)Rc野生型基因能扩增出来目标条带，即表示具有黑色颖壳和(或)红色果皮，可鉴定为杂草稻，因此能全面有效的鉴定出杂草稻，不会漏检黑色颖壳白色果皮的杂草稻。

3.本发明提供一重PCR/双重PCR的方法，能在水稻苗期(水稻种植早期)有效鉴定杂草稻，操作简单快速，结果准确。

附图说明

图1：本发明实施例1的测试结果图；

图中，M为DL 2000Marker，单位为bp，其中，1、3、6、7、9和10为黑色颖壳的杂草稻；

图2：本发明实施例2的测试结果图

图中，M为DL 2000Marker，单位为bp，1-5为黑色颖壳红色果皮杂草稻，6-10为黑色颖壳白色果皮杂草稻，11-15为黄色颖壳红色果皮杂草稻，16-20为栽培稻。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细描述，以便本领域技术人员理解。

实施例1

快速早期鉴定杂草稻的方法，具体包括以下步骤：

1)P-Bh4引物设计

正向引物P-Bh4-F为：5’-TGATATGCTTCCTGCTGTGCAC-3’，

反向引物P-Bh4-R为：5’-GACGGCCACGTTGAGCATCGAT-3’。

2)DNA提取

在杂草稻泛滥的水稻田中选取样品10份，采集叶片，液氮磨碎后，用植物基因组DNA提取试剂盒提取样品的基因组DNA；

3)对样品基因组DNA进行PCR扩增

PCR扩增的反应体系为：灭菌双蒸水10.7μL，2×PCR Mix 12.5μL，引物P-Bh4-F和P-Bh4-R(10μmol/L)各0.4μL，模板DNA(10ng/μL)1μL；扩增条件为：95℃预变性5min；95℃30s，64℃30s，72℃30s，共30个循环；72℃延伸7min。

4)PCR产物电泳检测及结果判定

PCR结束后，取7μL产物在2％的琼脂糖凝胶上电泳检测。若泳道上出现一条356bp的条带，则鉴定为杂草稻。10份样品的电泳结果见图1，其中，1、3、6、7、9和10为黑色颖壳的杂草稻。

实施例2

快速鉴定杂草稻和栽培稻的方法，具体包括以下步骤：

1)引物设计

a.P-Bh4引物设计：

正向引物P-Bh4-F为：5’-TGATATGCTTCCTGCTGTGCAC-3’，

反向引物P-Bh4-R为：5’-GACGGCCACGTTGAGCATCGAT-3’。

扩增产物大小为356bp。

b.P-Rc引物设计：

正向引物P-Rc-F为：5’-CATTCTCCAGATGGACTACTCC-3’，

反向引物P-Rc-R为：5’-GATGGCACCGACTTTTCGCGT-3’。

扩增产物大小为191bp；

2)DNA提取

选取杂草稻样品120份及栽培稻样品20份，苗期采集幼嫩叶片，液氮磨碎后，用植物基因组DNA提取试剂盒提取样品的基因组DNA；

3)对样品基因组DNA进行双重PCR扩增

双重PCR扩增的反应体系为：灭菌双蒸水9.5μL，2×PCR Mix12.5μL，引物P-Bh4-F和P-Bh4-R(10μmol/L)各0.4μL，引物P-Rc-F和P-Rc-R(10μmol/L)各0.6μL，模板DNA(10ng/μL)1μL。扩增条件为：95℃预变性5min；95℃30s，64℃30s，72℃30s，共30个循环；72℃延伸7min。

4)PCR产物电泳检测及结果判定

PCR结束后，取7μL产物在2％的琼脂糖凝胶上电泳检测。若泳道上出现一条356bp和一条191bp的条带，则为黑色颖壳红色果皮的杂草稻；若泳道上出现一条356bp的条带，则为黑色颖壳白色果皮的杂草稻；若泳道上出现一条191bp的条带，则为黄色颖壳红色果皮的杂草稻；若泳道上无特异性条带的为栽培稻。部分样品的电泳结果见图2。其中，1-5为黑色颖壳红色果皮杂草稻，6-10为黑色颖壳白色果皮杂草稻，11-15为黄色颖壳红色果皮杂草稻，16-20为栽培稻。

其它未详细说明的部分均为现有技术。尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。