一株耐盐碱的绿色木霉及其生物有机肥和应用

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株耐盐碱的绿色木霉及其生物有机肥和应用。

背景技术

公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

土壤盐渍化是土地退化的主要类型之一，是威胁全球的生态问题，也是当今人类所面临的危机之一。据统计，目前世界上的盐碱土已达到10亿hm2，占到了陆地总面积的7％。近年来，由于气候因素和不合理的开发利用致使土壤盐渍化面积仍在不断的扩大，进一步威胁着宝贵而稀缺的土地资源。如何有效的利用盐碱地已经成为全世界的热点问题。

生物有机肥是一类兼具微生物肥料和有机肥效应的肥料。施用生物有机肥不仅能促进植物生长、拮抗病原菌、增加作物产量与质量，还可以改良土壤、提高肥力、改善生态环境等。因此，开发一种盐碱地区适宜的生物有机肥，是加速盐碱地土壤改良的有效途径。生物有机肥发挥作用的核心是具有特定功能的微生物。针对盐碱地的特点，筛选能够耐受盐碱环境的功能微生物，是决定生物有机肥有效性的关键。

发明内容

为了克服上述技术问题，本发明提供一株耐盐碱的绿色木霉及其生物有机肥和应用，本发明通过对前期筛选获得的一株绿色木霉(Trichoderma viride)Tv-1511进一步深入研究发现，其具有良好的抗逆性，对盐碱及低温和高温环境均具有良好的适应能力，同时其对多种病原真菌具拮抗作用，将其固体发酵物进一步添加至有机肥中可制成适用于盐碱地的木霉型生物有机肥，具有良好的实际应用之价值。

为实现上述技术目的，本发明采用的技术方案如下：

本发明的第一个方面，提供外源钙在提高绿色木霉菌(Trichoderma viride)Tv-1511或含有绿色木霉菌(Trichoderma viride)Tv-1511的生物有机肥耐盐性中的应用。

本发明的第二个方面，提供一种生物有机肥，所述生物有机肥至少包括：

(a)上述绿色木霉菌(Trichoderma viride)Tv-1511或其固体发酵物；

(b)钙源。

所述固体发酵物的制备方法如下：将绿色木霉菌Tv-1511接种于装有蘑菇渣的培养基中，置于20～30℃培养15～25天，即得绿色木霉的固体发酵物。钙源既可以有效缓解盐胁迫对绿色木霉Tv-1511的生长抑制，又可以通过抑制活性氧物质的生成来提高植物的耐盐性。该生物有机肥施入盐碱地后，可有效提高绿色木霉Tv-1511和作物的成活率，达到促生增产的效果。

本发明的第三个方面，提供上述绿色木霉菌(Trichoderma viride)Tv-1511和/或生物有机肥在如下任意一种或多种中的应用：

1)在抑制病原菌中的应用；

2)在制备病原菌抑制剂中的应用；

3)在抑制植物病害中的应用；

4)在制备植物病害抑制剂中的应用。

本发明的第四个方面，提供上述绿色木霉菌(Trichoderma viride)Tv-1511和/或生物有机肥在促进农作物增产方面的应用。

所述应用中，应用环境为盐碱环境。

上述一个或多个技术方案的有益技术效果在于：

1)在农业生产中，木霉不可避免地要面对一些不利环境，如高盐、高温等，直接影响木霉的生存。本发明对绿色木霉Tv-1511的耐盐性、耐碱性、耐低温性、耐热性以及拮抗病原菌等多方面进行评价，发现其具有较强的抗逆性，能适应不同的盐碱环境。绿色木霉Tv-1511可以在盐碱地中实现长期定殖，有利于盐碱地的可持续开发。

2)上述技术方案提供的一种适用于盐碱地的木霉型生物有机肥。该肥料在原有生物有机肥的基础上添加了外源钙。外源钙既可以有效缓解盐胁迫对绿色木霉Tv-1511的生长抑制，又可以通过抑制活性氧物质的生成来提高植物的耐盐性。该肥料施入盐碱地后，可有效提高绿色木霉Tv-1511和作物的成活率，达到促生增产的效果。

3)本在黄河三角洲农业高新技术产业示范区布置核心田间试验点，在多种作物和土壤条件下开展了盐碱地木霉型生物有机肥的田间施用效应研究。施用本发明的木霉型生物有机肥，其在盐碱地促生效果好，适合大面积推广应用，具有很好的开发应用前景。

附图说明

构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。

图1为本发明的实施例1中绿色木霉Tv-1511耐盐性的评价；

图2为本发明的实施例1中绿色木霉Tv-1511耐碱性的评价；

图3为本发明的实施例1中绿色木霉Tv-1511耐低温性评价；

图4为本发明的实验例1中绿色木霉Tv-1511耐热性评价；其中，A为绿色木霉Tv-1511在不同温度(28℃、33℃、35℃、37℃)下培养情况图；B为绿色木霉Tv-1511在37℃、40℃、43℃、46℃和49℃的温度下热激24h，然后接种于PDA培养基上置于28℃培养箱中培养情况图。

图5为本发明的实验例2中绿色木霉Tv-1511拮抗病原真菌图；

图6为本发明的实验例3中外源钙在绿色木霉Tv-1511耐盐性中的作用。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。

如前所述，开发一种盐碱地区适宜的生物有机肥，是加速盐碱地土壤改良的有效途径。生物有机肥发挥作用的核心是具有特定功能的微生物。针对盐碱地的特点，筛选能够耐受盐碱环境的功能微生物，是决定生物有机肥有效性的关键。

本发明经过研究证实，外源钙可以显著增强绿色木霉Tv-1511的耐盐性。因此，本发明的一个典型具体实施方式中，提供外源钙在提高上述绿色木霉菌(Trichodermaviride)Tv-1511或含有绿色木霉菌(Trichoderma viride)Tv-1511的生物有机肥耐盐性中的应用。

所述外源钙为氯化钙或过磷酸钙；进一步的，所述氯化钙或过磷酸钙浓度控制0.1～1mM，优选为0.5mM。

本发明又一具体实施方式中，提供一种生物有机肥，所述生物有机肥至少包括：

(a)上述绿色木霉菌(Trichoderma viride)Tv-1511或其固体发酵物；

(b)钙源。

本发明又一具体实施方式中，所述固体发酵物的制备方法如下：将绿色木霉菌Tv-1511接种于装有蘑菇渣的培养基中，置于20～30℃培养15～25天，即得绿色木霉的固体发酵物。钙源既可以有效缓解盐胁迫对绿色木霉Tv-1511的生长抑制，又可以通过抑制活性氧物质的生成来提高植物的耐盐性。该生物有机肥施入盐碱地后，可有效提高绿色木霉Tv-1511和作物的成活率，达到促生增产的效果。

本发明又一具体实施方式中，所述钙源具体为钙盐，进一步优选为过磷酸钙或氯化钙。

本发明又一具体实施方式中，所述固体发酵物的添加量为生物有机肥干重的1～10％，优选为5％。

本发明又一具体实施方式中，所述生物有机肥包括绿色木霉菌(Trichodermaviride)Tv-1511的固体发酵物、钙源和有机肥。

本发明又一具体实施方式中，所述有机肥由金星(日照)农业科技有限公司提供，含水量≤30％，有机质≥45％、全氮4％、全磷(P

本发明又一具体实施方式中，提供上述绿色木霉菌(Trichoderma viride)Tv-1511和/或生物有机肥在如下任意一种或多种中的应用：

1)在抑制病原菌中的应用；

2)在制备病原菌抑制剂中的应用；

3)在抑制植物病害中的应用；

4)在制备植物病害抑制剂中的应用。

本发明又一具体实施方式中，所述病原菌可以为下述全部或部分病原菌：尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)、层生镰刀菌(Fusarium proliferatum)和齐整小核菌(Scleritium rolfsii)。

本发明又一具体实施方式中，所述病害可以为下述全部或部分病害：枯萎病、穗腐病和白绢病。

本发明又一具体实施方式中，提供上述绿色木霉菌(Trichoderma viride)Tv-1511和/或生物有机肥在促进农作物增产方面的应用。

本发明又一具体实施方式中，所述农作物为玉米和小麦，进一步的，所述小麦为济麦22，所述玉米为华农138。

本发明又一具体实施方式中，所述应用中，应用环境为盐碱环境。

需要说明的是，上文中，绿色木霉菌(Trichoderma viride)Tv-1511已于2018年12月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，生物保藏号为：CGMCC NO.16800。该菌株已在专利号为ZL 201910626525.9的专利中公开。

以下通过具体的实施例对本发明的技术方案进行说明。以下各实施例中所用的原料都可通过商购获得。

实施例1 绿色木霉Tv1511抗逆性评价

1.1耐盐性

在不同盐浓度(CK、0.5％、1％、1.5％、2％、3％、4％、5％NaCl)的平板上接种绿色木霉Tv-1511菌块，置于28℃进行培养，每天测定木霉生长圈的半径、扫描生长圈的形态和大小，测菌体的鲜重和干重。

耐盐实验结果显示：在0.5％的NaCl处理下，Tv-1511能够保持正常生长；在1％和1.5％的NaCl处理下Tv-1511也维持了较高的生物量；在NaCl浓度达到5％时，Tv-1511仍然保持一定的活性(图1)。

1.2耐碱性

用HCl和NaOH调节pH分别为4、5、6、7、8、9，接种绿色木霉Tv-1511菌块在28℃进行培养，观察木霉生长圈的形态和大小。结果显示：绿色木霉Tv1511最适生长pH值为6-7；在pH为9的培养基上也可以生长(图2)，具有较强的耐碱性。

1.3耐低温性

将接种绿色木霉Tv-1511菌块的PDA平板分别置于不同温度(8℃、13℃、18℃、23℃、28℃、33℃、35℃、37℃)的培养箱中培养，观察木霉生长圈的形态和大小。结果显示：绿色木霉Tv1511最适生长温度为28℃；在温度达到13℃时，Tv-1511仍然保持一定的活性(图3)，具有较强的耐低温性。

1.4耐热性

将接种绿色木霉Tv-1511菌块的PDA平板分别置于不同温度(28℃、33℃、35℃、37℃)的培养箱中培养，观察木霉生长圈的形态和大小。结果显示：绿色木霉Tv1511在温度达到33℃和35℃时仍然保持一定的活性，具有较好的耐热性(图4，A)。

进一步，将绿色木霉Tv-1511孢子液分别置于37℃、40℃、43℃、46℃和49℃的温度下热激24h，然后接种于PDA培养基上置于28℃培养箱中培养，观察木霉生长圈的形态和大小。结果显示：绿色木霉Tv1511能够在46℃热激24h后恢复生长，具有较强的抗高温性能(图4，B)。

实施例2：绿色木霉菌Tv-1511在拮抗病原真菌中的应用

选用三种植物病原真菌，包括尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)、层生镰刀菌(Fusarium proliferatum)和白绢病菌(Scleritium rolfsii)。用打孔器在菌落边缘取直径为5mm的菌块，在直径线上距两侧皿缘1.5cm的对称位置分别接种植物病原真菌和绿色木霉菌Tv-1511，同时，以不接木霉菌、只接病原菌的平板为对照。置于28℃恒温培养箱中培养，拍照记录真菌对峙情况，并按下列公式计算抑菌率。

抑菌率(％)＝(对照病原菌菌落半径-处理病原菌菌落半径)/对照病原菌菌落半径×100％。

结果表明绿色木霉Tv-1511对尖孢镰刀菌、层生镰刀菌和白绢病菌具有不同程度的抑制作用。接种初期，绿色木霉Tv-1511正常生长，病原菌受到一定程度的抑制；接种4d后，绿色木霉Tv-1511与病原菌接触，病原菌的生长受到显著抑制；接种8d后，绿色木霉Tv-1511覆盖或侵入病菌菌落，并形成大量的绿色孢子，阻止了病原菌的进一步生长，对白绢病菌、层生镰刀菌和尖孢镰刀菌的抑菌率分别为71.9％、66.6％和57.2％(见下表和图5)。因此，绿色木霉Tv-1511对尖孢镰刀菌、层生镰刀菌和白绢病菌等病原菌有拮抗作用，可以对土传真菌病害进行生物防治。

实施例3：外源钙在提高绿色木霉菌Tv-1511耐盐性中的应用

本实施例在山东省科学院生物所工业微生物实验室里进行。以正常PDA培养基为对照，以添加0.5mM CaCl

结果表明，0.5mM CaCl

实施例4：盐碱地木霉型生物有机肥田间示范

4.1.供试材料

供试微生物：绿色木霉菌Tv-1511。

供试作物：小麦(济麦22)，由山东省农业科学院作物研究所选育。玉米(华农138)，购自北京华农伟业种子科技有限公司。

供试木霉型生物有机肥：由金星(日照)农业科技有限公司提供，含水量≤30％，有机质≥45％、全氮4％、全磷(P

木霉固体发酵物：将绿色木霉菌Tv-1511按6％接种量接种于装有蘑菇渣的培养基中，置于30℃培养20天即得。

供试盐碱地木霉型生物有机肥：由金星(日照)农业科技有限公司提供，在木霉型生物有机肥的基础上添加一定比例的过磷酸钙。

4.2.实验设计

田间示范试验在山东省黄河三角洲农业高新技术产业示范区中进行。土壤有机质含量为0.61％-1.01％，有机质含量不高，且高钾低氮低磷；土壤pH偏碱性，高于8.0；盐分含量0.3％-0.6％属于中重度盐渍化土。试验设计如下：以农户常规施肥的为对照组(CK)；施用木霉型生物有机肥的为处理1(T1)；木霉型生物有机肥的基础上添加过磷酸钙(玉米添加量为19.95kg/亩；小麦添加量为28.50kg/亩)的为处理2(T2)，每个处理3个重复，常规管理，成熟后称重计产。

4.3.结果

木霉型生物有机肥对盐碱地小麦千粒重和产量的影响如表1。T1(施用木霉型生物有机肥)和T2(木霉型生物有机肥的基础上添加过磷酸钙)处理后小麦的千粒重分别是CK的1.03倍和1.04倍，其中，T2处理对小麦千粒重的影响达到了显著水平(P＜0.05)。

与CK(常规施肥)处理相比，T1(施用木霉型生物有机肥)处理小麦亩增产42.01kg，增11.90％；T2(木霉型生物有机肥的基础上添加过磷酸钙)处理小麦亩增产66.91kg，增18.95％。两种处理方式均达到差异显著水平(P＜0.05)。因此，施用木霉型生物有机肥和在木霉型生物有机肥的基础上添加过磷酸钙均可显著增加小麦的产量，且以在木霉型生物有机肥的基础上添加过磷酸钙的施肥方式增产效果最为明显。

表1 盐碱地的木霉型生物有机肥对小麦千粒重和产量的影响

木霉型生物有机肥对盐碱地玉米百粒重和产量的影响如表2。与CK(常规施肥)处理相比，T1(施用木霉型生物有机肥)和T2(木霉型生物有机肥的基础上添加过磷酸钙)处理玉米的百粒重分别增加了5.54％和6.62％。其中T2处理对玉米的百粒重的影响达到了显著水平(P＜0.05)。

与CK(常规施肥)处理相比，T1(施用木霉型生物有机肥)处理玉米亩增产61.94kg，增15.48％；T2(木霉型生物有机肥的基础上添加过磷酸钙)处理玉米亩增产126.19kg，增31.54％。两种处理方式与CK相比均达到差异显著水平(P＜0.05)，且T2处理与T1处理也达到差异显著水平(P＜0.05)。因此，施用木霉型生物有机肥和在木霉型生物有机肥的基础上添加过磷酸钙均可显著增加玉米的产量，且以在木霉型生物有机肥的基础上添加过磷酸钙的施肥方式增产效果最为明显。

表2 盐碱地的木霉型生物有机肥对玉米百粒重和产量的影响

最后应该说明的是，以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。上述虽然对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。