结合NKG2D、CD16和肿瘤相关抗原的蛋白质

相关申请的交叉引用

本申请要求2018年5月7日提交的美国临时专利申请第62/667,844号的权益和优先权。

序列表

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技术领域

本发明涉及结合到P-钙粘蛋白(CDH3)、NKG2D和CD16的多特异性结合蛋白。

背景技术

尽管在文献中报道了用于治疗癌症的大量研究努力和科学进展，但是这种疾病仍然是一个重要的健康问题。一些最常被诊断的癌症包括前列腺癌、乳腺癌和肺癌。前列腺癌是男性中最常见的癌症形式。乳腺癌仍然是女性死亡的主要原因。目前对这些癌症的治疗选择对所有患者都无效和/或可能具有明显的不良副作用。使用现有治疗选择来治疗其他类型的癌症也仍然是挑战性的。

癌症免疫疗法是理想的，因为它们是高度特异性的，并且可以使用患者自身的免疫系统促进癌细胞的破坏。融合蛋白如双特异性T细胞接合剂是文献中描述的结合到肿瘤细胞和T细胞以促进肿瘤细胞破坏的癌症免疫疗法。结合到某些肿瘤相关抗原和某些免疫细胞的抗体已经在文献中描述。参见，例如WO 2016/134371和WO 2015/095412。

天然杀伤(NK)细胞是先天性免疫系统的组分，并占循环淋巴细胞的大约15％。NK细胞事实上浸润所有组织，并且最初因它们不需前期致敏即可有效杀伤肿瘤细胞的能力而被表征。活化的NK细胞通过与细胞毒性T细胞相似的手段杀伤靶细胞，即，通过含有穿孔素和颗粒酶的细胞溶解颗粒以及通过死亡受体途径。活化的NK细胞还分泌炎性细胞因子如IFN-γ和促进其他白细胞向靶组织的募集的趋化因子。

NK细胞通过它们表面上的各种活化和抑制受体对信号作出响应。例如，当NK细胞遇到健康的自体细胞时，它们的活性通过杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)的活化而被抑制。或者，当NK细胞遇到外来细胞或癌细胞时，它们通过它们的活化受体(例如，NKG2D、天然细胞毒性受体(NCR)、DNAX辅助分子1(DNAM1))而被活化。NK细胞也通过它们表面上的CD16受体被一些免疫球蛋白的恒定区活化。NK细胞对活化的总体灵敏度取决于刺激和抑制信号的总和。

P-钙粘蛋白(CDH3)是一种钙依赖性细胞-细胞粘附糖蛋白，由五个细胞外钙粘蛋白重复序列、一个跨膜区和一个高度保守的胞质尾区组成。其调节参与胚胎发育和维持成人组织结构的几种细胞稳态过程，这对于细胞分化、细胞形状、细胞极性、生长和迁移是重要的。P-钙粘蛋白存在于几种成人组织中，通常与E-钙粘蛋白共表达，诸如表皮、乳房和前列腺的基底层；以及间皮、卵巢、子宫颈、毛囊和角膜内皮。已报道在食管癌、胰腺癌、膀胱癌、前列腺癌、胃癌、肺癌、子宫内膜癌、卵巢癌、宫颈癌、头颈癌和乳腺癌中，以及在结肠直肠癌、宫颈腺癌、黑素瘤和皮肤的基底细胞和鳞状细胞癌中P-钙粘蛋白表达的上调。

本发明提供了某些优点以改进对上述癌症的治疗。

发明内容

本发明提供了多特异性结合蛋白，其结合到癌细胞上的P-钙粘蛋白(CDH3)，并结合到天然杀伤细胞上的NKG2D受体和CD16受体。在某些实施方案中，所述蛋白质可以激动人和其他物种如啮齿类动物和食蟹猴中的NK细胞。下面进一步详细描述本发明的各个方面和实施方案。

因此，本发明的某些实施方案提供一种蛋白质，其包含：结合NKG2D的第一抗原结合位点；结合P-钙粘蛋白的第二抗原结合位点；和足以结合CD16的抗体片段可结晶(Fc)结构域、其部分，或结合CD16的第三抗原结合位点。

抗原结合位点可以各自包含抗体重链可变结构域和抗体轻链可变结构域(例如，如在抗体中那样排列，或融合在一起以形成scFv)，或抗原结合位点中的一个或多个可以是单结构域抗体，诸如V

在某些实施方案中，本发明提供多特异性结合蛋白，其结合到天然杀伤细胞上的NKG2D受体和CD16受体和癌细胞上的P-钙粘蛋白，其中所述NKG2D结合位点包括与选自以下的氨基酸序列有至少90％同一性的重链可变结构域：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:41、SEQ IDNO:49、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:77、SEQ IDNO:85、SEQ ID NO:158、SEQ ID NO:162、SEQ ID NO:166、SEQ ID NO:170、SEQ ID NO:174、SEQ ID NO:178和SEQ ID NO:93。

在某些实施方案中，结合到NKG2D的第一抗原结合位点可以包含与SEQ ID NO:1相关的重链可变结构域，诸如通过具有与SEQ ID NO:1有至少90％(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的氨基酸序列，和/或包含与SEQID NO:1的CDR1(SEQ ID NO:105或SEQ ID NO:142)、CDR2(SEQ ID NO:106)和CDR3(SEQ IDNO:107或SEQ ID NO:143)序列相同的氨基酸序列。与SEQ ID NO:1相关的重链可变结构域可以与各种轻链可变结构域偶联以形成NKG2D结合位点。例如，包含与SEQ ID NO:1相关的重链可变结构域的第一抗原结合位点还可以包含选自与SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36和40相关的序列中的任一个的轻链可变结构域。例如，第一抗原结合位点包含具有与SEQ ID NO:1有至少90％(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的氨基酸序列的重链可变结构域和具有与选自SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36和40的序列中的任一个具有至少90％(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的氨基酸序列的轻链可变结构域。

或者，在某些实施方案中，第一抗原结合位点可以包含与SEQ ID NO:41相关的重链可变结构域和与SEQ ID NO:42相关的轻链可变结构域。例如，第一抗原结合位点的重链可变结构域可以与SEQ ID NO:41有至少90％(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性，和/或包含与SEQ ID NO:41的CDR1(SEQ ID NO:43或SEQ ID NO:144)、CDR2(SEQ ID NO:44)和CDR3(SEQ ID NO:45或SEQ ID NO:145)序列相同的氨基酸序列。类似地，第二抗原结合位点的轻链可变结构域可以与SEQ ID NO:42有至少90％(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性，和/或包含与SEQ ID NO:42的CDR1(SEQ ID NO:46)、CDR2(SEQ ID NO:47)和CDR3(SEQ IDNO:48)序列相同的氨基酸序列。

在某些实施方案中，第一抗原结合位点可以包含与SEQ ID NO:49相关的重链可变结构域和与SEQ ID NO:50相关的轻链可变结构域。例如，第一抗原结合位点的重链可变结构域可以与SEQ ID NO:49有至少90％(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性，和/或包含与SEQ ID NO:49的CDR1(SEQ ID NO:51或SEQID NO:146)、CDR2(SEQ ID NO:52)和CDR3(SEQ ID NO:53或SEQ ID NO:147)序列相同的氨基酸序列。类似地，第二抗原结合位点的轻链可变结构域可以与SEQ ID NO:50有至少90％(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性，和/或包含与SEQ ID NO:50的CDR1(SEQ ID NO:54)、CDR2(SEQ ID NO:55)和CDR3(SEQ ID NO:56)序列相同的氨基酸序列。

或者，第一抗原结合位点可以包含与SEQ ID NO:57相关的重链可变结构域和与SEQ ID NO:58相关的轻链可变结构域，诸如通过具有分别与SEQ ID NO:57有至少90％(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性和与SEQ IDNO:58有至少90％(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的氨基酸序列。

在另一个实施方案中，第一抗原结合位点可以包含与SEQ ID NO:59相关的重链可变结构域和与SEQ ID NO:60相关的轻链可变结构域。例如，第一抗原结合位点的重链可变结构域可以与SEQ ID NO:59有至少90％(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性，和/或包含与SEQ ID NO:59的CDR1(SEQ ID NO:108)、CDR2(SEQ ID NO:109)和CDR3(SEQ ID NO:110)序列相同的氨基酸序列。类似地，第二抗原结合位点的轻链可变结构域可以与SEQ ID NO:60有至少90％(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性，和/或包含与SEQ ID NO:60的CDR1(SEQ ID NO:111)、CDR2(SEQ ID NO:112)和CDR3(SEQ ID NO:113)序列相同的氨基酸序列。

在一些实施方案中，第一抗原结合位点可以包含与SEQ ID NO:101相关的重链可变结构域和与SEQ ID NO:102相关的轻链可变结构域，诸如通过具有分别与SEQ ID NO:101有至少90％(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性和与SEQ ID NO:102有至少90％(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，第一抗原结合位点可以包含与SEQ ID NO:103相关的重链可变结构域和与SEQ ID NO:104相关的轻链可变结构域，诸如通过具有分别与SEQ ID NO:103有至少90％(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性和与SEQ ID NO:104有至少90％(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的氨基酸序列。

在一些实施方案中，结合到NKG2D的第一抗原结合位点可以包含与SEQ ID NO:61相关的重链可变结构域和与SEQ ID NO:62相关的轻链可变结构域。例如，第一抗原结合位点的重链可变结构域可以与SEQ ID NO:61有至少90％(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性，和/或包含与SEQ ID NO:61的CDR1(SEQ IDNO:63或SEQ ID NO:148)、CDR2(SEQ ID NO:64)和CDR3(SEQ ID NO:65或SEQ ID NO:149)序列相同的氨基酸序列。类似地，第二抗原结合位点的轻链可变结构域可以与SEQ ID NO:62有至少90％(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性，和/或包含与SEQ ID NO:62的CDR1(SEQ ID NO:66)、CDR2(SEQ ID NO:67)和CDR3(SEQID NO:68)序列相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，第一抗原结合位点可以包含与SEQID NO:69相关的重链可变结构域和与SEQ ID NO:70相关的轻链可变结构域。例如，第一抗原结合位点的重链可变结构域可以与SEQ ID NO:69有至少90％(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性，和/或包含与SEQ ID NO:69的CDR1(SEQ ID NO:71或SEQ ID NO:150)、CDR2(SEQ ID NO:72)和CDR3(SEQ ID NO:73或SEQID NO:151)序列相同的氨基酸序列。类似地，第二抗原结合位点的轻链可变结构域可以与SEQ ID NO:70有至少90％(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性，和/或包含与SEQ ID NO:70的CDR1(SEQ ID NO:74)、CDR2(SEQ ID NO:75)和CDR3(SEQ ID NO:76)序列相同的氨基酸序列。

在一些实施方案中，第一抗原结合位点可以包含与SEQ ID NO:77相关的重链可变结构域和与SEQ ID NO:78相关的轻链可变结构域。例如，第一抗原结合位点的重链可变结构域可以与SEQ ID NO:77有至少90％(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性，和/或包含与SEQ ID NO:77的CDR1(SEQ ID NO:79或SEQID NO:152)、CDR2(SEQ ID NO:80)和CDR3(SEQ ID NO:81或SEQ ID NO:153)序列相同的氨基酸序列。类似地，第二抗原结合位点的轻链可变结构域可以与SEQ ID NO:78有至少90％(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性，和/或包含与SEQ ID NO:78的CDR1(SEQ ID NO:82)、CDR2(SEQ ID NO:83)和CDR3(SEQ ID NO:84)序列相同的氨基酸序列。

在一些实施方案中，第一抗原结合位点可以包含与SEQ ID NO:85相关的重链可变结构域和与SEQ ID NO:86相关的轻链可变结构域。例如，第一抗原结合位点的重链可变结构域可以与SEQ ID NO:85有至少90％(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性，和/或包含与SEQ ID NO:85的CDR1(SEQ ID NO:87或SEQID NO:154)、CDR2(SEQ ID NO:88)和CDR3(SEQ ID NO:89或SEQ ID NO:155)序列相同的氨基酸序列。类似地，第二抗原结合位点的轻链可变结构域可以与SEQ ID NO:86有至少90％(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性，和/或包含与SEQ ID NO:86的CDR1(SEQ ID NO:90)、CDR2(SEQ ID NO:91)和CDR3(SEQ ID NO:92)序列相同的氨基酸序列。

在一些实施方案中，第一抗原结合位点可以包含与SEQ ID NO:158相关的重链可变结构域和与SEQ ID NO:86相关的轻链可变结构域。例如，第一抗原结合位点的重链可变结构域可以与SEQ ID NO:158有至少90％(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性，和/或包含与SEQ ID NO:158的CDR1(SEQ ID NO:87或SEQID NO:159)、CDR2(SEQ ID NO:88)和CDR3(SEQ ID NO:160或SEQ ID NO:161)序列相同的氨基酸序列。类似地，第二抗原结合位点的轻链可变结构域可以与SEQ ID NO:86有至少90％(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性，和/或包含与SEQ ID NO:86的CDR1(SEQ ID NO:90)、CDR2(SEQ ID NO:91)和CDR3(SEQ ID NO:92)序列相同的氨基酸序列。

在一些实施方案中，第一抗原结合位点可以包含与SEQ ID NO:162相关的重链可变结构域和与SEQ ID NO:86相关的轻链可变结构域。例如，第一抗原结合位点的重链可变结构域可以与SEQ ID NO:162有至少90％(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性，和/或包含与SEQ ID NO:162的CDR1(SEQ ID NO:87或SEQID NO:163)、CDR2(SEQ ID NO:88)和CDR3(SEQ ID NO:164或SEQ ID NO:165)序列相同的氨基酸序列。类似地，第二抗原结合位点的轻链可变结构域可以与SEQ ID NO:86有至少90％(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性，和/或包含与SEQ ID NO:86的CDR1(SEQ ID NO:90)、CDR2(SEQ ID NO:91)和CDR3(SEQ ID NO:92)序列相同的氨基酸序列。

在一些实施方案中，第一抗原结合位点可以包含与SEQ ID NO:166相关的重链可变结构域和与SEQ ID NO:86相关的轻链可变结构域。例如，第一抗原结合位点的重链可变结构域可以与SEQ ID NO:166有至少90％(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性，和/或包含与SEQ ID NO:166的CDR1(SEQ ID NO:87或SEQID NO:167)、CDR2(SEQ ID NO:88)和CDR3(SEQ ID NO:168或SEQ ID NO:169)序列相同的氨基酸序列。类似地，第二抗原结合位点的轻链可变结构域可以与SEQ ID NO:86有至少90％(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性，和/或包含与SEQ ID NO:86的CDR1(SEQ ID NO:90)、CDR2(SEQ ID NO:91)和CDR3(SEQ ID NO:92)序列相同的氨基酸序列。

在一些实施方案中，第一抗原结合位点可以包含与SEQ ID NO:170相关的重链可变结构域和与SEQ ID NO:86相关的轻链可变结构域。例如，第一抗原结合位点的重链可变结构域可以与SEQ ID NO:170有至少90％(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性，和/或包含与SEQ ID NO:170的CDR1(SEQ ID NO:87或SEQID NO:171)、CDR2(SEQ ID NO:88)和CDR3(SEQ ID NO:172或SEQ ID NO:173)序列相同的氨基酸序列。类似地，第二抗原结合位点的轻链可变结构域可以与SEQ ID NO:86有至少90％(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性，和/或包含与SEQ ID NO:86的CDR1(SEQ ID NO:90)、CDR2(SEQ ID NO:91)和CDR3(SEQ ID NO:92)序列相同的氨基酸序列。

在一些实施方案中，第一抗原结合位点可以包含与SEQ ID NO:174相关的重链可变结构域和与SEQ ID NO:86相关的轻链可变结构域。例如，第一抗原结合位点的重链可变结构域可以与SEQ ID NO:174有至少90％(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性，和/或包含与SEQ ID NO:174的CDR1(SEQ ID NO:87或SEQID NO:175)、CDR2(SEQ ID NO:88)和CDR3(SEQ ID NO:176或SEQ ID NO:177)序列相同的氨基酸序列。类似地，第二抗原结合位点的轻链可变结构域可以与SEQ ID NO:86有至少90％(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性，和/或包含与SEQ ID NO:86的CDR1(SEQ ID NO:90)、CDR2(SEQ ID NO:91)和CDR3(SEQ ID NO:92)序列相同的氨基酸序列。

在一些实施方案中，第一抗原结合位点可以包含与SEQ ID NO:178相关的重链可变结构域和与SEQ ID NO:86相关的轻链可变结构域。例如，第一抗原结合位点的重链可变结构域可以与SEQ ID NO:178有至少90％(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性，和/或包含与SEQ ID NO:178的CDR1(SEQ ID NO:87或SEQID NO:179)、CDR2(SEQ ID NO:88)和CDR3(SEQ ID NO:180或SEQ ID NO:181)序列相同的氨基酸序列。类似地，第二抗原结合位点的轻链可变结构域可以与SEQ ID NO:86有至少90％(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性，和/或包含与SEQ ID NO:86的CDR1(SEQ ID NO:90)、CDR2(SEQ ID NO:91)和CDR3(SEQ ID NO:92)序列相同的氨基酸序列。

在一些实施方案中，第一抗原结合位点可以包含与SEQ ID NO:93相关的重链可变结构域和与SEQ ID NO:94相关的轻链可变结构域。例如，第一抗原结合位点的重链可变结构域可以与SEQ ID NO:93有至少90％(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性，和/或包含与SEQ ID NO:93的CDR1(SEQ ID NO:95或SEQID NO:156)、CDR2(SEQ ID NO:96)和CDR3(SEQ ID NO:97或SEQ ID NO:157)序列相同的氨基酸序列。类似地，第二抗原结合位点的轻链可变结构域可以与SEQ ID NO:94有至少90％(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性，和/或包含与SEQ ID NO:94的CDR1(SEQ ID NO:98)、CDR2(SEQ ID NO:99)和CDR3(SEQ ID NO:100)序列相同的氨基酸序列。

在某些实施方案中，第二抗原结合位点可以结合到P-钙粘蛋白，并且可以任选地包含与SEQ ID NO:114相关的重链可变结构域和与SEQ ID NO:118相关的轻链可变结构域。例如，第二抗原结合位点的重链可变结构域可以与SEQ ID NO:114有至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性，和/或包含与SEQ IDNO:114的CDR1(SEQ ID NO:115)、CDR2(SEQ ID NO:116)和CDR3(SEQ ID NO:117)序列相同的氨基酸序列。类似地，第二抗原结合位点的轻链可变结构域可以与SEQ ID NO:118有至少90％(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性，和/或包含与SEQ ID NO:118的CDR1(SEQ ID NO:119)、CDR2(SEQ ID NO:120)和CDR3(SEQ IDNO:121)序列相同的氨基酸序列。

或者，结合到P-钙粘蛋白的第二抗原结合位点可以任选地包含与SEQ ID NO:122相关的重链可变结构域和与SEQ ID NO:126相关的轻链可变结构域。例如，第二抗原结合位点的重链可变结构域可以与SEQ ID NO:122有至少90％(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性，和/或包含与SEQ ID NO:122的CDR1(SEQ ID NO:123)、CDR2(SEQ ID NO:124)和CDR3(SEQ ID NO:125)序列相同的氨基酸序列。类似地，第二抗原结合位点的轻链可变结构域可以与SEQ ID NO:126有至少90％(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性，和/或包含与SEQ ID NO:126的CDR1(SEQ ID NO:127)、CDR2(SEQ ID NO:128)和CDR3(SEQ ID NO:129)序列相同的氨基酸序列。

或者，结合到P-钙粘蛋白的第二抗原结合位点可以任选地包含与SEQ ID NO:130相关的重链可变结构域和与SEQ ID NO:134相关的轻链可变结构域。例如，第二抗原结合位点的重链可变结构域可以与SEQ ID NO:130有至少90％(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性，和/或包含与SEQ ID NO:130的CDR1(SEQ ID NO:131或SEQ ID NO:182)、CDR2(SEQ ID NO:132或SEQ ID NO:183)和CDR3(SEQID NO:133或SEQ ID NO:184)序列相同的氨基酸序列。类似地，第二抗原结合位点的轻链可变结构域可以与SEQ ID NO:134有至少90％(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性，和/或包含与SEQ ID NO:134的CDR1(SEQ ID NO:135或SEQ ID NO:185)、CDR2(SEQ ID NO:136或SEQ ID NO:186)和CDR3(SEQ ID NO:137或SEQ ID NO:187)序列相同的氨基酸序列。

或者，结合到P-钙粘蛋白的第二抗原结合位点可以任选地包含与SEQ ID NO:188相关的重链可变结构域和与SEQ ID NO:192相关的轻链可变结构域。例如，第二抗原结合位点的重链可变结构域可以与SEQ ID NO:188有至少90％(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性，和/或包含与SEQ ID NO:188的CDR1(SEQ ID NO:189)、CDR2(SEQ ID NO:190)和CDR3(SEQ ID NO:191)序列相同的氨基酸序列。类似地，第二抗原结合位点的轻链可变结构域可以与SEQ ID NO:192有至少90％(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性，和/或包含与SEQ ID NO:192的CDR1(SEQ ID NO:193)、CDR2(SEQ ID NO:194)和CDR3(SEQ ID NO:195)序列相同的氨基酸序列。

或者，结合到P-钙粘蛋白的第二抗原结合位点可以任选地包含与SEQ ID NO:196相关的重链可变结构域和与SEQ ID NO:200相关的轻链可变结构域。例如，第二抗原结合位点的重链可变结构域可以与SEQ ID NO:196有至少90％(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性，和/或包含与SEQ ID NO:196的CDR1(SEQ ID NO:197)、CDR2(SEQ ID NO:198)和CDR3(SEQ ID NO:199)序列相同的氨基酸序列。类似地，第二抗原结合位点的轻链可变结构域可以与SEQ ID NO:200有至少90％(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性，和/或包含与SEQ ID NO:200的CDR1(SEQ ID NO:201)、CDR2(SEQ ID NO:202)和CDR3(SEQ ID NO:203)序列相同的氨基酸序列。

或者，结合到P-钙粘蛋白的第二抗原结合位点可以任选地包含与SEQ ID NO:204相关的重链可变结构域和与SEQ ID NO:208相关的轻链可变结构域。例如，第二抗原结合位点的重链可变结构域可以与SEQ ID NO:204有至少90％(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性，和/或包含与SEQ ID NO:204的CDR1(SEQ ID NO:205)、CDR2(SEQ ID NO:206)和CDR3(SEQ ID NO:207)序列相同的氨基酸序列。类似地，第二抗原结合位点的轻链可变结构域可以与SEQ ID NO:208有至少90％(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性，和/或包含与SEQ ID NO:208的CDR1(SEQ ID NO:209)、CDR2(SEQ ID NO:210)和CDR3(SEQ ID NO:211)序列相同的氨基酸序列。

或者，结合到P-钙粘蛋白的第二抗原结合位点可以任选地包含与SEQ ID NO:212相关的重链可变结构域和与SEQ ID NO:216相关的轻链可变结构域。例如，第二抗原结合位点的重链可变结构域可以与SEQ ID NO:212有至少90％(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性，和/或包含与SEQ ID NO:212的CDR1(SEQ ID NO:213)、CDR2(SEQ ID NO:214)和CDR3(SEQ ID NO:215)序列相同的氨基酸序列。类似地，第二抗原结合位点的轻链可变结构域可以与SEQ ID NO:216有至少90％(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性，和/或包含与SEQ ID NO:216的CDR1(SEQ ID NO:217)、CDR2(SEQ ID NO:218)和CDR3(SEQ ID NO:219)序列相同的氨基酸序列。

或者，结合到P-钙粘蛋白的第二抗原结合位点可以任选地包含与SEQ ID NO:220相关的重链可变结构域和与SEQ ID NO:224相关的轻链可变结构域。例如，第二抗原结合位点的重链可变结构域可以与SEQ ID NO:220有至少90％(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性，和/或包含与SEQ ID NO:220的CDR1(SEQ ID NO:221)、CDR2(SEQ ID NO:222)和CDR3(SEQ ID NO:223)序列相同的氨基酸序列。类似地，第二抗原结合位点的轻链可变结构域可以与SEQ ID NO:224有至少90％(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性，和/或包含与SEQ ID NO:224的CDR1(SEQ ID NO:225)、CDR2(SEQ ID NO:120)和CDR3(SEQ ID NO:226)序列相同的氨基酸序列。

或者，结合到P-钙粘蛋白的第二抗原结合位点可以任选地包含与SEQ ID NO:227相关的重链可变结构域和与SEQ ID NO:229相关的轻链可变结构域。例如，第二抗原结合位点的重链可变结构域可以与SEQ ID NO:227有至少90％(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性，和/或包含与SEQ ID NO:227的CDR1(SEQ ID NO:221)、CDR2(SEQ ID NO:222)和CDR3(SEQ ID NO:228)序列相同的氨基酸序列。类似地，第二抗原结合位点的轻链可变结构域可以与SEQ ID NO:229有至少90％(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性，和/或包含与SEQ ID NO:229的CDR1(SEQ ID NO:225)、CDR2(SEQ ID NO:120)和CDR3(SEQ ID NO:226)序列相同的氨基酸序列。

在某些实施方案中，第二抗原结合位点可以结合到P-钙粘蛋白，并且包含分别选自SEQ ID NO:114和118；122和126；130和134；188和192；196和200；204和208；212和216；220和224；以及227和229的重链可变结构域和轻链可变结构域序列的CDR1、CDR2和CDR3序列。

在一些实施方案中，第二抗原结合位点包含具有与存在于第一抗原结合位点中的轻链可变结构域的氨基酸序列相同的氨基酸序列的轻链可变结构域。

在一些实施方案中，所述蛋白质包含足以结合CD16的抗体Fc结构域的一部分，其中所述抗体Fc结构域包含铰链和CH2结构域，和/或与人IgG抗体的氨基酸序列234-332有至少90％同一性的氨基酸序列。

在某些实施方案中，所述蛋白质还包含结合到肿瘤相关抗原的第四抗原结合位点，所述肿瘤相关抗原包括与癌症相关的任何抗原。例如，第四抗原结合位点可以结合到人表皮生长因子受体2(HER2)、CD20、CD33、B细胞成熟抗原(BCMA)、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、δ样规范缺口配体3(DLL3)、神经节苷脂GD2(GD2)、CD123、anoctamin-1(Ano1)、间皮素、碳酸酐酶IX(CAIX)、肿瘤相关钙信号转导因子2(TROP2)、癌胚抗原(CEA)、紧密连接蛋白-18.2、受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1)、滋养层(trophopblast)糖蛋白(5T4)、糖蛋白非易位黑素瘤蛋白B(GPNMB)、叶酸受体-α(FR-α)、妊娠相关血浆蛋白A(PAPP-A)、CD37、上皮细胞粘附分子(EpCAM)、CD2、CD19、CD30、CD38、CD40、CD52、CD70、CD79b、fms样酪氨酸激酶3(FLT3)、磷脂酰基醇蛋白聚糖3(GPC3)、B7同系物6(B7H6)、C-C趋化因子受体4型(CCR4)、C-X-C基序趋化因子受体4(CXCR4)、受体酪氨酸激酶样孤儿受体2(ROR2)、CD133、HLA I类组织相容性抗原、α链E(HLA-E)、表皮生长因子受体(EGFR/ERBB1)、胰岛素样生长因子1-受体(IGF1R)、人表皮生长因子受体3(HER3)/ERBB3、人表皮生长因子受体4(HER4)/ERBB4、粘蛋白1(MUC1)、酪氨酸蛋白激酶MET(cMET)、信号传导淋巴细胞活化分子F7(SLAMF7)、前列腺干细胞抗原(PSCA)、MHC I类多肽相关序列A(MICA)、MHC I类多肽相关序列B(MICB)、TNF相关凋亡诱导配体受体1(TRAILR1)、TNF相关凋亡诱导配体受体2(TRAILR2)、黑素瘤相关抗原3(MAGE-A3)、B淋巴细胞抗原B7.1(B7.1)、B淋巴细胞抗原B7.2(B74.2)、细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA4)、程序性细胞死亡蛋白1(PD1)、程序性细胞死亡1配体1(PD-L1)或癌细胞上表达的CD25抗原。

还提供了含有本文所述的蛋白质中的任一种的制剂；含有一种或多种表达所述蛋白质的核酸的细胞，以及使用所述蛋白质增强肿瘤细胞死亡的方法。

本发明的另一方面提供一种治疗患者癌症的方法。所述方法包括向有需要的患者施用治疗有效量的本文所述的多特异性结合蛋白。有待使用靶向P-钙粘蛋白的多特异性结合蛋白治疗的癌症包括，例如，食道癌、胰腺癌、膀胱癌、前列腺癌、胃癌、肺癌、子宫内膜癌、卵巢癌、宫颈癌、头颈癌、乳腺癌、结肠直肠癌、宫颈腺癌、黑素瘤以及皮肤的基底细胞和鳞状细胞癌。

附图说明

图1是异源二聚体多特异性结合蛋白的图示。每个臂可以代表NKG2D结合结构域或P-钙粘蛋白的结合结构域。所述多特异性结合蛋白还包含结合到CD16的Fc结构域或其部分。在一些实施方案中，NKG2D结合结构域和P-钙粘蛋白结合结构域可以共用共同的轻链。

图2是异源二聚体多特异性结合蛋白的图示。NKG2D结合结构域或P-钙粘蛋白结合结构域可以采取scFv格式(右臂)。

图3是显示在ELISA测定中NKG2D结合结构域(以克隆列出)对人重组NKG2D的结合亲和力的线形图。

图4是显示在ELISA测定中NKG2D结合结构域(以克隆列出)对食蟹猴重组NKG2D的结合亲和力的线形图。

图5是显示在ELISA测定中NKG2D结合结构域(以克隆列出)对小鼠重组NKG2D的结合亲和力的线形图。

图6是显示通过流式细胞术测量为平均荧光强度(MFI)相较于背景的倍数(FOB)的NKG2D结合结构域(以克隆列出)与表达人NKG2D的EL4细胞的结合的柱状图。

图7是显示通过流式细胞术测量为平均荧光强度(MFI)相较于背景的倍数(FOB)的NKG2D结合结构域(以克隆列出)与表达小鼠NKG2D的EL4细胞的结合的柱状图。

图8是显示在用NKG2D的天然配体ULBP-6的竞争性结合测定中NKG2D结合结构域(以克隆列出)对重组人NKG2D-Fc的特异性结合亲和力的线形图。

图9是显示在用NKG2D的天然配体MICA的竞争性结合测定中NKG2D-结合结构域(以克隆列出)对重组人NKG2D-Fc的结合亲和力的线形图。

图10是显示在用NKG2D的天然配体Rae-1δ的竞争性结合测定中NKG2D-结合结构域(以克隆列出)对重组小鼠NKG2D-Fc的结合亲和力的线形图。

图11是显示如通过流式细胞术测量且定量为TNF-α阳性细胞的百分比的通过NKG2D结合结构域(以克隆列出)对表达人NKG2D-CD3ζ融合蛋白的细胞的活化的柱状图。

图12是显示如通过流式细胞术测量且定量为TNF-α阳性细胞的百分比的通过NKG2D结合结构域(以克隆列出)对表达小鼠NKG2D-CD3ζ融合蛋白的细胞的活化的柱状图。

图13是显示如通过流式细胞术测量且定量为IFNγ

图14是显示如通过流式细胞术测量且定量为IFNγ

图15是显示如通过流式细胞术测量且定量为IFNγ

图16是显示如通过流式细胞术测量且定量为IFNγ

图17是显示如使用Perkin Elmer

图18是显示通过差示扫描荧光测定法测量的NKG2D结合结构域(以克隆列出)的解链温度的柱状图。

图19A至图19C是显示如通过流式细胞术测量且定量为对NK活化标记阳性的细胞的百分比的由CD16和NKG2D结合实现的NK细胞协同活化的柱状图。图19A显示用单独的板结合的抗CD16单克隆抗体、单独的抗NKG2D抗体或抗CD16抗体与抗NKG2D抗体的组合处理后4小时CD107a

图20是呈Triomab形式的多特异性结合蛋白的代表性图示。

图21是呈KiH共同轻链(LC)形式的多特异性结合蛋白的代表性图示。

图22是呈双重可变结构域免疫球蛋白(DVD-Ig

图23是呈正交Fab界面(正交Fab)形式的多特异性结合蛋白的代表性图示。

图24是呈二合一Ig形式的多特异性结合蛋白的代表性图示。

图25是呈静电操控(ES)形式的多特异性结合蛋白的代表性图示。

图26是呈受控Fab臂交换(cFAE)形式的多特异性结合蛋白的代表性图示。

图27是呈链交换工程化结构域(SEED)体形式的多特异性结合蛋白的代表性图示。

图28是呈LuZ-Y形式的多特异性结合蛋白的代表性图示。

图29是呈Cov-X-体形式的多特异性结合蛋白的代表性图示。

图30A和图30B是呈κλ-体形式的多特异性结合蛋白的代表性图示。图30A是κλ-体的一种形式的示例性代表性图示；图30B是另一κλ-体的示例性代表性图示。

图31是呈单臂单链(OAsc)-Fab形式的多特异性结合蛋白的代表性图示。

图32是呈DuetMab形式的多特异性结合蛋白的代表性图示。

图33是呈CrossmAb形式的多特异性结合蛋白的代表性图示。

图34是呈Fit-Ig形式的多特异性结合蛋白的代表性图示。

图35A至图35C是线形图，显示抗P-钙粘蛋白单克隆抗体(D153wt mAb)和抗P-钙粘蛋白多特异性结合蛋白(D153 DB)对表达P-钙粘蛋白的人非小细胞肺癌(H1975；图35A)、人结肠直肠癌(HCT116；图35B)和人舌鳞状细胞癌(CAL27；图35C)细胞的结合亲和力。

图36A至图36C是线形图，显示抗P-钙粘蛋白单克隆抗体(TSP7wt mAb)和抗P-钙粘蛋白多特异性结合蛋白(TSP7 DB)对表达P-钙粘蛋白的人非小细胞肺癌(H1975；图36A)、人结肠直肠癌(HCT116；图36B)和人舌鳞状细胞癌(CAL27；图36C)细胞的结合亲和力。

图37A至图37D是显示用抗P-钙粘蛋白多特异性结合蛋白刺激的KHYG1-CD16V人NK细胞针对人癌细胞的细胞毒性活性的线形图。图37A是显示KHYG1-CD16V介导的针对H1975癌细胞的细胞毒性的D153 DB多特异性结合蛋白刺激的线形图。图37B是显示KHYG1-CD16V介导的针对H1975癌细胞的细胞毒性的TSP7 DB多特异性结合蛋白刺激的线形图。图37C是显示KHYG1-CD16V介导的针对CAL27癌细胞的细胞毒性的D153 DB多特异性结合蛋白刺激的线形图。图37D是显示KHYG1-CD16V介导的针对CAL27癌细胞的细胞毒性的TSP7 DB多特异性结合蛋白刺激的线形图。

图38A至图38C是线形图，显示针对从三个单独供体(供体47897、59165和48892；分别为图38A、图38B和图38C)分离并用多特异性结合蛋白(D153 DB)或单克隆抗体(D153mAb)刺激的原代人NK细胞的表达P-钙粘蛋白的H1975癌细胞的细胞毒性活性。

图39A和图39B是线形图，显示针对从两个单独供体(供体47897和45054；分别为图39A和图39B)分离并用多特异性结合蛋白(D153 DB)或单克隆抗体(D153 mAb)刺激的原代人NK细胞的表达P-钙粘蛋白的DU145细胞的细胞毒性活性。

图40A和图40B是线形图，显示针对从两个单独供体(供体47897和45054；分别为图40A和图40B)分离并用多特异性结合蛋白(D153 DB)或单克隆抗体(D153 mAb)刺激的原代人NK细胞的表达P-钙粘蛋白的H1650癌细胞的细胞毒性活性。

图41A和图41B是线形图，显示针对从两个单独供体(供体59165和47897；分别为图41A和图41B)分离并用多特异性结合蛋白(D153 DB)或单克隆抗体(D153 mAb)刺激的原代人NK细胞的表达P-钙粘蛋白的CAL27(图41A)和HCC1954(图41B)癌细胞的细胞毒性活性。

图42A至图42C是线形图，显示针对用多特异性结合蛋白(TSP7 DB)或单克隆抗体(TSP7 mAb)刺激的供体分离的原代人NK细胞的表达P-钙粘蛋白的H1975(图42A)、H1650(图42B)和HCC1954(图42C)癌细胞的细胞毒性活性。

具体实施方式

本发明提供了多特异性结合蛋白，其结合癌细胞上的P-钙粘蛋白(CDH3)以及天然杀伤细胞上的NKG2D受体和CD16受体。在某些实施方案中，所述多特异性蛋白还包括结合肿瘤相关抗原的额外的抗原结合位点。

本发明还提供了包含所述多特异性结合蛋白的药物组合物，以及使用所述多特异性蛋白和药物组合物用于诸如治疗癌症的目的的治疗方法。本发明的各个方面在下文分章节阐述；然而，在一个特定章节中描述的本发明的方面不应限于任何特定的章节。

为了促进对本发明的理解，下面定义了许多术语和短语。

除非上下文不适当，否则本文所用的术语“一个(a)”和“一个(an)”表示“一个或多个”并且包括复数。

如本文所用，术语“抗原结合位点”是指免疫球蛋白分子中参与抗原结合的部分。在人抗体中，抗原结合位点由重(“H”)链和轻(“L”)链的N-端可变(“V”)区的氨基酸残基形成。重链和轻链的V区内的三个高度趋异性延伸段被称为“高变区”，所述高变区之间插有称为“构架区”或“FR”的较保守侧接延伸段。因此，术语“FR”是指在免疫球蛋白中天然地在高变区之间和附近发现的氨基酸序列。在人抗体分子中，轻链的三个高变区和重链的三个高变区在三维空间中相对于彼此布置以形成抗原结合表面。抗原结合表面与结合抗原的三维表面互补，并且每条重链和轻链的三个高变区被称为“互补决定区”或“CDR”。在某些动物如骆驼和软骨鱼中，抗原结合位点由单抗体链形成，从而提供“单结构域抗体”。抗原结合位点可以存在于完整抗体中、抗体中保留抗原结合表面的抗原结合片段中或诸如scFv的重组多肽中，在单一多肽中使用肽接头将重链可变结构域连接到轻链可变结构域。

如本文所用的术语“肿瘤相关抗原”意指与癌症相关的任何抗原，包括但不限于蛋白质、糖蛋白、神经节苷脂、碳水化合物或脂质。所述抗原可以在恶性细胞上或在肿瘤微环境中(诸如在肿瘤相关血管、细胞外基质、间充质基质或免疫浸润物上)表达。

如本文所用，术语“受试者”和“患者”是指有待通过本文所述的方法和组合物治疗的生物体。这样的生物体优选包括但不限于哺乳动物(例如，鼠、猿、马、牛、猪、犬、猫等)，并且更优选包括人。

如本文所用，术语“有效量”是指足以实现有益或所需结果的化合物(例如，本发明的化合物)的量。有效量可以以一次或多次施用、应用或剂量施用，并且不旨在限于特定的制剂或施用途径。如本文所用，术语“治疗”包括引起病况、疾病、病症等的改进或减轻其症状的任何效果，例如，减轻、减少、调节、改善或消除。

如本文所用，术语“药物组合物”是指活性剂与惰性或活性载剂的组合，使得组合物特别适合于体内或离体的诊断或治疗应用。

如本文所用，术语“药学上可接受的载剂”是指任何标准药物载剂，诸如磷酸盐缓冲盐水溶液、水、乳液(例如，油/水或水/油乳液)和各种类型的润湿剂。所述组合物还可以包括稳定剂和防腐剂。关于载剂、稳定剂和助剂的实例，参见，例如，Remington'sPharmaceutical Sciences，第15版，Mack Publishing Co.,Easton,PA(1975)。

如本文所用，术语“药学上可接受的盐”是指本发明化合物的任何药学上可接受的盐(例如，酸或碱)，所述药学上可接受的盐在向受试者施用后能够提供本发明化合物或其活性代谢产物或残余物。如本领域技术人员所知的，本发明化合物的“盐”可以衍生自无机或有机酸和碱。示例性酸包括但不限于盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、高氯酸、反丁烯二酸、顺丁烯二酸、磷酸、乙醇酸、乳酸、水杨酸、琥珀酸、对甲苯磺酸、酒石酸、乙酸、柠檬酸、甲磺酸、乙磺酸、甲酸、苯甲酸、丙二酸、萘-2-磺酸、苯磺酸等。其他酸，如草酸，虽然本身不是药学上可接受的，但是可以用于制备盐，这些盐可在获得本发明的化合物和其药学上可接受的酸加成盐中用作中间体。

示例性碱包括但不限于碱金属(例如，钠)氢氧化物、碱土金属(例如，镁)氢氧化物、氨和式NW

示例性盐包括但不限于：乙酸盐、己二酸盐、海藻酸盐、天冬氨酸盐、苯甲酸盐、苯磺酸盐、硫酸氢盐、丁酸盐、柠檬酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、环戊烷丙酸盐、二葡糖酸盐、十二烷基硫酸钠、乙磺酸盐、延胡索酸盐、氟庚酸盐、甘油磷酸盐、半硫酸盐、庚酸盐、己酸盐、盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、2-羟基乙磺酸盐、乳酸盐、马来酸盐、甲磺酸盐、2-萘磺酸盐、烟酸盐、草酸盐、棕榈酸盐、果胶酸盐、过硫酸盐、苯基丙酸盐、苦味酸盐、特戊酸盐、丙酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、硫氰酸盐、甲苯磺酸盐、十一酸盐等。盐的其他实例包括与合适阳离子如Na

就治疗用途而言，本发明化合物的盐预期为药学上可接受的。然而，非药学上可接受的酸和碱的盐也可以适用于例如制备或纯化药学上可接受的化合物。

在整个说明书中，当组合物被描述为具有、包括或包含特定组分时，或当过程和方法被描述为具有、包括或包含特定步骤时，可以预期，另外存在基本上由所述组分组成或由其组成的本发明的组合物，并且存在基本上由所述处理步骤组成或由其组成的根据本发明的过程和方法。

通常，除非另有说明，否则指定百分比的组合物以重量计。此外，如果变量没有定义，则以变量的先前定义为准。

I.蛋白质

本发明提供多特异性结合蛋白，所述多特异性结合蛋白结合到天然杀伤细胞上的NKG2D受体和CD16受体，以及癌细胞上的P-钙粘蛋白。所述多特异性结合蛋白可用于本文所述的药物组合物和治疗方法中。多特异性结合蛋白与天然杀伤细胞上的NKG2D受体和CD16受体的结合增强天然杀伤细胞破坏表达P-钙粘蛋白抗原的肿瘤细胞的活性。多特异性结合蛋白与表达P-钙粘蛋白的细胞的结合将癌细胞带至天然杀伤细胞附近，这促使天然杀伤细胞直接和间接破坏癌细胞。以下提供对一些示例性多特异性结合蛋白的进一步描述。

多特异性结合蛋白的第一组分结合到表达NKG2D受体的细胞，所述表达NKG2D受体的细胞可以包括但不限于NK细胞、γδT细胞和CD8

在某些实施方案中，多特异性结合蛋白的第二组分结合到表达P-钙粘蛋白的细胞。表达P-钙粘蛋白的细胞可以在例如但不限于食管癌、胰腺癌、膀胱癌、前列腺癌、胃癌、肺癌、子宫内膜癌、卵巢癌、宫颈癌、头颈癌、乳腺癌、结肠直肠癌、宫颈腺癌、黑素瘤以及皮肤的基底细胞和鳞状细胞癌中发现

多特异性结合蛋白的第三组分结合到表达CD16的细胞，所述CD16为包括天然杀伤细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞和滤泡树突细胞的白细胞的表面上的Fc受体。

本文所述的多特异性结合蛋白可以采取各种格式。例如，一种格式是包括第一免疫球蛋白重链、第一免疫球蛋白轻链、第二免疫球蛋白重链和第二免疫球蛋白轻链的异源二聚体多特异性抗体(图1)。第一免疫球蛋白重链包括第一Fc(铰链-CH2-CH3)结构域、第一重链可变结构域以及任选的第一CH1重链结构域。第一免疫球蛋白轻链包括第一轻链可变结构域和第一轻链恒定结构域。第一免疫球蛋白轻链与第一免疫球蛋白重链一起形成结合NKG2D的抗原结合位点。第二免疫球蛋白重链包含第二Fc(铰链-CH2-CH3)结构域、第二重链可变结构域和任选的第二CH1重链结构域。第二免疫球蛋白轻链包括第二轻链可变结构域和第二轻链恒定结构域。在某些实施方案中，第二免疫球蛋白轻链与第二免疫球蛋白重链一起形成结合P-钙粘蛋白的抗原结合位点。第一Fc结构域和第二Fc结构域一起能够结合到CD16(图1)。在一些实施方案中，第一免疫球蛋白轻链与第二免疫球蛋白轻链相同。

另一示例性格式涉及包括第一免疫球蛋白重链、第二免疫球蛋白重链和免疫球蛋白轻链的异源二聚体多特异性抗体(图2)。第一免疫球蛋白重链包括第一Fc(铰链-CH2-CH3)结构域，所述第一Fc(铰链-CH2-CH3)结构域经由接头或抗体铰链融合到由重链可变结构域和轻链可变结构域组成的单链可变片段(scFv)，所述重链可变结构域和轻链可变结构域配对并结合NKG2D，或结合P-钙粘蛋白。第二免疫球蛋白重链包括第二Fc(铰链-CH2-CH3)结构域、第二重链可变结构域以及任选的CH1重链结构域。免疫球蛋白轻链包括轻链可变结构域和轻链恒定结构域。第二免疫球蛋白重链与免疫球蛋白轻链配对并结合到NKG2D或结合P-钙粘蛋白。第一Fc结构域和第二Fc结构域一起能够结合到CD16(图2)。

一个或多个额外的结合基序可以任选地经由接头序列融合到恒定区CH3结构域的C-端。在某些实施方案中，抗原结合位点可以是单链或二硫键稳定的可变区(scFv)或可以形成四价或三价分子。

在一些实施方案中，多特异性结合蛋白呈Triomab形式，其是维持IgG样形状的三功能双特异性抗体(例如，图20中所示的多特异性结合蛋白)。这种嵌合双特异性抗体由源自两个亲本抗体的两个半抗体组成，各自具有一条轻链和一条重链。Triomab形式可以是异源二聚体，其由1/2的大鼠抗体的和1/2的小鼠抗体组成。

在一些实施方案中，多特异性结合蛋白为KiH共同轻链(LC)形式，其涉及杵臼(KiH)技术(例如，图21中所示的多特异性结合蛋白)。KiH共同LC形式是异源二聚体，其包含结合到第一靶的Fab、结合到第二靶的Fab和通过异源二聚化突变稳定化的Fc结构域。所述两个Fab各自包含重链和轻链，其中每个Fab的重链彼此不同，且与各自相应的重链配对的轻链为两个Fab所共有。

KiH技术涉及工程化CH3结构域以在每个重链中产生“杵”或“臼”以促进异源二聚化。在一个CH3结构域(CH3A)中引入“杵”包括用大体积的残基取代小残基(例如，采取EU编号的T366W

在一些实施方案中，多特异性结合蛋白呈双重可变结构域免疫球蛋白(DVD-Ig

在一些实施方案中，多特异性结合蛋白呈正交Fab界面(正交Fab)形式(例如，图23中所示的多特异性结合蛋白)。在正交Fab IgG方法(Lewis S.M.等，(2014)Nat.Biotechnol.；32(2):191-8.)中，基于结构的区域性设计在仅一个Fab中的LC和HC

在一些实施方案中，多特异性结合蛋白呈二合一Ig形式(例如，图24中所示的多特异性结合蛋白)。

在一些实施方案中，多特异性结合蛋白是静电操控(ES)形式，其是包含结合到靶1和靶2的两个不同的Fab和Fc结构域的异源二聚体(例如，图25中所示的多特异性结合蛋白)。通过Fc结构域中的静电操控突变来确保异源二聚化。

在一些实施方案中，多特异性结合蛋白呈受控Fab臂交换(cFAE)形式(例如，图26中所示的多特异性结合蛋白)。cFAE形式是包含结合到靶1和靶2的两个不同的Fab的双特异性异源二聚体，其中LC-HC对(半分子)已与来自另一分子的LC-HC对交换。通过Fc中的突变来确保异源二聚化。

在一些实施方案中，多特异性结合蛋白呈链交换工程化结构域(SEED)体形式(例如，图27中所示的多特异性结合蛋白)。SEED平台被设计成产生不对称且双特异性的抗体样分子，从而扩展了天然抗体的治疗性应用。这种蛋白质工程化平台基于交换保守CH3结构域内免疫球蛋白类别的结构相关序列(例如，IgA和IgG CH3结构域序列的交替片段)。SEED设计允许高效产生异源二聚体，而不利于SEED CH3结构域的同源二聚化。(Muda M.等，(2011)Protein Eng.Des.Sel.；24(5):447-54.)。

在一些实施方案中，多特异性结合蛋白呈LuZ-Y形式(例如，图28中所示的多特异性结合蛋白)。LuZ-Y形式是包含与Fc结构域融合的结合到靶1和靶2的两个不同scFab的异源二聚体。通过引入与Fc结构域的C-端融合的亮氨酸拉链基序确保异源二聚化(Wranik,BJ.等，(2012)J.Biol.Chem.；287:43331-9)。

在一些实施方案中，多特异性结合蛋白呈Cov-X-体形式(例如，图29中所示的多特异性结合蛋白)。双特异性CovX-体包含具有共价连接到每个Fab臂的药效团肽异源二聚体的支架抗体，其中所述肽异源二聚体的一个分子结合到第一靶，并且所述肽异源二聚体的另一分子结合到第二靶，并且其中所述两个分子通过氮杂环丁酮接头连接。尽管药效团负责功能活性，但抗体支架赋予长半衰期和Ig样分布。可以对药效团进行化学优化或用其他药效团置换以产生优化或独特的双特异性抗体。(Doppalapudi V.R.等，(2010)PNAS；107(52)；22611-22616.)。

在一些实施方案中，多特异性结合蛋白呈κλ-体形式，其是包含与通过异源二聚化突变稳定化的Fc结构域融合的两个不同Fab的异源二聚体(例如，图30中所示的多特异性结合蛋白)。第一Fab结合靶1包含κLC，且第二Fab结合靶2包含λLC。图30A是κλ-体的一种形式的示例性图示；图30B是另一κλ-体的示例性图示。

在一些实施方案中，多特异性结合蛋白呈单臂单链(OAsc)-Fab形式(例如，图31中所示的多特异性结合蛋白)。OAsc-Fab形式是异源二聚体，其包括与Fc结构域融合的结合到靶1的Fab和结合到靶2的scFab。通过Fc结构域中的突变来确保异源二聚化。

在一些实施方案中，多特异性结合蛋白呈DuetMab形式(例如，图32中所示的多特异性结合蛋白)。DuetMab形式是包含结合到靶1和靶2的两种不同的Fab和通过异源二聚化突变稳定化的Fc结构域的异源二聚体。这两个不同的Fab包含不同的S-S桥，所述不同的S-S桥确保正确的LC和HC配对。

在一些实施方案中，多特异性结合蛋白呈CrossmAb形式(例如，图33中所示的多特异性结合蛋白)。CrossmAb形式是包含结合到靶1和靶2的两个不同的Fab和通过异源二聚化突变稳定化的Fc结构域的异源二聚体。使CL和CH1结构域以及VH和VL结构域进行转换，例如，使CH1与VL呈直线融合，同时使CL与VH呈直线融合。

在一些实施方案中，多特异性结合蛋白呈Fit-Ig形式(例如，图34中所示的多特异性结合蛋白)。Fit-Ig形式是包含与结合到靶1的Fab的HC的N-端融合的结合到靶2的Fab。图34的代表性多特异性结合蛋白包含未修饰的Fc结构域。

表1列出了以组合形式可以结合到NKG2D的重链可变结构域和轻链可变结构域的肽序列。除非另有说明，否则表1中提供的CDR序列是在Kabat下确定的。NKG2D结合结构域对NKG2D的结合亲和力可以变化，然而，它们都活化人NKG2D和NK细胞。

或者，由SEQ ID NO：101所示的重链可变结构域可以与由SEQ ID NO：102所示的轻链可变结构域配对，以形成可以结合到NKG2D的抗原结合位点，如US 9,273,136中所说明。

SEQ ID NO：101

SEQ ID NO：102

或者，由SEQ ID NO：103表示的重链可变结构域可以与由SEQ ID NO：104表示的轻链可变结构域配对，以形成可以结合到NKG2D的抗原结合位点，如US 7,879,985中所说明。

SEQ ID NO：103

SEQ ID NO：104

在一个方面中，本公开提供多特异性结合蛋白，所述多特异性结合蛋白结合到天然杀伤细胞上的NKG2D受体和CD16受体，以及抗原P-钙粘蛋白(CDH3)。表2列出了以组合形式可以结合到P-钙粘蛋白(CDH3)的重链可变结构域和轻链可变结构域的一些示例性序列。下表2中所列且相应专利和出版物中所述的重链可变结构域氨基酸序列和轻链可变结构域氨基酸序列的CDR序列通过引用并入本文。

除非另有说明，否则表2中提供的CDR序列是在Kabat下确定的。

或者，可以通过筛选结合到由SEQ ID NO:138(CDH3同工型1前体)、SEQ ID NO:139(CDH3同工型2前体)或SEQ ID NO:140(CDH3同工型3前体)定义的氨基酸序列来鉴定可以结合到P-钙粘蛋白的新型抗原结合位点。

SEQ ID NO：138

SEQ ID NO：139

SEQ ID NO:140

在Fc结构域内，CD16结合由铰链区和CH2结构域介导。例如，在人IgG1内，与CD16的相互作用主要集中在氨基酸残基Asp 265-Glu 269、Asn 297-Thr 299、Ala 327-Ile 332、Leu 234-Ser 239和CH2结构域中的糖残基N-乙酰基-D-葡糖胺上(参见，例如，SondermannP.等，(2000)Nature；406(6793):267-273.)。基于已知结构域，可以诸如通过使用噬菌体展示文库或酵母表面展示cDNA文库来选择突变以增强或降低对CD16的结合亲和力，或可以基于相互作用的已知三维结构进行设计。

可以通过在同一细胞中表达两个不同抗体重链序列来实现异源二聚抗体重链的组装，这可能会引起每条抗体重链的同源二聚体的组装以及异源二聚体的组装。促进异源二聚体的优先组装可以如US13/494,870、US16/028,850、US11/533,709、US12/875,015、US13/289,934、US14/773,418、US12/811,207、US13/866,756、US14/647,480和US14/830,336中所示通过在每个抗体重链恒定区的CH3结构域中包含不同突变来实现。例如，可以基于人IgG1在CH3结构域中实现突变，并且在第一多肽和第二多肽内包含独特的氨基酸取代对，从而允许这两条链彼此选择性地异源二聚化。如下所示的氨基酸取代位置均如在Kabat中根据EU索引进行编号。

在一种情况下，第一多肽中的氨基酸取代用较大的氨基酸置换原始氨基酸，所述较大的氨基酸选自精氨酸(R)、苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)或色氨酸(W)，并且第二多肽中的至少一个氨基酸取代用一个或多个较小的氨基酸置换一个或多个原始氨基酸，所述较小的氨基酸选自丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)或缬氨酸(V)，使得较大的氨基酸取代(突起)适合较小的氨基酸取代的表面(空腔)。例如，一个多肽可以包含T366W取代，并且另一个多肽可以包含三个取代，包括T366S、L368A和Y407V。

本发明的抗体重链可变结构域可以任选地偶联与抗体恒定区有至少90％同一性的氨基酸序列，所述抗体恒定区诸如为包括铰链、CH2和CH3结构域、具有或不具有CH1结构域的IgG恒定区。在一些实施方案中，恒定区的氨基酸序列与人抗体恒定区有至少90％同一性，所述人抗体恒定区诸如为人IgG1恒定区、IgG2恒定区、IgG3恒定区或IgG4恒定区。在一些其他实施方案中，恒定区的氨基酸序列与来自另一种哺乳动物的抗体恒定区有至少90％同一性，所述另一种哺乳动物诸如为兔、狗、猫、小鼠或马。与人IgG1恒定区相比，可以将一个或多个突变包含到恒定区中，例如在Q347、Y349、L351、S354、E356、E357、K360、Q362、S364、T366、L368、K370、N390、K392、T394、D399、S400、D401、F405、Y407、K409、T411和/或K439处。示例性取代包括例如Q347E、Q347R、Y349S、Y349K、Y349T、Y349D、Y349E、Y349C、T350V、L351K、L351D、L351Y、S354C、E356K、E357Q、E357L、E357W、K360E、K360W、Q362E、S364K、S364E、S364H、S364D、T366V、T366I、T366L、T366M、T366K、T366W、T366S、L368E、L368A、L368D、K370S、N390D、N390E、K392L、K392M、K392V、K392F、K392D、K392E、T394F、T394W、D399R、D399K、D399V、S400K、S400R、D401K、F405A、F405T、Y407A、Y407I、Y407V、K409F、K409W、K409D、T411D、T411E、K439D和K439E。

在某些实施方案中，可以包含到人IgG1恒定区的CH1中的突变可以在氨基酸V125、F126、P127、T135、T139、A140、F170、P171和/或V173处。在某些实施方案中，可以包含到人IgG1恒定区的Cκ中的突变可以在氨基酸E123、F116、S176、V163、S174和/或T164处。

或者，氨基酸取代可以选自表3中所示的下列取代组。

或者，氨基酸取代可以选自表4中所示的下列取代组。

或者，氨基酸取代可以选自表5中所示的下列取代组。

或者，每条多肽链中的至少一个氨基酸取代可以选自表6。

或者，至少一个氨基酸取代可以选自表7中的以下取代组，其中第一多肽列中所示的一个或多个位置被任何已知的带负电荷的氨基酸置换，并且第二多肽列中所示的一个或多个位置被任何已知的带正电荷的氨基酸置换。

或者，至少一个氨基酸取代可以选自表8中的以下取代组，其中第一多肽列中所示的一个或多个位置被任何已知的带正电荷的氨基酸置换，并且第二多肽列中所示的一个或多个位置被任何已知的带负电荷的氨基酸置换。

或者，氨基酸取代可以选自表9中的下列组。

或者或此外，可以通过在第一或第二多肽链中的任一者上引入S354C并且在相对的多肽链上引入Y349C来增加异源多聚蛋白的结构稳定性，这在两个多肽的界面内形成人工二硫键。

在一些实施方案中，抗体恒定区的一条多肽链的氨基酸序列在位置T366处不同于IgG1恒定区的氨基酸序列，并且其中抗体恒定区的另一多肽链的氨基酸序列在选自由T366、L368和Y407组成的组的一个或多个位置处不同于IgG1恒定区的氨基酸序列。

在一些实施方案中，抗体恒定区的一条多肽链的氨基酸序列在选自由T366、L368和Y407组成的组的一个或多个位置处不同于IgG1恒定区的氨基酸序列，并且其中抗体恒定区的另一多肽链的氨基酸序列在位置T366处不同于IgG1恒定区的氨基酸序列。

在一些实施方案中，抗体恒定区的一条多肽链的氨基酸序列在选自由E357、K360、Q362、S364、L368、K370、T394、D401、F405和T411组成的组的一个或多个位置处不同于IgG1恒定区的氨基酸序列，并且其中抗体恒定区的另一多肽链的氨基酸序列在选自由Y349、E357、S364、L368、K370、T394、D401、F405和T411组成的组的一个或多个位置处不同于IgG1恒定区的氨基酸序列。

在一些实施方案中，抗体恒定区的一条多肽链的氨基酸序列在选自由Y349、E357、S364、L368、K370、T394、D401、F405和T411组成的组的一个或多个位置处不同于IgG1恒定区的氨基酸序列，并且其中抗体恒定区的另一多肽链的氨基酸序列在选自由E357、K360、Q362、S364、L368、K370、T394、D401、F405和T411组成的组的一个或多个位置处不同于IgG1恒定区的氨基酸序列。

在一些实施方案中，抗体恒定区的一条多肽链的氨基酸序列在选自由L351、D399、S400和Y407组成的组的一个或多个位置处不同于IgG1恒定区的氨基酸序列，并且其中抗体恒定区的另一多肽链的氨基酸序列在选自由T366、N390、K392、K409和T411组成的组的一个或多个位置处不同于IgG1恒定区的氨基酸序列。

在一些实施方案中，抗体恒定区的一条多肽链的氨基酸序列在选自由T366、N390、K392、K409和T411组成的组的一个或多个位置处不同于IgG1恒定区的氨基酸序列，并且其中抗体恒定区的另一多肽链的氨基酸序列在选自由L351、D399、S400和Y407组成的组的一个或多个位置处不同于IgG1恒定区的氨基酸序列。

在一些实施方案中，抗体恒定区的一条多肽链的氨基酸序列在选自由Q347、Y349、K360和K409组成的组的一个或多个位置处不同于IgG1恒定区的氨基酸序列，并且其中抗体恒定区的另一多肽链的氨基酸序列在选自由Q347、E357、D399和F405组成的组的一个或多个位置处不同于IgG1恒定区的氨基酸序列。

在一些实施方案中，抗体恒定区的一条多肽链的氨基酸序列在选自由Q347、E357、D399和F405组成的组的一个或多个位置处不同于IgG1恒定区的氨基酸序列，并且其中抗体恒定区的另一多肽链的氨基酸序列在选自由Y349、K360、Q347和K409组成的组的一个或多个位置处不同于IgG1恒定区的氨基酸序列。

在一些实施方案中，抗体恒定区的一条多肽链的氨基酸序列在选自由K370、K392、K409和K439组成的组的一个或多个位置处不同于IgG1恒定区的氨基酸序列，并且其中抗体恒定区的另一多肽链的氨基酸序列在选自由D356、E357和D399组成的组的一个或多个位置处不同于IgG1恒定区的氨基酸序列。

在一些实施方案中，抗体恒定区的一条多肽链的氨基酸序列在选自由D356、E357和D399组成的组的一个或多个位置处不同于IgG1恒定区的氨基酸序列，并且其中抗体恒定区的另一多肽链的氨基酸序列在选自由K370、K392、K409和K439组成的组的一个或多个位置处不同于IgG1恒定区的氨基酸序列。

在一些实施方案中，抗体恒定区的一条多肽链的氨基酸序列在选自由L351、E356、T366和D399组成的组的一个或多个位置处不同于IgG1恒定区的氨基酸序列，并且其中抗体恒定区的另一多肽链的氨基酸序列在选自由Y349、L351、L368、K392和K409组成的组的一个或多个位置处不同于IgG1恒定区的氨基酸序列。

在一些实施方案中，抗体恒定区的一条多肽链的氨基酸序列在选自由Y349、L351、L368、K392和K409组成的组的一个或多个位置处不同于IgG1恒定区的氨基酸序列，并且其中抗体恒定区的另一多肽链的氨基酸序列在选自由L351、E356、T366和D399组成的组的一个或多个位置处不同于IgG1恒定区的氨基酸序列。

在一些实施方案中，抗体恒定区的一条多肽链的氨基酸序列因S354C取代而不同于IgG1恒定区的氨基酸序列，并且其中抗体恒定区的另一多肽链的氨基酸序列因Y349C取代而不同于IgG1恒定区的氨基酸序列。

在一些实施方案中，抗体恒定区的一条多肽链的氨基酸序列因Y349C取代而不同于IgG1恒定区的氨基酸序列，并且其中抗体恒定区的另一多肽链的氨基酸序列因S354C取代而不同于IgG1恒定区的氨基酸序列。

在一些实施方案中，抗体恒定区的一条多肽链的氨基酸序列因K360E和K409W取代而不同于IgG1恒定区的氨基酸序列，并且其中抗体恒定区的另一多肽链的氨基酸序列因Q347R、D399V和F405T取代而不同于IgG1恒定区的氨基酸序列。

在一些实施方案中，抗体恒定区的一条多肽链的氨基酸序列因Q347R、D399V和F405T取代而不同于IgG1恒定区的氨基酸序列，并且其中抗体恒定区的另一多肽链的氨基酸序列因K360E和K409W取代而不同于IgG1恒定区的氨基酸序列。

在一些实施方案中，抗体恒定区的一条多肽链的氨基酸序列因T366W取代而不同于IgG1恒定区的氨基酸序列，并且其中抗体恒定区的另一多肽链的氨基酸序列因T366S、T368A和Y407V取代而不同于IgG1恒定区的氨基酸序列。

在一些实施方案中，抗体恒定区的一条多肽链的氨基酸序列因T366S、T368A和Y407V取代而不同于IgG1恒定区的氨基酸序列，并且其中抗体恒定区的另一多肽链的氨基酸序列因T366W取代而不同于IgG1恒定区的氨基酸序列。

在一些实施方案中，抗体恒定区的一条多肽链的氨基酸序列因T350V、L351Y、F405A和Y407V取代而不同于IgG1恒定区的氨基酸序列，并且其中抗体恒定区的另一多肽链的氨基酸序列因T350V、T366L、K392L和T394W取代而不同于IgG1恒定区的氨基酸序列。

在一些实施方案中，抗体恒定区的一条多肽链的氨基酸序列因T350V、T366L、K392L和T394W取代而不同于IgG1恒定区的氨基酸序列，并且其中抗体恒定区的另一多肽链的氨基酸序列因T350V、L351Y、F405A和Y407V取代而不同于IgG1恒定区的氨基酸序列。

上述的多特异性结合蛋白可以使用本领域技术人员熟知的重组DNA技术制备。例如，可以将编码第一免疫球蛋白重链的第一核酸序列克隆到第一表达载体中；可以将编码第二免疫球蛋白重链的第二核酸序列克隆到第二表达载体中；可以将编码免疫球蛋白轻链的第三核酸序列克隆到第三表达载体中；并且可以将第一表达载体、第二表达载体和第三表达载体一起稳定转染到宿主细胞中以产生多聚蛋白。

为了实现多特异性蛋白的最高产率，可以探索不同比率的第一表达载体、第二表达载体和第三表达载体以确定用于转染到宿主细胞中的最佳比率。在转染之后，可以将单一克隆分离以便使用诸如有限稀释、ELISA、流式细胞术、显微术或Clonepix的本领域中已知的方法产生细胞库。

可以将克隆在适合生物反应器放大的条件下培养并且维持多特异性蛋白的表达。可以使用本领域中已知的包括以下的方法将多特异性蛋白分离和纯化：离心、深度过滤、细胞溶解、均质化、冷冻-解冻、亲和力纯化、凝胶过滤、离子交换色谱、疏水相互作用交换色谱和混合模式色谱。

II.多特异性蛋白的表征

本文所述的多特异性结合蛋白包括NKG2D结合位点、CD16结合位点和P-钙粘蛋白的结合位点。在一些实施方案中，多特异性结合蛋白同时结合到表达NKG2D和/或CD16的细胞如NK细胞和表达P-钙粘蛋白的肿瘤细胞。多特异性蛋白与NK细胞的结合可以增强NK细胞破坏癌细胞的活性。

在某些实施方案中，本文所述的多特异性结合蛋白以与具有相同P-钙粘蛋白结合位点的相应单克隆抗体相似的亲和力结合到P-钙粘蛋白。在某些实施方案中，本文所述的多特异性结合蛋白在杀伤表达P-钙粘蛋白的肿瘤细胞方面比具有相同P-钙粘蛋白结合位点的相应单克隆抗体更有效。

在某些实施方案中，本文所述的多特异性结合蛋白，其包括NKG2D结合位点和P-钙粘蛋白结合位点，当与表达P-钙粘蛋白的肿瘤细胞共培养时活化原代人NK细胞。NK细胞活化通过CD107a表达、脱粒和IFN-γ细胞因子产生增加来标记。此外，与具有相同P-钙粘蛋白结合位点的相应单克隆抗体相比，本文所述的多特异性结合蛋白可以在表达P-钙粘蛋白的细胞存在下显示对人NK细胞的优异活化。

在某些实施方案中，本文所述的多特异性结合蛋白，其包括NKG2D结合位点和P-钙粘蛋白结合位点，在表达P-钙粘蛋白的肿瘤细胞存在下增强静息和IL-2活化的人NK细胞的活化。

在某些实施方案中，与具有相同P-钙粘蛋白结合位点的相应单克隆抗体相比，本文所述的多特异性结合蛋白可以对具有中等或低P-钙粘蛋白表达的肿瘤细胞具有更高的细胞毒性活性。

III.治疗应用

本发明提供了使用本文所述的多特异性结合蛋白和/或本文所述的药物组合物治疗癌症的方法。所述方法可以用于治疗表达P-钙粘蛋白的多种癌症。有待治疗的示例性癌症可以是胃癌、结肠直肠癌、胰腺癌、乳腺癌、子宫内膜癌、肺癌、前列腺癌、膀胱癌、宫颈癌、头颈癌、卵巢癌、食管癌、肾癌、肝癌、睾丸癌、口腔癌、多发性骨髓瘤、白血病、急性骨髓性白血病、黑素瘤、皮肤的基底细胞和鳞状细胞癌、神经胶质瘤、尤文肉瘤、卡波西肉瘤和间皮瘤。

在一些其他实施方案中，有待治疗的示例性癌症可以是肢端着色性黑色素瘤、光化性角化病、急性成淋巴细胞性白血病、急性淋巴细胞性白血病、急性骨髓性白血病、腺瘤、腺样囊性癌、腺肉瘤、腺鳞癌、肛管癌、间变性大细胞淋巴瘤、血管免疫母细胞性T细胞淋巴瘤、血管肉瘤、直肠肛管癌、星形细胞瘤、巴氏腺癌、基底细胞癌(例如，皮肤)、B细胞淋巴瘤、胆道癌、膀胱癌、骨癌、骨髓癌、脑癌、乳腺癌、支气管癌、支气管腺癌、伯基特淋巴瘤、类癌、宫颈癌、胆管癌、软骨肉瘤、脉络丛乳头状瘤/癌、慢性淋巴细胞性白血病、慢性骨髓性白血病、慢性中性粒细胞性白血病、透明细胞癌、结肠癌、结肠直肠癌、结缔组织癌、皮肤T细胞淋巴瘤、囊腺瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、消化系统癌、十二指肠癌、内分泌系统癌、内胚窦瘤、子宫内膜癌/间质肉瘤、子宫内膜间质肉瘤、子宫内膜样腺癌、内皮细胞癌、肠病型T细胞淋巴瘤、室管膜癌、上皮细胞癌、食管癌、尤文肉瘤、淋巴结外边缘区B细胞淋巴瘤、淋巴结外天然杀伤细胞/T细胞淋巴瘤、眼和眼眶癌、女性生殖器癌、局灶性结节性增生、滤泡性淋巴瘤、胆囊癌、胃窦癌、胃癌、胃底贲门癌、胃泌素瘤、成胶质细胞瘤、胶质瘤、胰高血糖素瘤、毛细胞白血病、头颈癌、心脏癌症、成血管细胞瘤、血管内皮瘤、血管瘤、血液肿瘤、肝腺瘤、肝腺瘤变、肝细胞癌、肝胆管癌、霍奇金氏病、回肠癌、胰岛细胞瘤、上皮内瘤变、上皮内鳞状细胞瘤变、肝内胆管癌、侵入性鳞状细胞癌、空肠癌、关节癌、卡波斯肉瘤、肾癌、大细胞癌、大肠癌、平滑肌肉瘤、恶性雀斑样痣黑素瘤、白血病、肝癌、肺癌、淋巴瘤、淋巴浆细胞性淋巴瘤、男性生殖器癌、恶性黑素瘤、恶性间皮肿瘤、套细胞淋巴瘤、边缘区B细胞淋巴瘤、成神经管细胞瘤、髓上皮瘤、黑素瘤、脑膜癌、间皮癌、间皮瘤、转移性癌、口腔癌、粘液表皮样癌、多发性骨髓瘤、肌肉癌、骨髓增生异常肿瘤、骨髓增殖性肿瘤、鼻道癌、神经系统癌、神经母细胞瘤、神经上皮腺癌、结节边缘区B细胞淋巴瘤、结节性黑素瘤、非上皮皮肤癌、非霍奇金氏淋巴瘤、燕麦细胞癌、少突胶质细胞癌、口腔癌、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、乳突状血清腺癌、腮腺癌、骨盆癌、阴茎癌、外周T-细胞淋巴瘤、咽癌、垂体瘤、浆细胞瘤、前体T成淋巴细胞性淋巴瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤、原发性纵隔B细胞淋巴瘤、前列腺癌、假性肉瘤、肺胚细胞瘤、直肠癌、肾癌、肾细胞癌、呼吸系统癌、成视网膜细胞瘤、横纹肌肉瘤、肉瘤、浆细胞性癌、窦癌、皮肤癌、小细胞癌、小肠癌、小淋巴细胞性淋巴瘤、平滑肌癌、软组织癌、生长抑素分泌肿瘤、脊椎癌、脾脏边缘区B细胞淋巴瘤、鳞状细胞癌(例如，皮肤)、横纹肌癌、皮下脂膜炎样T-细胞淋巴瘤、间皮下癌、浅表扩散性黑素瘤、T细胞白血病、T细胞淋巴瘤、睾丸癌、甲状腺癌、舌癌、未分化癌、输尿管癌、尿道癌、膀胱癌、子宫癌、宫体癌、葡萄膜黑色素瘤、阴道癌、疣状癌、舒血管肠肽瘤、外阴癌、高分化癌或肾胚胎性瘤、舌癌、未分化癌、输尿管癌、尿道癌、尿道膀胱癌、子宫癌、宫体癌、葡萄膜黑素瘤、阴道癌、疣状癌、血管活性肠肽瘤(VIPoma)、外阴癌、高分化癌或威尔姆氏瘤。

IV.组合疗法

本发明的另一方面提供组合疗法。可以将本文所述的多特异性结合蛋白与额外的治疗剂组合使用以治疗癌症。

可以用作治疗癌症的组合疗法的一部分的示例性治疗剂包括，例如放射、丝裂霉素、维甲酸、苯达莫司汀(ribomustin)、吉西他滨、长春新碱、依托泊苷、克拉屈滨、二溴甘露醇、甲氨蝶呤、多柔比星、卡波醌、喷司他丁、硝基可润、净司他丁、西曲瑞克、来曲唑、雷替曲塞、柔红霉素、法达唑、福莫司汀、胸腺法新、索布佐生、奈达铂、阿糖胞苷、比卡鲁胺、长春瑞滨、维司力农、氨鲁米特、安吖啶、丙谷胺、依利醋铵、酮色林、去氧氟尿苷、依曲替酯、异维甲酸、链脲佐菌素、尼莫司汀、长春地辛、氟他胺(flutamide)、氟他胺(drogenil)、布缩宫素、卡莫氟、雷佐生、西佐喃、卡铂、二溴卫矛醇、替加氟、异环磷酰胺、泼尼莫司汀、毕西巴尼、左旋咪唑、替尼泊苷、英丙舒凡、依诺他滨、麦角乙脲、羟甲烯龙、他莫昔芬、黄体酮、美雄烷、环硫雄醇、福美司坦、干扰素-α、干扰素-2α、干扰素-β、干扰素-γ、集落刺激因子-1、集落刺激因子-2、地尼白介素、白介素-2、促黄体激素释放因子和上述药剂的可能表现出对其同源受体的差异结合和增加或减少的血清半衰期的变化型。

可以用作治疗癌症的组合疗法的一部分的另一类药剂是免疫检查点抑制剂。示例性免疫检查点抑制剂包括抑制以下一种或多种的药剂：(i)细胞毒性T-淋巴细胞相关抗原4(CTLA4)、(ii)程序性细胞死亡蛋白1(PD1)、(iii)PDL1、(iv)LAG3、(v)B7-H3、(vi)B7-H4和(vii)TIM3。CTLA4抑制剂伊匹木单抗已被美国食品和药物管理局批准用于治疗黑素瘤。

在治疗癌症中可以用作组合疗法的一部分的其他药剂是靶向非检查点靶的单克隆抗体药剂(例如，赫赛汀)和非细胞毒性药剂(例如，酪氨酸激酶抑制剂)。

其他类别的抗癌剂包括例如：(i)选自以下的抑制剂：ALK抑制剂、ATR抑制剂、A2A拮抗剂、碱基切除修复抑制剂、Bcr-Abl酪氨酸激酶抑制剂、布鲁顿氏酪氨酸激酶(Bruton'sTyrosine Kinase)抑制剂、CDC7抑制剂、CHK1抑制剂、周期蛋白依赖性激酶抑制剂、DNA-PK抑制剂、DNA-PK与mTOR两者的抑制剂、DNMT1抑制剂、DNMT1抑制剂加上2-氯-脱氧腺苷、HDAC抑制剂、刺猬信号传导路径抑制剂、IDO抑制剂、JAK抑制剂、mTOR抑制剂、MEK抑制剂、MELK抑制剂、MTH1抑制剂、PARP抑制剂、磷酸肌醇3-激酶抑制剂、PARP1与DHODH两者的抑制剂、蛋白酶体抑制剂、拓扑异构酶-II抑制剂、酪氨酸激酶抑制剂、VEGFR抑制剂和WEE1抑制剂；(ii)OX40、CD137、CD40、GITR、CD27、HVEM、TNFRSF25或ICOS的激动剂；以及(iii)选自IL-12、IL-15、GM-CSF和G-CSF的细胞因子。

本发明的蛋白质还可以用作手术移除原发病损的辅助物。

可以选择多特异性结合蛋白和额外的治疗剂的量以及施用的相对时间，以获得所需的组合治疗效果。例如，当向需要这种施用的患者施用组合疗法时，组合中的治疗剂或包含治疗剂的一种或多种药物组合物可以以任何顺序，例如依次、共同、一起、同时等施用。此外，例如，多特异性结合蛋白可以在一种或多种额外的治疗剂发挥其预防或治疗作用期间施用，反之亦然。

V.药物组合物

本公开的特征还在于含有治疗有效量的本文所述的蛋白质的药物组合物。可以将组合物配制成用于多种药物递送系统中。对于适当的制剂，组合物中还可以包括一种或多种生理学上可接受的赋形剂或载剂。适合用于本公开中的制剂在Remington'sPharmaceutical Sciences，第17版，MackPublishing Company,Easton,PA(1985)中见到。对于药物递送方法的简单综述，参见，例如Langer T.(1990)Science；249(4976):1527-1533。

本公开的静脉内药物递送制剂可以容纳在袋、笔或注射器中。在某些实施方案中，袋可以连接到包括管和/或针的通道。在某些实施方案中，制剂可以是冻干制剂或液体制剂。在某些实施方案中，可以将制剂冷冻干燥(冻干)并且容纳在约12至60个小瓶中。在某些实施方案中，可以将制剂冷冻干燥并且一个小瓶中可以容纳45mg的冷冻干燥制剂。在某些实施方案中，一个小瓶中可以容纳约40mg至约100mg的冷冻干燥制剂。在某些实施方案中，将来自12、27或45个小瓶的冷冻干燥制剂组合，以获得含治疗剂量的蛋白质的静脉内药物制剂。在某些实施方案中，制剂可以是液体制剂并且以约250mg/小瓶至约1000mg/小瓶加以储存。在某些实施方案中，制剂可以是液体制剂并且以约600mg/小瓶加以储存。在某些实施方案中，制剂可以是液体制剂并且以约250mg/小瓶加以储存。

本公开可以存在于液体水性药物制剂中，所述制剂包括在缓冲溶液中的治疗有效量的多特异性蛋白。

本文公开的组合物可以通过常规灭菌技术灭菌，或可以进行无菌过滤。可以将所得水溶液包装成按原样使用，或冻干，其中冻干制剂在施用之前与无菌水性载剂组合。制剂的pH通常将在3与11之间，更优选在5与9之间或在6与8之间，并且最优选在7与8之间，诸如7至7.5。可以将固体形式的所得组合物包装在多个单剂量单位中，每个单位包含固定量的上述一种或多种剂。还可以将固体形式的组合物包装在用于灵活量的容器中。

在某些实施方案中，本公开提供一种具有延长的保质期的制剂，所述制剂包括本公开的蛋白质与以下物质的组合：甘露糖醇、单水合柠檬酸、柠檬酸钠、二水合磷酸二钠、二水合磷酸二氢钠、氯化钠、聚山梨醇酯80、水和氢氧化钠。

在某些实施方案中，制备包括本公开的蛋白质的pH缓冲溶液的水性制剂。本发明的缓冲剂可以具有约4至约8，例如，约4.5至约6.0，或约4.8至约5.5的pH，或可以具有约5.0至约5.2的pH。上述pH的中间范围也旨在成为本公开的一部分。例如，使用任何上所值的组合作为上限和/或下限的值范围旨在被包括在内。将pH控制在此范围内的缓冲液的实例包括乙酸盐(例如，乙酸钠)、琥珀酸盐(例如，琥珀酸钠)、葡糖酸盐、组氨酸、柠檬酸盐和其他有机酸缓冲液。

在某些实施方案中，制剂包括含有柠檬酸盐和磷酸盐以将pH维持在约4至约8范围内的缓冲系统。在某些实施方案中，pH范围可以为约4.5至约6.0，或约pH 4.8至约5.5，或在约5.0至约5.2的pH范围内。在某些实施方案中，缓冲系统包括单水合柠檬酸、柠檬酸钠、二水合磷酸二钠和/或二水合磷酸二氢钠。在某些实施方案中，缓冲系统包括约1.3mg/mL的柠檬酸(例如，1.305mg/mL)、约0.3mg/mL的柠檬酸钠(例如，0.305mg/mL)、约1.5mg/mL的二水合磷酸二钠(例如，1.53mg/mL)、约0.9mg/mL的二水合磷酸二氢钠(例如，0.86mg/mL)以及约6.2mg/mL的氯化钠(例如，6.165mg/mL)。在某些实施方案中，缓冲系统包括1mg/mL至1.5mg/mL的柠檬酸、0.25mg/mL至0.5mg/mL的柠檬酸钠、1.25mg/mL至1.75mg/mL的二水合磷酸二钠、0.7mg/mL至1.1mg/mL的二水合磷酸二氢钠以及6.0mg/mL至6.4mg/mL的氯化钠。在某些实施方案中，制剂的pH用氢氧化钠调节。

本文所述的制剂中还可以包括充当张力剂并且可以稳定化抗体的多元醇。将多元醇以可以相对于所需制剂等张性变化的量添加到制剂中。在某些实施方案中，水性制剂可以是等张的。还可以相对于多元醇的分子量改变多元醇的添加量。例如，与二糖(诸如海藻糖)相比，可以添加较低量的单糖(例如，甘露糖醇)。在某些实施方案中，可以在制剂用作张力剂的多元醇为甘露糖醇。在某些实施方案中，甘露糖醇浓度可以是约5mg/mL至约20mg/mL。在某些实施方案中，甘露糖醇的浓度可以是约7.5mg/mL至15mg/mL。在某些实施方案中，甘露糖醇的浓度可以是约10mg/mL至14mg/mL。在某些实施方案中，甘露糖醇的浓度可以是约12mg/mL。在某些实施方案中，制剂中可以包括多元醇山梨糖醇。

还可以将洗涤剂或表面活性剂添加到本发明的制剂中。示例性洗涤剂包括非离子洗涤剂，诸如聚山梨醇酯(例如聚山梨醇酯20、80等)或泊洛沙姆(例如泊洛沙姆188)。洗涤剂的添加量使得它减少所配制抗体的聚集和/或使制剂中微粒的形成减至最少和/或减少吸附。在某些实施方案中，制剂可以包括表面活性剂，所述表面活性剂为聚山梨酸酯。在某些实施方案中，制剂可以含有洗涤剂聚山梨醇酯80或吐温80。吐温80是用于描述聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单油酸酯的术语(参见，例如Fiedler H.P.,Lexikon der Hifsstoffe für Pharmazie,Kosmetikund andrenzende Gebiete，第4版，Editio Cantor,Aulendorf,Germany(1996)。在某些实施方案中，制剂可以含有约0.1mg/mL与约10mg/mL之间，或约0.5mg/mL与约5mg/mL之间的聚山梨醇酯80。在某些实施方案中，可以在制剂中添加约0.1％聚山梨醇酯80。

在某些实施方案中，将本公开的多特异性蛋白产物配制成液体制剂。液体制剂可以10mg/mL浓度存在于用橡胶塞盖紧并且用铝锯齿形密封件密封的USP/PhEurI型50R小瓶中。所述塞可以由符合USP和Ph Eur的弹性体制成。在某些实施方案中，小瓶可以填充有61.2mL的多特异性蛋白产物溶液以允许60mL的可抽取体积。在某些实施方案中，可以将液体制剂用0.9％盐水溶液稀释。

在某些实施方案中，可以将本公开的液体制剂与稳定水平的糖组合制备成10mg/mL浓度溶液。在某些实施方案中，可以在水性载剂中制备液体制剂。在某些实施方案中，可以不大于可能产生静脉内施用不希望或不适合的粘度的量添加稳定剂。在某些实施方案中，糖可以是二糖，例如蔗糖。在某些实施方案中，液体制剂还可以包括缓冲剂、表面活性剂和防腐剂中的一者或多者。

在某些实施方案中，液体制剂的pH可以通过添加药学上可接受的酸和/或碱来设定。在某些实施方案中，药学上可接受的酸可以是盐酸。在某些实施方案中，碱可以是氢氧化钠。

除聚集之外，去酰胺化也是常见的在发酵、收获/细胞净化、纯化、原料药/药物产品储存以及样品分析期间可能出现的肽和蛋白质的产物变化型式。在生理条件下，去酰胺化为(NH

在某些实施方案中，可以将本公开的液体制剂保存在pH和湿度的条件下以防止蛋白质产物的去酰胺化。

本文中所关注的水性载剂为药学上可接受(即，对于向人施用安全并且无毒)并且可用于制备液体制剂的水性载剂。说明性载剂包括灭菌注射用水(SWFI)、抑细菌注射用水(BWFI)、pH缓冲溶液(例如，磷酸盐缓冲盐水)、无菌盐水溶液、林格氏溶液(Ringer'ssolution)或右旋糖溶液。

可以任选地将防腐剂添加到本文的制剂中以减少细菌活动。防腐剂的添加可以例如促进多用途(多剂量)制剂的生产。

在特定情况下，静脉内(IV)制剂可以是优选的施用途径，诸如当患者在移植之后在医院中经由静脉内途径接收所有药物时。在某些实施方案中，在施用之前将液体制剂用0.9％氯化钠溶液稀释。在某些实施方案中，用于注射的稀释的药物产品为等张的并且适合于通过静脉内输注进行施用。

在某些实施方案中，可以约10mM至约200mM的量添加盐或缓冲液组分。盐和/或缓冲液为药学上可接受的并且衍生自各种已知酸(无机和有机)与“成碱”金属或胺。在某些实施方案中，缓冲液可以是磷酸盐缓冲液。在某些实施方案中，缓冲液可以是甘氨酸盐、碳酸盐或柠檬酸盐缓冲液，在此情况下，钠离子、钾离子或铵离子可以充当反离子。

可以任选地将防腐剂添加到本文的制剂中以减少细菌活动。添加防腐剂可以例如有助于多用途(即，多剂量)制剂的生产。

本文中所关注的水性载剂为药学上可接受(即，对于向人施用安全并且无毒)并且可用于制备液体制剂的水性载剂。说明性载剂包括SWFI、BWFI、pH缓冲溶液(例如，磷酸盐缓冲盐水)、无菌盐水溶液、林格氏溶液或右旋糖溶液。

本公开可以存在于包括蛋白质和冻干保护剂的冻干制剂中。所述冻干保护剂可以是糖，例如二糖。在某些实施方案中，冻干保护剂可以是蔗糖或麦芽糖。所述冻干制剂还可以包括以下中的一者或多者：缓冲剂、表面活性剂、填充剂和/或防腐剂。

可用于稳定冻干药物产品的蔗糖或麦芽糖的量可以呈至少1:2的蛋白质与蔗糖或麦芽糖的重量比。在某些实施方案中，蛋白质与蔗糖或麦芽糖的重量比可以为1:2至1:5。

在某些实施方案中，在冻干之前，可以通过添加药学上可接受的酸和/或碱来设定冻干制剂的pH。在某些实施方案中，药学上可接受的酸可以是盐酸。在某些实施方案中，药学上可接受的碱可以是氢氧化钠。

在冻干之前，可以将含有本公开的蛋白质的溶液的pH调节为在6至8之间。在某些实施方案中，冻干药物产品的pH范围可以为7至8。

在冻干制剂的某些实施方案中，可以10mM至200mM的量添加盐或缓冲液组分。盐和/或缓冲液为药学上可接受的并且衍生自各种已知酸(无机和有机)与“成碱”金属或胺。在某些实施方案中，缓冲液可以是磷酸盐缓冲液。在某些实施方案中，缓冲液可以是甘氨酸盐、碳酸盐、柠檬酸盐缓冲液，在此情况下，钠离子、钾离子或铵离子可以充当反离子。

在某些实施方案中，可以将“填充剂”添加到冻干制剂中。“填充剂”是为冻干混合物增加质量并且促成冻干饼状物的物理结构(例如，有助于生产维持开孔结构的大体上均匀的冻干饼状物)的化合物。说明性填充剂包括甘露醇、甘氨酸、聚乙二醇和山梨醇。本发明的冻干制剂可以含有这样的填充剂。

可以任选地将防腐剂添加到本文的冻干制剂中以减少细菌活动。添加防腐剂可以例如有助于多用途(即，多剂量)制剂的生产。

在某些实施方案中，可以用水性稀释剂重配冻干的药物产品。本文所关注的水性稀释剂为药学上可接受的(例如，对于向人施用安全并且无毒)并且可用于在冻干之后制备重配的液体制剂的水性载剂。说明性稀释剂包括SWFI、BWFI、pH缓冲溶液(例如，磷酸盐缓冲盐水)、无菌盐水溶液、林格氏溶液或右旋糖溶液。

在某些实施方案中，将本公开的冻干药物产品用SWFI,USP或0.9％氯化钠注射液,USP重配。在重配期间，将冻干粉末溶解到溶液中。

在某些实施方案中，将本公开的冻干蛋白质产物在SWFI中配到约4.5mL并且用0.9％盐水溶液(氯化钠溶液)稀释。

可以改变本发明的药物组合物中的活性成分的实际剂量水平，以对于特定患者、组合物以及施用模式获得有效实现所需治疗响应而对患者没有毒性的活性成分量。

对于每个患者，具体剂量可以是统一剂量，例如50mg至5000mg的蛋白质。或者，患者的剂量可以根据患者的近似体重或表面积进行调整。确定适当剂量的其他因素可以包括有待治疗或预防的疾病或病症、疾病的严重程度、施用途径以及患者的年龄、性别和医疗状况。确定适当治疗剂量所必需的计算的进一步改进是本领域技术人员常规进行的，尤其是根据本文公开的剂量信息和测定。剂量也可以通过使用已知的用于确定剂量的测定结合适当的剂量-响应数据来确定。可以在监测疾病进展时调整个体患者的剂量。可以测量患者中的可靶向构建体或复合物的血液水平以观测是否需要调节剂量以达到或维持有效浓度。可以使用药物基因组学来确定哪些可靶向构建体和/或复合物及其剂量对给定个体来说最可能有效(参见，例如Schmitz等，(2001)Clinica Chimica Acta；308:43-53,2001；Steimer等，(2001)Clinica ChimicaActa 308:33-41.)。

一般来说，基于体重的剂量为约0.01μg至约100mg/kg体重，诸如约0.01μg至约100mg/kg体重，约0.01μg至约50mg/kg体重，约0.01μg至约10mg/kg体重，约0.01μg至约1mg/kg体重，约0.01μg至约100μg/kg体重，约0.01μg至约50μg/kg体重，约0.01μg至约10μg/kg体重，约0.01μg至约1μg/kg体重，约0.01μg至约0.1μg/kg体重，约0.1μg至约100mg/kg体重，约0.1μg至约50mg/kg体重，约0.1μg至约10mg/kg体重，约0.1μg至约1mg/kg体重，约0.1μg至约100μg/kg体重，约0.1μg至约10μg/kg体重，约0.1μg至约1μg/kg体重，约1μg至约100mg/kg体重，约1μg至约50mg/kg体重，约1μg至约10mg/kg体重，约1μg至约1mg/kg体重，约1μg至约100μg/kg体重，约1μg至约50μg/kg体重，约1μg至约10μg/kg体重，约10μg至约100mg/kg体重，约10μg至约50mg/kg体重，约10μg至约10mg/kg体重，约10μg至约1mg/kg体重，约10μg至约100μg/kg体重，约10μg至约50μg/kg体重，约50μg至约100mg/kg体重，约50μg至约50mg/kg体重，约50μg至约10mg/kg体重，约50μg至约1mg/kg体重，约50μg至约100μg/kg体重，约100μg至约100mg/kg体重，约100μg至约50mg/kg体重，约100μg至约10mg/kg体重，约100μg至约1mg/kg体重，约1mg至约100mg/kg体重，约1mg至约50mg/kg体重，约1mg至约10mg/kg体重，约10mg至约100mg/kg体重，约10mg至约50mg/kg体重，或约50mg至约100mg/kg体重。

可以每天、每周、每月或每年或甚至每2至20年给予一次或更多次剂量。本领域一般技术人员可以基于所测量的可靶向构建体或复合物在体液或组织中的滞留时间和浓度而容易地估计给药重复率。本发明的施用可以为静脉内、动脉内、腹膜内、肌肉内、皮下、胸膜内、鞘内、腔内、通过导管灌注或通过直接病损内注射。这种施用可以是每天一次或更多次、每周一次或更多次、每月一次或更多次或每年一次或更多次地施用。

以上说明书描述了本发明的多个方面和实施方案。专利申请具体地涵盖各方面和实施方案的所有组合和排列。

实施例

现在正一般性描述的本发明，通过以下实施例将更容易被理解，包括所述实施例仅仅是出于说明本发明的某些方面和实施方案，并不旨在限制本发明。

实施例1-NKG2D结合结构域结合到NKG2D

将人、小鼠或食蟹猴NKG2D胞外域的核酸序列与编码人IgG1 Fc结构域的核酸序列融合并且引入要表达的哺乳动物细胞中。在纯化之后，将NKG2D-Fc融合蛋白吸附到微板的孔。在用牛血清白蛋白阻断孔以防止非特异性结合之后，将NKG2D结合结构域滴定并添加到预先吸附有NKG2D-Fc融合蛋白的孔中。使用二抗检测一抗结合，所述二抗缀合到辣根过氧化物酶并且特异性地识别人κ轻链以避免Fc交叉反应性。将辣根过氧化物酶的底物3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)添加到孔中以目视观察结合信号，在450nM下测量其吸光度并且在540nM下校正。将NKG2D结合结构域克隆、同种型对照或阳性对照(包含选自SEQ ID NO:101-104的重链和轻链可变结构域，或抗小鼠NKG2D克隆MI-6和CX-5，eBioscience,San Diego,CA)添加到每个孔。

同种型对照显示与重组NKG2D-Fc蛋白质的最少结合，而阳性对照与重组抗原结合最强。由所有克隆产生的NKG2D结合结构域均证实在人、小鼠和食蟹猴重组NKG2D-Fc蛋白质中的结合，不过在克隆与克隆之间具有不同的亲和力。通常，每种抗NKG2D克隆以相似亲和力结合到人(图3)和食蟹猴(图4)重组NKG2D-Fc，但对小鼠(图5)重组NKG2D-Fc具有较低亲和力。

将EL4小鼠淋巴瘤细胞系工程化以表达人或小鼠NKG2D-CD3ξ信号传导结构域嵌合抗原受体。以100nM浓度使用NKG2D结合克隆、同种型对照或阳性对照以对EL4细胞上表达的细胞外NKG2D进行染色。使用荧光团缀合的抗人IgG二抗检测抗体结合。通过流式细胞术对细胞进行分析，并且与亲本EL4细胞相比，使用表达NKG2D的细胞的平均荧光强度(MFI)来计算相较于背景的倍数(FOB)。

由所有克隆产生的NKG2D结合结构域均结合到表达人和小鼠NKG2D的EL4细胞。阳性对照抗体(包含选自SEQ ID NO:101-104的重链和轻链可变结构域，或抗小鼠NKG2D克隆MI-6和CX-5eBioscience,San Diego,CA)给出最佳FOB结合信号。在表达人NKG2D(图6)和小鼠NKG2D(图7)的细胞之间，每种克隆的NKG2D结合亲和力是相似的。

实施例2-NKG2D结合结构域阻断天然配体与NKG2D的结合

将重组人NKG2D-Fc蛋白吸附到微板的孔，并用牛血清白蛋白阻断孔以减少非特异性结合。将饱和浓度的ULBP-6-His-生物素添加到孔，随后添加NKG2D结合结构域克隆。在2小时孵育之后，将孔洗涤并且通过缀合至辣根过氧化物酶的链霉亲和素和TMB底物检测仍与NKG2D-Fc涂覆的孔结合的ULBP-6-His-生物素。在450nM下测量吸光度，并在540nM下校正。在减去背景之后，由被阻断与孔中的NKG2D-Fc蛋白结合的ULBP-6-His-生物素的百分比来计算NKG2D结合结构域与NKG2D-Fc蛋白的特异性结合。阳性对照抗体(包含选自SEQ IDNO:101-104的重链和轻链可变结构域)和各种NKG2D结合结构域阻断ULBP-6与NKG2D的结合，而同种型对照显示几乎不与ULBP-6竞争(图8)。

ULBP-6序列由SEQ ID NO:141表示

将重组人MICA-Fc蛋白吸附到微板的孔，并用牛血清白蛋白阻断孔以减少非特异性结合。将NKG2D-Fc-生物素添加到孔，然后添加NKG2D结合结构域。在孵育和洗涤之后，使用链霉亲和素-HRP和TMB底物检测仍与MICA-Fc涂覆的孔结合的NKG2D-Fc-生物素。在450nM下测量吸光度，并在540nM下校正。在减去背景之后，由被阻断与MICA-Fc涂覆的孔结合的NKG2D-Fc-生物素的百分比来计算NKG2D结合结构域与NKG2D-Fc蛋白质的特异性结合。阳性对照抗体(包含选自SEQ ID NO:101-104的重链和轻链可变结构域)和各种NKG2D结合结构域阻断MICA与NKG2D的结合，而同种型对照显示几乎不与MICA竞争(图9)。

将重组小鼠Rae-1δ-Fc(R&D Systems；Minneapolis,MN)吸附到微板的孔，并且用牛血清白蛋白阻断孔以减少非特异性结合。将小鼠NKG2D-Fc-生物素添加到孔，然后添加NKG2D结合结构域。在孵育和洗涤之后，使用链霉亲和素-HRP和TMB底物检测仍与Rae-1δ-Fc涂覆的孔结合的NKG2D-Fc-生物素。在450nM下测量吸光度，并在540nM下校正。在减去背景之后，由被阻断与Rae-1δ-Fc涂覆的孔结合的NKG2D-Fc-生物素的百分比来计算NKG2D结合结构域与NKG2D-Fc蛋白质的特异性结合。阳性对照(包含选自SEQ ID NO:101-104的重链和轻链可变结构域，或抗小鼠NKG2D克隆MI-6和CX-5，eBioscience,San Diego,CA)和各种NKG2D结合结构域克隆阻断Rae-1δ与小鼠NKG2D的结合，而同种型对照抗体显示几乎不与Rae-1δ竞争(图10)。

实施例3-NKG2D结合结构域克隆活化NKG2D

将人和小鼠NKG2D的核酸序列与编码CD3ξ信号传导结构域的核酸序列融合以获得嵌合抗原受体(CAR)构建体。然后，使用Gibson组装将NKG2D-CAR构建体克隆到逆转录病毒载体中，并转染到expi293细胞中以产生逆转录病毒。将EL4细胞用含有NKG2D-CAR以及8μg/mL聚凝胺的病毒感染。感染后24小时，通过流式细胞术分析EL4细胞中NKG2D-CAR的表达水平，并选择在细胞表面表达高水平NKG2D-CAR的克隆。

为了确定NKG2D结合结构域是否活化NKG2D，使它们吸附到微板的孔，并且在存在布雷菲德菌素-A(brefeldin-A)和莫能菌素(monensin)的情况下在抗体片段涂覆的孔上将NKG2D-CAR EL4细胞培养4小时。通过流式细胞术测定细胞内TNF-α产生，即NKG2D活化的指示。将TNF-α阳性细胞的百分比归一化至用阳性对照处理的细胞。所有NKG2D结合结构域均活化人NKG2D(图11)与小鼠NKG2D(图12)两者。

实施例4-NKG2D结合结构域活化NK细胞

使用密度梯度离心从人外周血血沉棕黄层中分离出外周血单核细胞(PBMC)。用磁珠使用负选择从PBMC中分离出NK细胞(CD3

从C57Bl/6小鼠获得脾脏并且通过70μm细胞筛(cell strainer)压碎以获得单细胞悬浮液。使细胞沉淀并且再悬浮于ACK溶解缓冲液(Thermo Fisher Scientific#A1049201,Carlsbad,CA；155mM氯化铵、10mM碳酸氢钾、0.01mM EDTA)中以去除红细胞。将剩余细胞用100ng/mL hIL-2培养72小时，然后收获并且准备用于NK细胞分离。然后用磁珠使用反向贫化(negative depletion)技术以从脾细胞分离出NK细胞(CD3

实施例5-NKG2D结合结构域增强针对靶肿瘤细胞的细胞毒性

人和小鼠原代NK细胞活化测定证实在与NKG2D结合结构域一起孵育之后NK细胞上的细胞毒性标记增加。为了解决这是否转化为增加的肿瘤细胞溶解，利用基于细胞的测定，其中将每个NKG2D结合结构域发展成单特异性抗体。使用Fc区作为一个靶向臂，而Fab区(NKG2D结合结构域)充当另一靶向臂来活化NK细胞。将来源于人并且表达高水平的Fc受体的THP-1细胞用作肿瘤靶并且使用Perkin Elmer

阳性对照ULBP-6(NKG2D的天然配体)显示小鼠NK细胞对THP-1靶细胞的特异性溶解增加。NKG2D抗体也使THP-1靶细胞的特异性溶解增加，而同种型对照抗体显示特异性溶解减少。虚线指示在不添加抗体的情况下小鼠NK细胞对THP-1细胞的特异性溶解(图17)。

实施例6-NKG2D抗体具有高热稳定性

使用差示扫描荧光测定法测定NKG2D结合结构域的解链温度。相对于典型IgG1抗体，NKG2D结合结构域的外推表观解链温度为高的(图18)。

实施例7-通过使NKG2D与CD16交联对人NK细胞的协同活化

使用密度梯度离心从外周人血血沉棕黄层中分离出外周血单核细胞(PBMC)。使用负选择磁珠(StemCell Technologies,Vancouver,Canada；登录号17955)从PBMC中纯化NK细胞。如通过流式细胞术所测定，NK细胞为＞90％CD3

为了研究受体组合的相对效能，通过板结合的刺激进行NKG2D或CD16的交联以及两种受体的共交联。

如图19中所示，在用抗CD16、抗NKG2D或两种单克隆抗体的组合进行板结合的刺激4小时之后分析IL-2活化的NK细胞的CD107a和细胞内IFNγ的表达。CD16和NKG2D的组合刺激导致CD107a

实施例8-结合到表达P-钙粘蛋白(CDH3)的细胞的多特异性结合蛋白和单克隆抗体的评估

使用表达人P-钙粘蛋白(CDH3)的癌细胞系HCT116、H1975和CAL27来评估多特异性结合蛋白的肿瘤抗原结合，所述多特异性结合蛋白具有包含与SEQ ID NO:196相同的重链可变结构域序列和与SEQ ID NO:200相同的轻链可变结构域序列的P-钙粘蛋白(CDH3)结合位点(D153 DB)，或包含与SEQ ID NO:188相同的重链可变结构域序列和与SEQ ID NO:192相同的轻链可变结构域序列的P-钙粘蛋白(CDH3)结合位点(TSP7 DB)。稀释具有相同P-钙粘蛋白(CDH3)结合位点的多特异性结合蛋白或相应单克隆抗体(mAb)，并与细胞一起孵育。使用荧光团缀合的抗人IgG二抗检测结合。通过流式细胞术分析细胞，并且结合表示为对人重组IgG1染色的对照归一化的平均荧光强度(MFI)，以获得相较于背景的倍数(FOB)值。

如图35A至图35C中所示，包括与SEQ ID NO:196相同的重链可变结构域序列和与SEQ ID NO:200相同的轻链可变结构域序列的抗P-钙粘蛋白mAb(D153wtmAb)和具有相同P-钙粘蛋白结合Fab的抗P-钙粘蛋白多特异性结合蛋白(D153 DB)以相似的剂量-响应结合到表达P-钙粘蛋白的人非小细胞肺癌细胞(H1975；图35A)、人结肠直肠癌细胞(HCT116；图35B)和人舌鳞状癌细胞(CAL27；图35C)。与相应mAb相比，多特异性结合蛋白的总体结合信号更高。

类似地，如图36A至图36C中所示，包括与SEQ ID NO:188相同的重链可变结构域序列和与SEQ ID NO:192相同的轻链可变结构域序列的抗P-钙粘蛋白mAb(TSP7wtmAb)和具有相同P-钙粘蛋白结合Fab的抗P-钙粘蛋白多特异性结合蛋白(TSP7 DB)以相似的剂量响应结合表达P-钙粘蛋白的H1975细胞(图36A)、HCT116细胞(图36B)和CAL27细胞(图36C)。

实施例9-通过多特异性结合蛋白增强NK细胞介导的P-钙粘蛋白(CDH3)

KHYG1-CD16V细胞通过在KHYG1细胞中异位表达CD16的高亲和性V158等位基因而产生。将细胞维持在补充有10％热灭活的胎牛血清、1X GlutaMAX

使用密度梯度离心从人外周血血沉棕黄层中分离PBMC。洗涤分离的PBMC并准备用于NK细胞分离。用磁珠使用负选择分离出NK细胞。如通过流式细胞术所测定，NK细胞为＞90％CD3

从培养物中收获表达P-钙粘蛋白的人癌细胞系。将细胞用PBS洗涤，并且以10

将50μl稀释的P-钙粘蛋白mAb或抗P-钙粘蛋白双体(duobody)多特异性结合蛋白添加到指定孔中。从培养物中收获KHYG1-CD16V或纯化的原代NK细胞，洗涤并以1×10

共培养后，通过以200X G离心5分钟使细胞沉淀。将20μl培养物上清液转移到干净的微板中，并向每个孔中添加200μl室温铕溶液。保护微板使其不受光影响并且在板振荡器上在250rpm下孵育15分钟。用SpectraMax i3X仪器(Molecular Devices，San Jose，CA)读取微板。如下计算特异性溶解％：

特异性溶解％＝((实验释放-自发释放)

/(最大释放-自发释放))×100％。

如图37中所示，抗P-钙粘蛋白多特异性结合蛋白刺激KHYG1-CD16V介导的针对人癌细胞的细胞毒性。图37A显示具有包含与SEQ ID NO:196相同的重链可变结构域序列和与SEQ ID NO:200相同的轻链可变结构域序列的P-钙粘蛋白(CDH3)结合位点的多特异性结合蛋白(D153 DB)刺激KHYG1-CD16V介导的针对H1975癌细胞的细胞毒性。类似地，图37B显示具有包含与SEQ ID NO:188相同的重链可变结构域序列和与SEQ ID NO:192相同的轻链可变结构域序列的P-钙粘蛋白(CDH3)结合位点的多特异性结合蛋白(TSP7DB)刺激KHYG1-CD16V介导的针对H1975癌细胞的细胞毒性。图37C显示具有包含与SEQ ID NO:196相同的重链可变结构域序列和与SEQ ID NO:200相同的轻链可变结构域序列的P-钙粘蛋白(CDH3)结合位点的多特异性结合蛋白(D153 DB)刺激KHYG1-CD16V介导的针对CAL27癌细胞的细胞毒性。类似地，图37D显示具有包含与SEQ ID NO:188相同的重链可变结构域序列和与SEQ IDNO:192相同的轻链可变结构域序列的P-钙粘蛋白(CDH3)结合位点的多特异性结合蛋白(TSP7 DB)刺激KHYG1-CD16V介导的针对CAL27癌细胞的细胞毒性。

尽管抗P-钙粘蛋白双体多特异性结合蛋白刺激靶细胞溶解，但具有相同P-钙粘蛋白结合位点的相应mAb不展示任何细胞毒性活性(图37A至图37D)。

如图38、图39、图40和图41中所示，具有包含与SEQ ID NO:196相同的重链可变结构域序列和与SEQ ID NO:200相同的轻链可变结构域序列的P-钙粘蛋白(CDH3)结合位点的多特异性结合蛋白(D153DB)刺激原代人NK细胞针对表达P-钙粘蛋白的人癌细胞的细胞毒性活性。图38显示抗P-钙粘蛋白多特异性结合蛋白(D153 DB)刺激从供体47897(图38A)、供体59165(图38B)和供体48892(图38C)分离的原代人NK细胞针对表达P-钙粘蛋白的H1975人癌细胞的细胞毒性活性。类似地，图39显示抗P-钙粘蛋白多特异性结合蛋白(D153 DB)刺激从供体47897(图39A)和供体45054(图39B)分离的原代人NK细胞针对表达P-钙粘蛋白的DU145人癌细胞的细胞毒性活性。图40显示抗P-钙粘蛋白多特异性结合蛋白(D153 DB)也刺激从供体47897(图40A)和供体45054(图40B)分离的原代人NK细胞针对表达P-钙粘蛋白的H1650人癌细胞的细胞毒性活性。图41显示抗P-钙粘蛋白多特异性结合蛋白(D153 DB)也刺激从供体59165(图41A)和供体47897(图41B)分离的原代人NK细胞分别针对表达P-钙粘蛋白的CAL27人癌细胞和HCC1954人癌细胞的细胞毒性活性。

类似地，如图42A至图42C所示，具有包含与SEQ ID NO:188相同的重链可变结构域序列和与SEQ ID NO:192相同的轻链可变结构域序列的P-钙粘蛋白(CDH3)结合位点的多特异性结合蛋白(TSP7DB)刺激供体纯化的原代人NK细胞针对表达P-钙粘蛋白的H1975(图42A)、H1650(图42B)和HCC1954(图42C)人癌细胞的细胞毒性活性。

两种抗P-钙粘蛋白多特异性结合蛋白比具有相同P-钙粘蛋白结合位点的相应mAb更有效地刺激靶癌细胞的溶解。

以引用的方式并入

本文中所提及的每一个专利文献和科技文章的全部公开内容出于全部目的通过引用并入本文。

等价方案

在不脱离本发明的精神或基本特征的情况下，本发明能以其他具体形式来实施。因此，前述实施方案在所有方面都应被视为说明性的，而非是对本文中描述的本发明的限制。因此，本发明的范围由随附的权利要求书而不是上面的描述指明，并且旨在将进入权利要求书的意义和等价性范围内的所有变化涵盖在其中。

序列表

<110> 蜻蜓疗法股份有限公司(DRAGONFLY THERAPEUTICS, INC.)

<120> 结合NKG2D、CD16和肿瘤相关抗原的蛋白质

<130> DFY-054WO

<140>

<141>

<150> 62/667,844

<151> 2018-05-07

<160> 229

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 117

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 1

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<210> 2

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<223> 人工序列的描述：合成多肽

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<223> 人工序列的描述：合成多肽

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<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 14

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<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

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<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

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<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

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<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

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<223> 人工序列的描述：合成多肽

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<220>

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<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

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<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

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<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 31

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<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 32

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<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 33

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 34

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<212> PRT

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<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 35

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<212> PRT

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<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 36

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<211> 117

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<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 37

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<210> 38

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 38

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<211> 117

<212> PRT

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<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 39

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 40

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 41

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<211> 113

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 42

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

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Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

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Lys

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Gly

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<223> 人工序列的描述：合成多肽

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Asp Val

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<223> 人工序列的描述：合成多肽

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Ala

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<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 49

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<223> 人工序列的描述：合成多肽

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<223> 人工序列的描述：合成多肽

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Val

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<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 85

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<223> 人工序列的描述：合成多肽

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Gly

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<220>

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<223> 人工序列的描述：合成多肽

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<220>

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<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 93

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Asp Val Trp Gly Lys Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

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<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 94

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Gly

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<223> 人工序列的描述：合成多肽

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<213> 智人(Homo sapiens)

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Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Leu Thr Ser Tyr

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<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 125

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<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 126

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<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 127

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<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 128

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<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 129

Gln His Phe Tyr Asp Thr Pro Trp Thr

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 130

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Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ile Ser Gly Asp Ser Val Ser Ser Gln

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Ser Ala Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Ser Pro Ser Arg Gly Leu Glu

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Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Glu Gly Tyr Gly Arg Glu Gly Phe Ala Ile

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 131

Ser Gln Ser Ala Ala Trp Asn

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<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 132

Arg Ile Tyr Tyr Arg Ser Lys Trp Tyr Asn Asp Tyr Ala Leu Ser Val

1 5 10 15

Lys Ser

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<212> PRT

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<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 133

Gly Glu Gly Tyr Gly Arg Glu Gly Phe Ala Ile

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 134

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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Thr Ile Ser Asn Thr

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<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 135

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<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 136

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 137

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<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 138

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210 215 220

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245 250 255

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260 265 270

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275 280 285

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355 360 365

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420 425 430

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450 455 460

Glu Asp Pro Asp Lys Glu Asn Gln Lys Ile Ser Tyr Arg Ile Leu Arg

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485 490 495

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Leu Leu Leu Leu Val Arg Lys Lys Arg Lys Ile Lys Glu Pro Leu Leu

675 680 685

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<210> 139

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<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 139

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Glu Ala Glu Val Thr Leu Glu Ala Gly Gly Ala Glu Gln Glu Pro Gly

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Gln Ala Leu Gly Lys Val Phe Met Gly Cys Pro Gly Gln Glu Pro Ala

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<223> 人工序列的描述：合成多肽

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<220>

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<220>

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<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

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<220>

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<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

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<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 176

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<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 177

Gly Ala Pro Val Gly Ala Ala Ala Gly Trp Phe Asp Pro

1 5 10

<210> 178

<211> 122

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<220>

<221> MOD_RES

<222> (102)..(102)

<223> Met, Leu, Ile, Val, Gln, or Phe

<400> 178

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Ser Ser Ser Ser Ser Tyr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Ala Pro Xaa Gly Ala Ala Ala Gly Trp Phe Asp Pro Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 179

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 179

Ser Tyr Ser Met Asn

1 5

<210> 180

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<220>

<221> MOD_RES

<222> (6)..(6)

<223> Met, Leu, Ile, Val, Gln, or Phe

<400> 180

Ala Arg Gly Ala Pro Xaa Gly Ala Ala Ala Gly Trp Phe Asp Pro

1 5 10 15

<210> 181

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<220>

<221> MOD_RES

<222> (4)..(4)

<223> Met, Leu, Ile, Val, Gln, or Phe

<400> 181

Gly Ala Pro Xaa Gly Ala Ala Ala Gly Trp Phe Asp Pro

1 5 10

<210> 182

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 182

Gly Asp Ser Val Ser Ser Gln Ser Ala

1 5

<210> 183

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 183

Tyr Tyr Arg Ser Lys Trp Tyr

1 5

<210> 184

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 184

Gly Glu Gly Tyr Gly Arg Glu Gly Phe Ala Ile

1 5 10

<210> 185

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 185

Ser Gln Thr Ile Ser Asn Thr

1 5

<210> 186

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 186

Ala Ala Ser

1

<210> 187

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 187

Tyr Leu Ser Trp Phe

1 5

<210> 188

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 188

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ala Tyr

20 25 30

Asn Met His Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Phe Ile Asp Pro Tyr Ser Gly Ile Ile Thr Tyr Asn Gln Thr Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Arg Gly Tyr Tyr Asp Gly Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ser

115 120

<210> 189

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 189

Gly Tyr Ser Phe Thr Ala Tyr Asn Met His

1 5 10

<210> 190

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 190

Ile Asp Pro Tyr Ser Gly Ile Ile Thr

1 5

<210> 191

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 191

Arg Gly Tyr Tyr Asp Gly Gly Phe Asp Tyr

1 5 10

<210> 192

<211> 109

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 192

Asp Ile Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser

1 5 10 15

Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Thr

20 25 30

Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu

35 40 45

Leu Ile Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu

65 70 75 80

Glu Gln Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Asp Ser Lys His

85 90 95

Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 193

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 193

Arg Ala Ser Gln Asp Ile Thr Asn Tyr Leu Asn

1 5 10

<210> 194

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 194

Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser

1 5

<210> 195

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 195

Gln Gln Asp Ser Lys His Pro Arg Thr

1 5

<210> 196

<211> 118

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 196

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Ser Ala Tyr Asn Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Leu

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Thr Ile Asp Thr Ala Asn Ala Phe Gly Ile Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Met Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 197

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 197

Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Gly Ile Ser

1 5 10

<210> 198

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 198

Trp Ile Ser Ala Tyr Asn Gly Asn Thr Asn

1 5 10

<210> 199

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 199

Ile Asp Thr Ala Asn Ala Phe Gly Ile

1 5

<210> 200

<211> 110

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 200

Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Ala Ala Pro Gly Gln

1 5 10 15

Lys Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn

20 25 30

Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Asp Asn Asn Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Thr Leu Gly Ile Thr Gly Leu Gln

65 70 75 80

Thr Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asp Ser Ser Leu

85 90 95

Ser Gly Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

100 105 110

<210> 201

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 201

Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn Tyr Val Ser

1 5 10

<210> 202

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 202

Asp Asn Asn Lys Arg Pro Ser

1 5

<210> 203

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 203

Gly Thr Trp Asp Ser Ser Leu Ser Gly Val Val

1 5 10

<210> 204

<211> 118

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 204

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr

20 25 30

Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Arg Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Gly Ser Gly Ser Gly Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Met Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 205

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 205

Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr Tyr Met His

1 5 10

<210> 206

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 206

Arg Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn

1 5 10

<210> 207

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 207

Gly Ser Gly Ser Gly Ala Phe Asp Ile

1 5

<210> 208

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 208

Ala Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Lys Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Ile Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Thr Ala Ser Thr Leu Gln Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Val Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Phe Asn Thr Pro Arg

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 209

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 209

Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Lys Tyr Leu Asn

1 5 10

<210> 210

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 210

Thr Ala Ser Thr Leu Gln Thr

1 5

<210> 211

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 211

Gln Gln Ser Phe Asn Thr Pro Arg Thr

1 5

<210> 212

<211> 118

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 212

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Ser Ser Ser Asp Arg Thr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 213

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 213

Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Gly Met His

1 5 10

<210> 214

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 214

Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr

1 5 10

<210> 215

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 215

Ser Ser Ser Asp Arg Thr Phe Asp Tyr

1 5

<210> 216

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 216

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly

1 5 10 15

Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser

20 25 30

Asp Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Arg Arg Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Asp Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Gly

85 90 95

Thr His Trp Pro Pro Leu Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 217

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 217

Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser Asp Gly Asn Thr Tyr Leu His

1 5 10 15

<210> 218

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 218

Lys Val Ser Asn Arg Asp Ser

1 5

<210> 219

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 219

Met Gln Gly Thr His Trp Pro Pro Leu

1 5

<210> 220

<211> 117

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 220

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Asp Thr Asn Ser Ala Lys Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr Met

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 221

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 221

Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met Ser

1 5 10

<210> 222

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 222

Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr

1 5 10

<210> 223

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 223

Thr Asn Ser Ala Lys Phe Asp Pro

1 5

<210> 224

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 224

Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln

1 5 10 15

Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Asn Asp Val Gly Ala Tyr

20 25 30

Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu

35 40 45

Ile Leu Ser Glu Val Asn Lys Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe

50 55 60

Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Ser Ile Ser Gly Leu

65 70 75 80

Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Thr Ser Tyr Thr Met Gly

85 90 95

Ser Thr Phe Met Leu Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

100 105 110

<210> 225

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 225

Thr Gly Thr Ser Asn Asp Val Gly Ala Tyr Asn Tyr Val Ser

1 5 10

<210> 226

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 226

Thr Ser Tyr Thr Met Gly Ser Thr Phe Met Leu

1 5 10

<210> 227

<211> 117

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 227

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Thr Ile Ala Pro Gly Arg Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr Met

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 228

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 228

Ile Ala Pro Gly Arg Phe Asp Pro

1 5

<210> 229

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 229

Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Pro Pro Gly Gln

1 5 10 15

Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Asn Asp Val Gly Ala Tyr

20 25 30

Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu

35 40 45

Ile Leu Ser Glu Val Asn Lys Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe

50 55 60

Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Ser Ile Ser Gly Leu

65 70 75 80

Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Thr Ser Tyr Thr Met Gly

85 90 95

Ser Thr Phe Met Leu Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

100 105 110