一种犬巴贝斯虫BcMSA1-BcSA1重组蛋白及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于动物病毒抗体检测领域，具体地，涉及一种犬巴贝斯虫BcMSA1-BcSA1重组蛋白及其制备方法和应用。

背景技术

巴贝斯虫(Babesia)属于巴贝斯虫属，该属包括90多种巴贝斯虫，目前已报道有多个种类的巴贝斯虫可感染犬，主要有韦氏巴贝斯虫(B.vogeli)、吉氏巴贝斯虫(B.gibsoni)、犬巴贝斯虫(B.canis)、罗氏巴贝斯虫(B.rossi)和双芽巴贝斯虫(B.bigemina)等。其中犬巴贝斯虫的虫体大小为3～5μm，以单个或成对的形式存在。

巴贝斯虫可引起组织和器官损伤，会损伤狗的红细胞，患病狗的尿液会变红色，还会出现高烧、贫血、迅速消瘦等症状，若未及时诊治，患犬会有死亡的风险。一般来说，该病的潜伏期通常为7～8天，多者为10天以上。因此能够快速简单的诊断犬是否受到巴贝斯虫的感染是减少患犬死亡的一种重要的手段。

目前临床中较为直接的诊断方法为静脉采血后进行血涂片染色法，间接荧光抗体试验(Indirect fluorescence antibody，IFA)和酶联免疫吸附试验(Enzyme-Linkedimmunosorbent assay，ELISA)等免疫学方法，此外PCR(聚合酶链式反应)法也是一种常用于巴贝斯虫的诊断，是用于诊断巴贝斯虫病最为敏感和特异性较高的检测方法。但是上述的免疫荧光法、酶联免疫吸附试验(ELISA)、聚合酶链反应(PCR)技术等方法需要使用指定的仪器设备、具备相应的试验条件和技能，难以在基层推广。胶体金标记免疫分析法是近年兴起并快速发展的一种新型分析技术，其特点是快捷简便、成本低、无污染且无需培训，与传统方法相比更为适合现场检测，具有显色时间短、无需昂贵仪器等优点，有广阔的市场前景和应用价值。

然而，目前针对血清学试验检测巴贝斯虫病感染的检测方法和工具仍具有较大局限性。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：

本发明第一方面提供一种犬巴贝斯虫BcMSA1-BcSA1重组蛋白，包括SEQ ID NO.1所示氨基酸序列。

在本发明中，重组蛋白也叫融合蛋白或重组融合蛋白，是通过DNA重组技术得到的两个基因重组后的表达产物。

BcMSA1(Babesia.canis Merozoite Surface Antigen 1，巴贝斯虫裂殖子表面抗原1)和BcSA1(Babesia.canis Secreted Antigen 1，巴贝斯虫分泌抗原1)蛋白是犬巴贝斯虫主要的免疫原蛋白，可诱发和启动机体免疫系统产生免疫应答。将BcMSA1与BcSA1蛋白主要抗原表位融合在一起表达并进行抗体检测，不仅能够提高诊断的灵敏度，还能减少与其他病原体的交叉反应。

在本发明的一些实施方案中，优选地，所述重组蛋白由SEQ ID NO.1所示氨基酸序列组成。

本发明的第二方面提供一种编码本发明第一方面所述重组蛋白的基因，其包括SEQ ID NO.2所示核苷酸序列。

该基因序列是为了在大肠杆菌中表达所述重组蛋白，根据大肠杆菌对密码子的偏好性，对密码子进行了优化。不同物种对同义密码子的使用频率是不同的，而这种密码子偏好性对翻译过程有影响。如果一条mRNA有很多成簇的稀有密码子，这会对核糖体的运动速度造成负面影响，大大降低蛋白表达水平。在此对基因序列进行密码子优化，适用于大肠杆菌表达，可以提高蛋白表达效率。

本发明的第三方面提供一种表达载体，其包括本发明第二方面所述的基因。

在本发明的一些实施方案中，所述表达载体为pET30a，其具有卡那霉素抗性，表达的融合蛋白具有组氨酸(His)标签。

本发明的第四方面提供一种宿主细胞，其含有本发明第三方面所述的表达载体。

进一步地，所述宿主细胞为真核宿主细胞或原核宿主细胞。

在本发明的一些实施方案中，所述宿主细胞为原核宿主细胞。优选地，所述宿主细胞为大肠杆菌，更优选地，大肠杆菌为BL21。利用大肠杆菌进行表达具有周期短、费用低、表达量大等优点。

本发明的第五方面提供一种制备本发明第一方面所述重组蛋白的方法，包括诱导本发明第四方面所述宿主细胞进行蛋白表达的步骤。

进一步地，所述宿主细胞为真核宿主细胞或原核宿主细胞。

在本发明的一些实施方案中，所述宿主细胞为原核宿主细胞。优选地，所述宿主细胞为大肠杆菌，更优选地，大肠杆菌为BL21。利用大肠杆菌进行表达具有周期短、成本低、表达量大等优点。

在本发明的一些具体实施方案中，诱导大肠杆菌进行蛋白表达的步骤为：

S1，用含50μg/mL卡那霉素的LB培养基37℃培养所述大肠杆菌，

S2，当大肠杆菌培养液OD600至0.5-0.7时，用终浓度为1mM的IPTG进行诱导表达，诱导条件为：25℃，转速200rpm，4h；利用该诱导条件，能够使得重组蛋白更加缓慢地表达，有充分的时间进行空间构象的形成，这对重组蛋白发挥功能具有非常重要的作用。

S3，将培养液于4℃，7000rpm离心10min，收集菌体；

S4，用缓冲液Binding Buffer破碎菌体；

S5，超声破碎菌体，条件为：600w，超声2s，间隔5s，共80-120次；

S6，4℃，12000rpm离心30min收集上清，所述重组蛋白在上清中。

优选地，步骤S2中在大肠杆菌培养液OD600至0.6时进行诱导。

优选地，步骤S5中，超声破碎100次。采用本发明的破碎方法，避免了破碎过于剧烈，造成重组蛋白损失的情况。

在本发明的一些实施方案中，进一步包括对重组蛋白进行纯化的步骤。重组蛋白的纯化方式可以有多种，例如离子交换层析，凝胶过滤层析和亲和层析等方法。在本发明的一些实施方案中，选择亲和层析的方法，由于重组蛋白中加入了His标签，一步纯化能够达到较高的纯度。

在本发明的一些具体实施方案中，将包含重组蛋白的上清过Ni柱，然后用洗脱缓冲液Elution Buffer洗脱得到目的蛋白。

优选地，所述洗脱缓冲液Elution Buffer的配方为：50mM Tris，0.2M Nacl，0.5MImidazole，pH8.0。

本发明的第六方面提供本发明第一方面所述的重组蛋白在制备用于检测犬巴贝斯虫抗体的试剂盒中的应用。

本发明的第七方面提供一种用于检测犬巴贝斯虫抗体的试剂盒，包括本发明第一方面所述的重组蛋白。

进一步地，所述试剂盒还包括鼠IgG和羊抗鼠IgG。

在本发明的一些实施方案中，利用双抗原夹心金标法检测犬巴贝斯虫抗体。

在本发明的一些具体实施方案中，所述试剂盒包括双抗原夹心金标法检测条，所述检测条的试剂方法如下：

S1，分别制备重组蛋白胶体金复合物和鼠IgG胶体金复合物；

S2，将所述重组蛋白胶体金复合物和鼠IgG胶体金复合物混合，制备金标垫；

S3，利用重组蛋白作为检测线，利用羊抗鼠IgG作为质控线，划在硝酸纤维素膜上；

S4，将滤纸、含有硝酸纤维素膜的聚酯板、金标垫和样本垫安装在底板上，其中滤纸叠加一部分压在聚酯板上，聚酯板叠加一部分压在金标垫上，金标垫叠加一部分压在样本垫上，在聚酯板上分别有测试区和质控区，测试区有检测线(T线)，质控区有质控线(C线)，检测线靠近金标垫，质控线靠近滤纸，即制备得到检测条。

在使用时，滴加生物样本至样本垫处，室温放置10min后判定检测结果，判定标准如下：

①两条带出现，其中一条位于质控区，另一条位于测试区，为阳性；

②仅质控线出现一条带，在测试区内无条带出现，为阴性；

③质控线未出现条带，表明此测试条已损坏，无论检测线是否出现条带，均应当更换新试纸条重新测试。

在本发明的一些实施方案中，犬巴贝斯虫抗体检测结果呈阳性，代表个体生物样本中含有犬巴贝斯虫抗体，意味着个体具有犬巴贝斯虫感染或曾被犬巴贝斯虫感染。

在本发明的一些实施方案中，所述生物样本为血清或血浆，或任何其他可能包含抗体的体液。

本发明的有益效果

相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：

BcMSA1和BcSA1蛋白可诱发和启动机体免疫系统产生免疫应答，因此以BcMSA1和BcSA1融合蛋白进行抗体检测，不仅能够提高检测的灵敏度，还能减少与其他病原体的交叉反应，特异性强，具有巨大的临床意义和和广泛的应用前景。

本发明采用的胶体金标记免疫分析法是一种新型分析技术，具有快捷简便、成本低、无污染且无需培训的特点，与传统方法相比更为适合现场检测,具有显色时间短、无需昂贵仪器等优点，有广阔的市场前景和应用价值。

附图说明

图1示出了犬巴贝斯虫BcMSA1-BcSA1融合蛋白纯化的凝胶电泳结果。1：细胞破碎后上样；2：流穿；3：50mM Imidazole洗脱；4：0.5M Imidazole洗脱。

图2示出了本发明一个实施例的检测试纸条的试剂图。1：样本垫；2：金标垫；3：NC膜；31：检测线(T线)；32：质控线(C线)；4：滤纸；5：底板。

图3示出了本发明的一个实施例利用试纸条进行检测的结果示意图。T：检测线，C：质控线。

图4示出了利用本发明的试纸条对临床犬血清样本进行检测的总体结果。

具体实施方式

为了使本发明所解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。

实施例

以下例子在此用于示范本发明的优选实施方案。本领域内的技术人员会明白，下述例子中披露的技术代表发明人发现的可以用于实施本发明的技术，因此可以视为实施本发明的优选方案。但是本领域内的技术人员根据本说明书应该明白，这里所公开的特定实施例可以做很多修改，仍然能得到相同的或者类似的结果，而非背离本发明的精神或范围。

除非另有定义，所有在此使用的技术和科学的术语，和本发明所属领域内的技术人员所通常理解的意思相同，在此公开引用及他们引用的材料都将以引用的方式被并入。

那些本领域内的技术人员将意识到或者通过常规试验就能了解许多这里所描述的发明的特定实施方案的许多等同技术。这些等同将被包含在权利要求书中。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的仪器设备，如无特殊说明，均为实验室常规仪器设备；下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

实施例1犬巴贝斯虫BcMSA1-BcSA1融合蛋白基因表达载体的构建

犬巴贝斯虫BcMSA1基因是根据NCBI Gene bank:KR134351的蛋白序列设计的。根据对蛋白亲疏水性(

BcMSA1-BcSA1重组蛋融合白的氨基酸序列序列如下(SEQ ID NO.1)：

MMLLFALSTLVTFAFCDGENTILLSNVEFHTPVSSVKLLKEYSSNQESMAVIMMLTEMPNTSGKLTDGKVHPHNFILIFQLLATMGNAQSTSSQENSRDGLREVLEYTNQLHNNYGSAVRKVTDKLKNEIDVYCKSTDDKGYYFANGSFGYFRKALNDSFNFRFQLLSNYNDYRKYKTRFQDTDDEAEKHVKYLKENLFDLFGTLSYMYFQCSHKCQKYNGGKWEEQSMNQSGSEVSKWLMGSNSAATDSVHFLGRDFSTSELTNIKGKELADKDRASLSDLIKYSGRGNLQHALFWMLFIGPWVDGKTGH

由于不同物种对同义密码子的使用频率是不同的，而这种密码子偏好性对翻译过程有影响。如果一条mRNA有很多成簇的稀有密码子，这会对核糖体的运动速度造成负面影响，大大降低蛋白表达水平。

本发明利用大肠杆菌作为表达系统，为了获得更高的表达效率和更高的表达量，在进行外源蛋白表达时进行了密码子优化，反翻译成核苷酸序列，得到的核苷酸序列如下(SEQ ID NO.2)：

ATGATGCTGCTGTTTGCGCTGAGCACCCTGGTGACCTTTGCGTTTTGCGATGGCGAAAACACCATTCTGCTGAGCAACGTGGAATTTCATACCCCGGTGAGCAGCGTGAAACTGCTGAAAGAATATAGCAGCAACCAGGAAAGCATGGCGGTGATTATGATGCTGACCGAAATGCCGAACACCAGCGGCAAACTGACCGATGGCAAAGTGCATCCGCATAACTTTATTCTGATTTTTCAGCTGCTGGCGACCATGGGCAACGCGCAGAGCACCAGCAGCCAGGAAAACAGCCGCGATGGCCTGCGCGAAGTGCTGGAATATACCAACCAGCTGCATAACAACTATGGCAGCGCGGTGCGCAAAGTGACCGATAAACTGAAAAACGAAATTGATGTGTATTGCAAAAGCACCGATGATAAAGGCTATTATTTTGCGAACGGCAGCTTTGGCTATTTTCGCAAAGCGCTGAACGATAGCTTTAACTTTCGCTTTCAGCTGCTGAGCAACTATAACGATTATCGCAAATATAAAACCCGCTTTCAGGATACCGATGATGAAGCGGAAAAACATGTGAAATATCTGAAAGAAAACCTGTTTGATCTGTTTGGCACCCTGAGCTATATGTATTTTCAGTGCAGCCATAAATGCCAGAAATATAACGGCGGCAAATGGGAAGAACAGAGCATGAACCAGAGCGGCAGCGAAGTGAGCAAATGGCTGATGGGCAGCAACAGCGCGGCGACCGATAGCGTGCATTTTCTGGGCCGCGATTTTAGCACCAGCGAACTGACCAACATTAAAGGCAAAGAACTGGCGGATAAAGATCGCGCGAGCCTGAGCGATCTGATTAAATATAGCGGCCGCGGCAACCTGCAGCATGCGCTGTTTTGGATGCTGTTTATTGGCCCGTGGGTGGATGGCAAAACCGGCCAT

由生工生物工程(上海)股份有限公司合成重组基因序列，并与pET30a质粒连接，形成重组表达载体。

实施例2犬巴贝斯虫BcMSA1-BcSA1融合蛋白的表达

将巴贝斯虫BcMSA1-BcSA1融合基因质粒转化至大肠杆菌BL21中，涂布于含50μg/mL卡那霉素(上海生工，货号：K0408)的LB平板上，37℃过夜培养，挑取单克隆菌落，用含有相同浓度的卡那霉素的300mL LB培养基37℃培养至OD600达0.6左右，用终浓度为1mM的IPTG(上海生工，货号：IB0168)进行诱导表达，诱导条件为：25℃，转速200rpm，4h。诱导之后，将培养液4℃，转速7000rpm，离心10min，收集菌体。

实施例3犬巴贝斯虫BcMSA1-BcSA1融合蛋白的纯化及复性

用50mL上样缓冲液Binding Buffer(50mM Tris，0.2M Nacl，pH8.0)50mL破碎菌体；然后超声破碎，条件为600w，超声2s，间隔5s，共100次；最后12000rpm，30min，4℃离心收集上清，目的蛋白在上清中。接着过Ni柱一步纯化，用洗脱缓冲液Elution Buffer(50mMTris，0.2M Nacl，0.5M Imidazole，pH8.0)洗脱目的蛋白。利用PAGE凝胶电泳检测目的蛋白，结果如图1所示。

由图1可知，纯化后的融合蛋白纯度很高，将纯化后的重组蛋白用透析缓冲液(50mM Tris，0.2M Nacl，pH8.0)透析，每隔12h换一次透析液，共3次。取出透析后的蛋白液，经0.22μm滤器过滤后，用BCA法测定浓度后，于-20℃保存备用。

实施例4双抗原夹心金标法检测犬巴贝斯虫抗体

1双抗原夹心金标法检测条的制备

1.1胶体金的烧制

在三角烧瓶中加入1000mL超纯水，在磁力加热搅拌器上加热至沸腾，然后加入10％氯金酸(sigma)4mL，再加入10％柠檬酸三钠溶液6mL，继续加热沸腾5min，然后冷却至室温后用0.22μm过滤器过滤胶体金后放置4℃备用。

1.2重组犬巴贝斯虫BcMSA1-BcSA1融合蛋白的标记

取胶体金溶液100mL放入烧杯中，搅拌加入0.2M K

1.3鼠IgG标记

取胶体金溶液100mL放入烧杯中，搅拌加入0.2M K

将上述金标复合物用金标稀释液稀释100倍后与1.2步骤中稀释后的犬巴贝斯虫BcMSA1-BcSA1融合蛋白胶体金复合物混合后浸泡玻璃纤维，37℃烘干4h后即制成金标垫。

1.4重组犬巴贝斯虫BcMSA1-BcSA1融合蛋白的点膜

用点膜稀释液(50mM Tris，2％蔗糖，pH8.5)稀释纯化BcMSA1-BcSA1融合蛋白至0.9mg/mL做为胶体金试纸条的检测线(Test-Line，T线)，用相同稀释液稀释羊抗鼠IgG(杭州隆基生物技术有限公司，货号：PS00901)至0.3mg/mL做为胶体金试纸条的质控线(Control-Line，C线)，将上述两种稀释之后的溶液划线至硝酸纤维素膜上，37℃烘干过夜。

1.5双抗原夹心金标法检测犬巴贝斯虫抗体试纸条的组装

将以上金标垫、包被好原料至硝酸纤维素膜(NC膜)的聚酯板及滤纸、样本垫等安装底板上，组装成犬巴贝斯虫抗体双抗原夹心法检测试纸条。具体安装方式如图2所示：分别将样本垫1、金标垫2、NC膜3和滤纸4安装在底板5上。其中样本垫1叠加一部分压在金标垫2上，金标垫2叠加一部分压在NC膜3上，滤纸4叠加一部分压在NC膜3上。其中NC膜3分为测试区和质控区，测试区设置检测线31(T线)，质控区设置质控线32(C线)，检测线31靠近金标垫2，质控线32靠近滤纸4。

进一步，将组装好的试纸条用切条机切割成3mm条子，然后装入特别制定的塑料卡中，即成为成熟的检测试剂卡。

2双抗原夹心金标法检测巴贝斯虫抗体试纸条/卡的检测

加入90μL待检测样本(犬血清、血浆)至样本加样处(S)，室温放置10min后判定结果，结果判定标准如下(如图3所示)：

①两条带出现，其中一条位于质控区，另一条位于测试区，为阳性；

②仅质控线出现一条带，在测试区内无条带出现，为阴性；

③质控线未出现条带，表明此测试条已损坏，无论检测线是否出现条带，均应当更换新试纸条重新测试。

3双抗原夹心金标法检测犬巴贝斯虫抗体试纸条/卡的检测结果

一共检测25份巴贝斯虫感染阳性犬血清(样本编号1～25)，及47份正常未患病且未经免疫的犬血清(样本编号26～72)，其中T线和C线两条线的表示检测结果为阳性，只有C线一条线的表示检测结果为阴性。

检测结果如表1所示：25份阳性血清中检测出阳性13例，漏检2例(9号样本和17号样本)，在47份阴性血清中出现假阳1例(67号样本)。

表1犬巴贝斯虫抗体检测结果

由此可知，样本检测的灵敏度和特异性分别为92％和97.9％，整体符合率为95.8％，如图4所示。

以上结果表明，利用本发明的重组犬巴贝斯虫BcMSA1-BcSA1融合蛋白检测犬巴贝斯虫，具有非常高的的灵敏度和特异性，可以作为制作犬巴贝斯虫抗体检测试纸条的原料，并可以在临床检测中广泛应用。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 杭州爱谨生物科技有限公司

<120> 一种犬巴贝斯虫BcMSA1-BcSA1重组蛋白及其制备方法和应用

<130> AJ2010245

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 311

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Met Leu Leu Phe Ala Leu Ser Thr Leu Val Thr Phe Ala Phe Cys

1 5 10 15

Asp Gly Glu Asn Thr Ile Leu Leu Ser Asn Val Glu Phe His Thr Pro

20 25 30

Val Ser Ser Val Lys Leu Leu Lys Glu Tyr Ser Ser Asn Gln Glu Ser

35 40 45

Met Ala Val Ile Met Met Leu Thr Glu Met Pro Asn Thr Ser Gly Lys

50 55 60

Leu Thr Asp Gly Lys Val His Pro His Asn Phe Ile Leu Ile Phe Gln

65 70 75 80

Leu Leu Ala Thr Met Gly Asn Ala Gln Ser Thr Ser Ser Gln Glu Asn

85 90 95

Ser Arg Asp Gly Leu Arg Glu Val Leu Glu Tyr Thr Asn Gln Leu His

100 105 110

Asn Asn Tyr Gly Ser Ala Val Arg Lys Val Thr Asp Lys Leu Lys Asn

115 120 125

Glu Ile Asp Val Tyr Cys Lys Ser Thr Asp Asp Lys Gly Tyr Tyr Phe

130 135 140

Ala Asn Gly Ser Phe Gly Tyr Phe Arg Lys Ala Leu Asn Asp Ser Phe

145 150 155 160

Asn Phe Arg Phe Gln Leu Leu Ser Asn Tyr Asn Asp Tyr Arg Lys Tyr

165 170 175

Lys Thr Arg Phe Gln Asp Thr Asp Asp Glu Ala Glu Lys His Val Lys

180 185 190

Tyr Leu Lys Glu Asn Leu Phe Asp Leu Phe Gly Thr Leu Ser Tyr Met

195 200 205

Tyr Phe Gln Cys Ser His Lys Cys Gln Lys Tyr Asn Gly Gly Lys Trp

210 215 220

Glu Glu Gln Ser Met Asn Gln Ser Gly Ser Glu Val Ser Lys Trp Leu

225 230 235 240

Met Gly Ser Asn Ser Ala Ala Thr Asp Ser Val His Phe Leu Gly Arg

245 250 255

Asp Phe Ser Thr Ser Glu Leu Thr Asn Ile Lys Gly Lys Glu Leu Ala

260 265 270

Asp Lys Asp Arg Ala Ser Leu Ser Asp Leu Ile Lys Tyr Ser Gly Arg

275 280 285

Gly Asn Leu Gln His Ala Leu Phe Trp Met Leu Phe Ile Gly Pro Trp

290 295 300

Val Asp Gly Lys Thr Gly His

305 310

<210> 2

<211> 933

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atgatgctgc tgtttgcgct gagcaccctg gtgacctttg cgttttgcga tggcgaaaac 60

accattctgc tgagcaacgt ggaatttcat accccggtga gcagcgtgaa actgctgaaa 120

gaatatagca gcaaccagga aagcatggcg gtgattatga tgctgaccga aatgccgaac 180

accagcggca aactgaccga tggcaaagtg catccgcata actttattct gatttttcag 240

ctgctggcga ccatgggcaa cgcgcagagc accagcagcc aggaaaacag ccgcgatggc 300

ctgcgcgaag tgctggaata taccaaccag ctgcataaca actatggcag cgcggtgcgc 360

aaagtgaccg ataaactgaa aaacgaaatt gatgtgtatt gcaaaagcac cgatgataaa 420

ggctattatt ttgcgaacgg cagctttggc tattttcgca aagcgctgaa cgatagcttt 480

aactttcgct ttcagctgct gagcaactat aacgattatc gcaaatataa aacccgcttt 540

caggataccg atgatgaagc ggaaaaacat gtgaaatatc tgaaagaaaa cctgtttgat 600

ctgtttggca ccctgagcta tatgtatttt cagtgcagcc ataaatgcca gaaatataac 660

ggcggcaaat gggaagaaca gagcatgaac cagagcggca gcgaagtgag caaatggctg 720

atgggcagca acagcgcggc gaccgatagc gtgcattttc tgggccgcga ttttagcacc 780

agcgaactga ccaacattaa aggcaaagaa ctggcggata aagatcgcgc gagcctgagc 840

gatctgatta aatatagcgg ccgcggcaac ctgcagcatg cgctgttttg gatgctgttt 900

attggcccgt gggtggatgg caaaaccggc cat 933