用于来航鸡鉴定的芯片、引物组合、试剂盒及方法

技术领域

本发明属于生物技术、遗传育种领域，具体涉及一种用于来航鸡鉴定的芯片、引物组合、试剂盒及方法。

背景技术

来航鸡是蛋用型鸡品种，原产意大利。19世纪中叶由意大利来航港传往国外，因而得名。现已在全世界普及，成为蛋用鸡有名的高产品种。来航鸡鸡体轻秀，冠大，母鸡冠多倒向一侧。耳垂、喙、脚和皮肤黄色，产蛋后因色素减退而呈白色。全身羽毛紧密洁白。标准体重成年公鸡2.7千克，母鸡2千克，蛋壳白色。性情活泼，体质强健，无就巢性，早熟，产蛋量高，耗料少。为稳定来航鸡品质，也为了解决品种认定、知识产权纠纷，需要一种对来航鸡种进行有效鉴定的方法。

发明内容

本发明主要目的是提供一种用于来航鸡鉴定的芯片、引物组合、试剂盒及其方法，为来航鸡品种的鉴定提供技术支持。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

本发明提供用于来航鸡种鉴定的特异性遗传位点，其包括以下所述特异性SNP位点：

LH_tag1位于鸡1号染色体183632213处，基因DYNC2H1第43外显子，来航鸡基因型为GG；

LH_tag2位于鸡1号染色体92665001处，基因LOC112530473的上游，来航鸡基因型为TT；

LH_tag3位于鸡2号染色体62893395处，基因ADTRP第1内含子，来航鸡基因型为CC；

LH_tag4位于鸡3号染色体103905207处，基因KLHL29第6内含子，来航鸡基因型为GG；

LH_tag5位于鸡5号染色体56157392处，基因PELI2第1内含子，来航鸡基因型为CC；

LH_tag6位于鸡7号染色体11588952处，基因CDK15第4内含子，来航鸡基因型为AA；

LH_tag7位于鸡10号染色体20503881处，基因VPS33B第10内含子，来航鸡基因型为GG；

LH_tag8位于鸡11号染色体16344468处，基因CDH13第9外显子，来航鸡基因型为AA；

LH_tag9位于鸡13号染色体18049223处，基因ARHGAP26第15内含子，来航鸡基因型为GG；

LH_tag10位于鸡20号染色体5984004处，基因SULF2第3内含子，来航鸡基因型为AA；

LH_tag11位于鸡21号染色体4896455处，基因CDA的UTR5区域，来航鸡基因型为TT；

LH_tag12位于鸡24号染色体3222659处，基因UBASH3B的上游，来航鸡基因型为GG。

LH_tag13位于鸡21号染色体3603551处，基因DAP3第2内含子，来航鸡基因型为CC；

LH_tag15位于鸡33号染色体5790191处，基因SMARCD1第9内含子，来航鸡基因型为CC；

LH_tag16位于鸡NW_020110165.1连锁群1665853处，基因LOC112531368的UTR5区域，来航鸡基因型为CC。

进一步地，还包括以下特异性INDEL位点：LH_tag14位于鸡27号染色体6112700处，基因UBE2Z第1内含子，来航鸡基因型为--(突变基因型型为AGA//AGA)。

本发明提供一种鉴定来航鸡的方法，采用以下特异性位点的一种或几种进行鉴定：

LH_tag1位于鸡1号染色体183632213处，基因DYNC2H1第43外显子，来航鸡基因型为GG；

LH_tag2位于鸡1号染色体92665001处，基因LOC112530473的上游，来航鸡基因型为TT；

LH_tag3位于鸡2号染色体62893395处，基因ADTRP第1内含子，来航鸡基因型为CC；

LH_tag4位于鸡3号染色体103905207处，基因KLHL29第6内含子，来航鸡基因型为GG；

LH_tag5位于鸡5号染色体56157392处，基因PELI2第1内含子，来航鸡基因型为CC；

LH_tag6位于鸡7号染色体11588952处，基因CDK15第4内含子，来航鸡基因型为AA；

LH_tag7位于鸡10号染色体20503881处，基因VPS33B第10内含子，来航鸡基因型为GG；

LH_tag8位于鸡11号染色体16344468处，基因CDH13第9外显子，来航鸡基因型为AA；

LH_tag9位于鸡13号染色体18049223处，基因ARHGAP26第15内含子，来航鸡基因型为GG；

LH_tag10位于鸡20号染色体5984004处，基因SULF2第3内含子，来航鸡基因型为AA；

LH_tag11位于鸡21号染色体4896455处，基因CDA的UTR5区域，来航鸡基因型为TT；

LH_tag12位于鸡24号染色体3222659处，基因UBASH3B的上游，来航鸡基因型为GG。

LH_tag13位于鸡21号染色体3603551处，基因DAP3第2内含子，来航鸡基因型为CC；

LH_tag14位于鸡27号染色体6112700处，基因UBE2Z第1内含子，来航鸡基因型为--(突变基因型型为AGA//AGA)；

LH_tag15位于鸡33号染色体5790191处，基因SMARCD1第9内含子，来航鸡基因型为CC；

LH_tag16位于鸡NW_020110165.1连锁群1665853处，基因LOC112531368的UTR5区域，来航鸡基因型为CC；

若待测鸡基因型与所述来航鸡基因型相同，则待测鸡为来航鸡。

本发明还提供检测以上所述特异性遗传位点的引物，其包括：

用于检测所述标记LH_tag1的引物LH_P1f和LH_P1r：

LH_P1f：GCAACATCTCATCTTACTACAG；

LH_P1r：GAATACCACATCACATCTACAG；

用于检测所述标记LH_tag2的引物LH_P2f和LH_P2r：

LH_P2f：GTGAGGAAGGTGTGAGATG；

LH_P2r：TGGCTGGACTTGATGACT；

用于检测所述标记LH_tag3的引物LH_P3f和LH_P3r：

LH_P3f：TCCTCCTACCATCTTCTCTAA；

LH_P3r：AACTCCATTCTTGCTCTTCA；

用于检测所述标记LH_tag4的引物LH_P4f和LH_P4r：

LH_P4f：CTATCCGACATTCTTCTCCA；

LH_P4r：GATTATACCAACGCCTTCTG；

用于检测所述标记LH_tag5的引物LH_P5f和LH_P5r：

LH_P5f：CGTTATCCAATAGGCACAGT；

LH_P5r：TGAGCAGACTTAGCACTTAC；

用于检测所述标记LH_tag6的引物LH_P6f和LH_P6r：

LH_P6f：AAGTTCAAGGAGACCATACA；

LH_P6r：ACTACTGACATACGCTTAGG；

用于检测所述标记LH_tag7的引物LH_P7f和LH_P7r：

LH_P7f：CAGTAAGGATATAGAGCAGGTA；

LH_P7r：GAATAACAAGGAGGATGAAGG；

用于检测所述标记LH_tag8的引物LH_P8f和LH_P8r：

LH_P8f：GGAGTCACAGGAGTAATAGTAA；

LH_P8r：CAGGCAGGTTGTTATCACT；

用于检测所述标记LH_tag9的引物LH_P9f和LH_P9r：

LH_P9f：ATGTGCCTTATCATCCAGAA；

LH_P9r：TGAAGCAGCAACAACTCTA；

用于检测所述标记LH_tag10的引物LH_P10f和LH_P10r：

LH_P10f：AGTGGTCTTCCTTCTTCATT；

LH_P10r：AATTCACCTCGCAGTCAG；

用于检测所述标记LH_tag11的引物LH_P11f和LH_P11r：

LH_P11f：TTAGCCTATATCTCAGCCTTAC；

LH_P11r：CACCTTCCATGCCATTCC；

用于检测所述标记LH_tag12的引物LH_P12f和LH_P12r：

LH_P12f：TTGAACTGTCGGCTTACG；

LH_P12r：ATCCTCTTCCTCCTCTCAC；

用于检测所述标记LH_tag13的引物LH_P13f和LH_P13r：

LH_P13f：TGGTGCTCACTGACATCA；

LH_P13r：ACACAGGTCCACAATAACG；

用于检测所述标记LH_tag14的引物LH_P14f和LH_P14r：

LH_P14f：GTTGTGCCAGAAGAGGTT；

LH_P14r：CTGAAGGAAGAGGAAGAACT；

用于检测所述标记LH_tag15的引物LH_P15f和LH_P15r：

LH_P15f：GAACTTGCTCTCCTGACTC；

LH_P15r：CACTGCTATCCAACATCTCA；

用于检测所述标记LH_tag16的引物LH_P16f和LH_P16r：

LH_P16f：CAGGAATGGCAGTGATGT；

LH_P16r：AGAAGAAGGATATGAGGAGTG。

本发明还提供以上所述引物在鉴定来航鸡中的应用。

本发明还提供一种用于来航鸡鉴定的芯片，所述芯片可鉴定以上所述特异性遗传位点。

本发明还提供一种引物组合，所述引物组合包括以下任意一对或几对引物的组合：引物LH_P1f和LH_P1r；引物LH_P2f和LH_P2r；引物LH_P3f和LH_P3r；引物LH_P4f和LH_P4r；引物LH_P5f和LH_P5r；引物LH_P6f和LH_P6r；引物LH_P7f和LH_P7r；引物LH_P8f和LH_P8r；LH_tag9的引物LH_P9f和LH_P9r；引物LH_P10f和LH_P10r；引物LH_P11f和LH_P11r；引物LH_P12f和LH_P12r；引物LH_P13f和LH_P13r；引物LH_P14f和LH_P14r；引物LH_P15f和LH_P15r；引物LH_P16f和LH_P16r。

本发明还提供一种试剂盒，其包括以上所述引物组合。

本发明还提供以上所述芯片、引物组合及试剂盒在鉴定来航鸡种中的应用。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明筛选得到了关于来航鸡的多个品种特异性遗传位点，包括多个特异性SNP位点和一个特异性INDEL位点。本发明首次筛选到关于来航鸡的特异性INDEL位点，且所述INDEL位点用于来航鸡品种鉴定率分别高达96.67％，能够实际有效地将来航鸡鉴定出来。同时，本发明筛选得到的特异性SNP位点对来航鸡的鉴定也具有较高的鉴定率。因此，将本发明所述特异性遗传位点进行组合，可有效用于来航鸡的鉴定。本发明所述特异性遗传位点对来航鸡及非来航鸡均具有较高的鉴定率，鉴定结果更为可靠。

本发明还提供了各特异性遗传位点的检测引物及其组合，所述引物特异性强，准确率高，更有利于大规模推广用于来航鸡的鉴定。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作和/或它们的组合。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。

实施例1来航鸡特异性遗传位点

所述来航鸡特异性遗传位点具体如下：

LH_tag1位于鸡1号染色体183632213处，基因DYNC2H1第43外显子，来航鸡基因型为GG；

LH_tag2位于鸡1号染色体92665001处，基因LOC112530473的上游，来航鸡基因型为TT；

LH_tag3位于鸡2号染色体62893395处，基因ADTRP第1内含子，来航鸡基因型为CC；

LH_tag4位于鸡3号染色体103905207处，基因KLHL29第6内含子，来航鸡基因型为GG；

LH_tag5位于鸡5号染色体56157392处，基因PELI2第1内含子，来航鸡基因型为CC；

LH_tag6位于鸡7号染色体11588952处，基因CDK15第4内含子，来航鸡基因型为AA；

LH_tag7位于鸡10号染色体20503881处，基因VPS33B第10内含子，来航鸡基因型为GG；

LH_tag8位于鸡11号染色体16344468处，基因CDH13第9外显子，来航鸡基因型为AA；

LH_tag9位于鸡13号染色体18049223处，基因ARHGAP26第15内含子，来航鸡基因型为GG；

LH_tag10位于鸡20号染色体5984004处，基因SULF2第3内含子，来航鸡基因型为AA；

LH_tag11位于鸡21号染色体4896455处，基因CDA的UTR5区域，来航鸡基因型为TT；

LH_tag12位于鸡24号染色体3222659处，基因UBASH3B的上游，来航鸡基因型为GG。

LH_tag13位于鸡21号染色体3603551处，基因DAP3第2内含子，来航鸡基因型为CC；

LH_tag14位于鸡27号染色体6112700处，基因UBE2Z第1内含子，来航鸡基因型为--(突变基因型为AGA//AGA)；

LH_tag15位于鸡33号染色体5790191处，基因SMARCD1第9内含子，来航鸡基因型为CC；

LH_tag16位于鸡NW_020110165.1连锁群1665853处，基因LOC112531368的UTR5区域，来航鸡基因型为CC。

Mark2位于鸡2号染色体42001877处，基因CPNE4第1内含子，来航鸡基因型为TT；

Mark3位于3号染色体106951439处，基因XKR6第1内含子，来航鸡基因型为TTTCAGGCTG//TTTCAGGCTG；

Mark6位于鸡6号染色体28545382处，基因NHLRC2第9内含子，来航鸡基因型为GG；

Mark15位于鸡15号染色体3415724处，基因STX2第1内含子/基因ADGRD1第13内含子，来航鸡基因型为AA。

其中，LH_tag14为INDEL位点，其它均为SNP位点。

检测以上所述特异性遗传位点的引物：

用于检测所述标记LH_tag1的引物LH_P1f和LH_P1r；

用于检测所述标记LH_tag2的引物LH_P2f和LH_P2r；

用于检测所述标记LH_tag3的引物LH_P3f和LH_P3r；

用于检测所述标记LH_tag4的引物LH_P4f和LH_P4r；

用于检测所述标记LH_tag5的引物LH_P5f和LH_P5r；

用于检测所述标记LH_tag6的引物LH_P6f和LH_P6r；

用于检测所述标记LH_tag7的引物LH_P7f和LH_P7r；

用于检测所述标记LH_tag8的引物LH_P8f和LH_P8r；

用于检测所述标记LH_tag9的引物LH_P9f和LH_P9r；

用于检测所述标记LH_tag10的引物LH_P10f和LH_P10r；

用于检测所述标记LH_tag11的引物LH_P11f和LH_P11r；

用于检测所述标记LH_tag12的引物LH_P12f和LH_P12r；

用于检测所述标记LH_tag13的引物LH_P13f和LH_P13r；

用于检测所述标记LH_tag14的引物LH_P14f和LH_P14r；

用于检测所述标记LH_tag15的引物LH_P15f和LH_P15r；

用于检测所述标记LH_tag16的引物LH_P16f和LH_P16r；

用于检测所述标记Mark2的引物为Mark_P2f和Mark_P2r所示两条单链DNA；

用于检测所述标记Mark3的引物为Mark_P3f和Mark_P3r所示两条单链DNA；

用于检测所述标记Mark6的引物为Mark_P6f和Mark_P6r所示两条单链DNA；

用于检测所述标记Mark15的引物为Mark_P15f和Mark_P15r所示两条单链DNA；

以上所述引物长度、扩增片段长度及退火温度，如下表1所示。

表1.检测来航鸡品种特异性标记所用扩增引物

采用以上所述特异性遗传位点及引物对30份来航鸡血样和350份非来航鸡血样进行鉴定。具体操作步骤如下：

以CTAB法提取380份血液样品基因组DNA，经紫外分光光度计检测、琼脂糖电泳检测合格后进行PCR扩增。

PCR扩增过程：

1)反应体系：10μl体系包括鉴定材料DNA模板50ng，正、反向引物各lOng，5μL 2×power Taq MasterMix，剩余体积用超纯水补足；

2)反应程序：首先94℃变性30s，51.3-57.9℃退火30s，72℃延伸30s，共5个循环；接着94℃变性30s，50.8-57.4℃退火30s，72℃延伸30s，共30个循环；72℃延伸5min，4℃保存。

扩增产物送至测序公司进行DNA序列多态性检测。对于INDELs标记，也可选择毛细管电泳检测片段扩增长度，作为基因分型依据。各特异性位点的鉴定率如下表2所示。

表2.来航鸡品种特异性标记鉴定率

由表2可知，LH_tag1-LH_tag16所述特异性遗传位点对来航鸡的鉴定率高，因此，基于其一种或多种特异性位点组合可用于对来航鸡的鉴定。而其它特异性位点Mark2、Mark3、Mark6、Mark15，由于对来航鸡的鉴定率低而淘汰。

实施例2用于鉴定来航鸡的芯片

所述芯片可鉴定以下来航鸡特异性位点：

LH_tag1位于鸡1号染色体183632213处，基因DYNC2H1第43外显子，来航鸡基因型为GG；

LH_tag2位于鸡1号染色体92665001处，基因LOC112530473的上游，来航鸡基因型为TT；

LH_tag3位于鸡2号染色体62893395处，基因ADTRP第1内含子，来航鸡基因型为CC；

LH_tag4位于鸡3号染色体103905207处，基因KLHL29第6内含子，来航鸡基因型为GG；

LH_tag5位于鸡5号染色体56157392处，基因PELI2第1内含子，来航鸡基因型为CC；

LH_tag6位于鸡7号染色体11588952处，基因CDK15第4内含子，来航鸡基因型为AA；

LH_tag7位于鸡10号染色体20503881处，基因VPS33B第10内含子，来航鸡基因型为GG；

LH_tag8位于鸡11号染色体16344468处，基因CDH13第9外显子，来航鸡基因型为AA；

LH_tag9位于鸡13号染色体18049223处，基因ARHGAP26第15内含子，来航鸡基因型为GG；

LH_tag10位于鸡20号染色体5984004处，基因SULF2第3内含子，来航鸡基因型为AA；

LH_tag11位于鸡21号染色体4896455处，基因CDA的UTR5区域，来航鸡基因型为TT；

LH_tag12位于鸡24号染色体3222659处，基因UBASH3B的上游，来航鸡基因型为GG。

LH_tag13位于鸡21号染色体3603551处，基因DAP3第2内含子，来航鸡基因型为CC；

LH_tag14位于鸡27号染色体6112700处，基因UBE2Z第1内含子，来航鸡基因型为--(突变基因型为AGA//AGA)；

LH_tag15位于鸡33号染色体5790191处，基因SMARCD1第9内含子，来航鸡基因型为CC；

LH_tag16位于鸡NW_020110165.1连锁群1665853处，基因LOC112531368的UTR5区域，来航鸡基因型为CC。

实施例3一种鉴定来航鸡的方法

通过鉴定以下特异性位点：

LH_tag1位于鸡1号染色体183632213处，基因DYNC2H1第43外显子，来航鸡基因型为GG；

LH_tag2位于鸡1号染色体92665001处，基因LOC112530473的上游，来航鸡基因型为TT；

LH_tag3位于鸡2号染色体62893395处，基因ADTRP第1内含子，来航鸡基因型为CC；

LH_tag4位于鸡3号染色体103905207处，基因KLHL29第6内含子，来航鸡基因型为GG；

LH_tag5位于鸡5号染色体56157392处，基因PELI2第1内含子，来航鸡基因型为CC；

LH_tag6位于鸡7号染色体11588952处，基因CDK15第4内含子，来航鸡基因型为AA；

LH_tag7位于鸡10号染色体20503881处，基因VPS33B第10内含子，来航鸡基因型为GG；

LH_tag8位于鸡11号染色体16344468处，基因CDH13第9外显子，来航鸡基因型为AA；

LH_tag9位于鸡13号染色体18049223处，基因ARHGAP26第15内含子，来航鸡基因型为GG；

LH_tag10位于鸡20号染色体5984004处，基因SULF2第3内含子，来航鸡基因型为AA；

LH_tag11位于鸡21号染色体4896455处，基因CDA的UTR5区域，来航鸡基因型为TT；

LH_tag12位于鸡24号染色体3222659处，基因UBASH3B的上游，来航鸡基因型为GG。

LH_tag13位于鸡21号染色体3603551处，基因DAP3第2内含子，来航鸡基因型为CC；

LH_tag14位于鸡27号染色体6112700处，基因UBE2Z第1内含子，来航鸡基因型为--(突变型基因为AGA//AGA)；

LH_tag15位于鸡33号染色体5790191处，基因SMARCD1第9内含子，来航鸡基因型为CC；

LH_tag16位于鸡NW_020110165.1连锁群1665853处，基因LOC112531368的UTR5区域，来航鸡基因型为CC。

若待测鸡基因型与所述来航鸡基因型相同，则待测鸡为来航鸡。

实施例4一种鉴定来航鸡的方法

通过鉴定以下特异性位点：

LH_tag3位于鸡2号染色体62893395处，基因ADTRP第1内含子，来航鸡基因型为CC；

LH_tag4位于鸡3号染色体103905207处，基因KLHL29第6内含子，来航鸡基因型为GG；

LH_tag5位于鸡5号染色体56157392处，基因PELI2第1内含子，来航鸡基因型为CC；

LH_tag6位于鸡7号染色体11588952处，基因CDK15第4内含子，来航鸡基因型为AA；

LH_tag7位于鸡10号染色体20503881处，基因VPS33B第10内含子，来航鸡基因型为GG；

LH_tag8位于鸡11号染色体16344468处，基因CDH13第9外显子，来航鸡基因型为AA；

LH_tag10位于鸡20号染色体5984004处，基因SULF2第3内含子，来航鸡基因型为AA；

LH_tag11位于鸡21号染色体4896455处，基因CDA的UTR5区域，来航鸡基因型为TT；

LH_tag12位于鸡24号染色体3222659处，基因UBASH3B的上游，来航鸡基因型为GG。

LH_tag14位于鸡27号染色体6112700处，基因UBE2Z第1内含子，来航鸡基因型为--突变型基因为AGA//AGA；

LH_tag15位于鸡33号染色体5790191处，基因SMARCD1第9内含子，来航鸡基因型为CC；

若待测鸡基因型与所述来航鸡基因型相同，则待测鸡为来航鸡。

实施例5一种引物组合

所述引物组合由以下引物对组成：引物LH_P1f和LH_P1r；引物LH_P2f和LH_P2r；引物LH_P3f和LH_P3r；引物LH_P4f和LH_P4r；引物LH_P5f和LH_P5r；引物LH_P6f和LH_P6r；引物LH_P7f和LH_P7r；引物LH_P8f和LH_P8r；LH_tag9的引物LH_P9f和LH_P9r；引物LH_P10f和LH_P10r；引物LH_P11f和LH_P11r；引物LH_P12f和LH_P12r；引物LH_P13f和LH_P13r；引物LH_P14f和LH_P14r；引物LH_P15f和LH_P15r；引物LH_P16f和LH_P16r。

利用所述引物组合进行来航鸡特异性分子标记位点鉴定及来航鸡种的鉴定。所述引物组合还可用于制备检测试剂盒。

实施例6一种引物组合

所述引物组合由以下引物对组成：引物LH_P3f和LH_P3r；引物LH_P4f和LH_P4r；引物LH_P5f和LH_P5r；引物LH_P6f和LH_P6r；引物LH_P7f和LH_P7r；引物LH_P8f和LH_P8r；引物LH_P10f和LH_P10r；引物LH_P11f和LH_P11r；引物LH_P12f和LH_P12r；引物LH_P14f和LH_P14r；引物LH_P15f和LH_P15r；利用所述引物组合进行来航鸡特异性分子标记位点鉴定及来航鸡种的鉴定。所述引物组合还可用于制备检测试剂盒。

所述引物组合包括了筛选得到的可用于来航鸡鉴定的特异性INDEL、SNP分子标记引物。所述各对引物用于来航鸡鉴定，鉴定率均在90.00％及以上。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。