与非综合征型唇腭裂相关的突变的N4BP2基因及其应用

技术领域

本发明属于医学基因诊断领域，涉及遗传病非综合征型唇腭裂的致病基因N4BP2突变位点及其在基因诊断中的应用。

背景技术

唇腭裂属于最常见的先天性颌面部裂结构性出生缺陷，世界范围新生儿发病率约为1/700。先天性唇腭裂患儿有严重的进食问题、言语困难、中耳感染和牙齿缺陷等表现。

唇腭裂在我国人群中患病率较高(1.42/1000)。唇腭裂可根据是否伴发其他畸形分为综合征型唇腭裂和非综合征型唇腭裂。其中，非综合征性唇腭裂更为常见，包括单发唇裂、腭裂或唇裂合并腭裂三种形式存在，占整个面裂畸形的70％以上。面部发育起源于神经嵴细胞迁移增殖，唇裂是由于面部发育时上颌突与内侧鼻突融合失败造成的；腭骨发育期源于胚胎时期的间充质与上皮细胞分化转化增殖凋亡迁移，腭裂是由于两个腭板的中线融合失败造成的。

非综合征性唇腭裂属于多基因遗传病，迄今为止，国内外研究已发现100余个基因与非综合征性唇腭裂相关，但新的候选基因特定遗传变异的潜在致病机制尚有待明确。对于唇腭裂遗传风险基因研究提示IRF6、BCL-3、MTHFR、PTCH1、BMP4、ZNF533、DLX等多个基因为颌面发育的易感基因。

N4BP2基因作为本研究前期发现的唇腭裂候选基因之一，目前其功能学研究非常有限。N4BP2于2002年首次报道，其可与NEDD4蛋白N末端(52-422aa)结合而命名为NEDD4binding protein 2。NEDD4是一种在胚胎发育过程中神经前体细胞及妊娠中期胚胎软骨细胞中高表达的蛋白，参与重要胚胎发育基因的调控。NEDD4基因敲除小鼠表现由于神经嵴细胞缺乏导致胚胎衍生骨发育和颌面严重畸形，参与TGFβ-MAPK信号通路。研究发现N4BP2在细胞质中均匀分布，与NEDD4相似。N4BP2可由NEDD4蛋白介导发生多泛素化而被蛋白酶体(proteasome)降解。N4BP2蛋白结构N末端拥有多核苷酸激酶(PNK)结构域，可以结合并水解ATP，可作为5'-多核苷酸激酶发挥作用。N4BP2蛋白通过PNK结构域与原癌蛋白BCL-3特异性相互结合，因此N4BP2又称BCL-3binding protein(B3BP)。BCL-3基因多个位点与非综合征型唇腭裂发生相关。BCL-3参与细胞增殖，细胞粘附功能，其下调可导致外胚层发育受到破坏，在面部形成中起重要作用。BCL-3还参与细胞分裂和迁移调控，被筛选为唇腭裂的易感基因。N4BP2亦可通过PNK结构域与组蛋白乙酰化转移酶p300/CBP蛋白结合。p300组蛋白乙酰转移酶活性对于Wnt依赖的间充质细胞增殖和迁移至关重要，人和小鼠中p300功能的丧失会导致颅面缺陷。在原核生物和真核生物细胞中Smr结构域高度保守具有缺口内切酶作用参与基因重组。N4BP2是人类细胞中第一个被发现的带有Smr结构域的蛋白，Smr结构域DNA位于N4BP2蛋白C末端1688-1770aa位置，其最保守的环区参与DNA与单链或双链链接的结合。由于N4BP2具有Smr结构域而拥有了缺口核酸内切酶的功能，从单核苷酸到不成对碱基的延伸环，识别双链DNA错配，可将超螺旋DNA打开为有缺口的开放环形。N4BP2参与重要的DNA错配修复(MMR)和基因重组(包括有丝分裂和减数分裂)过程，尤其是转录与修复或重组的耦合。2017年，在1995例非综合征型唇腭裂患者及对照者低频变异基因的研究中，发现N4BP2基因的低频编码变异与非综合征型唇腭裂的风险增加相关。以上结果提示N4BP2可能通过多种途径参与唇腭裂出生缺陷的发生发展。

发明内容

本发明的目的是提供与非综合征型唇腭裂相关的突变的N4BP2基因及其应用，本发明对阐明非综合征型唇腭裂的发病机制，丰富非综合征型唇腭裂的致病基因突变谱，及建立这种遗传病基因诊断方法具有重要意义。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

一种与非综合征型唇腭裂相关的突变的NEDD4结合蛋白2(NEDD4 bindingprotein 2，N4BP2)基因，相较于Gene bank登录号为NM_018177.6的未突变的N4BP2基因，突变后的N4BP2基因分别在第13外显子含有一个非移码缺失突变位点4:40133481-40133489delAAGATATTT、在第9外显子含有一个错义突变位点4:40123905T>G和一个错义突变位点4:40122958C>T，突变的N4BP2基因可用于制备检测非综合征型唇腭裂疾病诊断试剂盒。

一种与非综合征型唇腭裂相关的突变的N4BP2，相较于Gene bank登录号为NP_060647.2的未突变的N4BP2，突变后的N4BP2含有p.Lys1531_Phe1533del、p.Thr1076Met和p.Phe1392Val氨基酸突变位点，该突变的N4BP2可用于制备检测非综合征型唇腭裂疾病诊断试剂盒。

一种用于检测与非综合征型唇腭裂相关的突变的N4BP2基因的PCR引物组合物，由上游引物和下游引物组成，所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，该PCR引物组合物可用于制备检测非综合征型唇腭裂疾病诊断试剂盒。该PCR引物组合物仅适用于检测N4BP2基因第13外显子的4:40133481-40133489delAAGATATTT突变位点。

相比于现有技术，本发明具有如下优点：

1、本发明提出了三种新的非综合征型唇腭裂致病基因突变位点，丰富了致病基因突变谱，为阐明非综合征型唇腭裂的发病机制以及针对本病的基因诊断性芯片的设计提供了新数据，可用于携带者筛查和产前基因诊断。

2、该突变位点的发现可以对其家系后代进行优生优育指导，并可以作为非综合征型唇腭裂这种遗传病的携带者筛查和产前诊断筛查位点，用于群体的优生优育的指导。

附图说明

图1为一个4代非综合征型唇腭裂家系，其中，黑色箭头示先证者；黑色符号表示受累状态；斜线表示已过世；

图2为一个2代非综合征型唇腭裂家系；

图3为家系1中受累个体Ⅳ2的PCR产物测序图；

图4为N4BP2过表达质粒及突变质粒转染HEK293T细胞后Western blot结果图；

图5为野生型C57/B6小鼠E12.5和E13.5面部组织切片免疫组化结果图；

图6为小鼠表型图，A-D是体重检测图，E是小鼠背面观比较图，F是X线结果图。

具体实施方式

下面结合附图对本发明的技术方案作进一步的说明，但并不局限于此，凡是对本发明技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的保护范围中。

本发明通过收集非综合征型唇腭裂家系及散发病例信息，对于家系患者绘制系谱，通过对散发患者及家系成员外周血基因组DNA提取、外显子测序技术及对候选致病基因突变位点的PCR扩增及Sanger测序，确认致病基因突变位点。然后针对家系其他患者和正常人进行该位点的检测，确认突变位点是否为导致该家族出现非综合征型唇腭裂的致病原因。具体步骤如下：

1、收集非综合征型唇腭裂患者家系及散发病例

与临床医院合作，按照知情同意的原则，针对非综合征型唇腭裂患者、家系个体及散发患者进行外周血样本的收集，以及基本信息及临床资料整理。绘制家系图谱，判断非综合征型唇腭裂在家族中的遗传方式。

2、基因诊断DNA分析非综合征型唇腭裂致病基因突变

通过对非综合征型唇腭裂患者及家系其他成员外周血基因组DNA提取、外显子测序技术获得候选致病基因突变位点。对候选致病基因突变位点设计引物，对患者及家系其他成员进行PCR扩增及Sanger测序，比对分析，确认致病基因突变位点。

3、体外功能验证

构建N4BP2的过表达质粒(上海吉凯基因化学技术有限公司)，并通过点突变试剂盒构建相应的突变质粒，在体外转染HEK293T细胞系，检测相应突变位点是否会影响N4BP2蛋白的表达及功能。

4、体内功能验证

通过构建N4bp2敲除小鼠(广州赛业生物科技有限公司)，比较敲除小鼠与野生小鼠的表型差异。

在上述研究的基础上，本发明在一个4代非综合征型唇腭裂家系1中检测到患者(先证者)及患者母亲的N4BP2基因第13外显子出现一个非移码缺失突变，即4号染色体上，4:40133481-40133489位点9个碱基AAGATATTT缺失，引起编码的N4BP2的氨基酸赖氨酸(Lys)、异亮氨酸(Ile)和苯丙氨酸(Phe)缺失(GRCh37.p13；NM_018177.6；NP_060647.2)。患者母亲为突变个体，患者父亲为正常人，不带有该突变位点。

本发明在另一个2代非综合征型唇腭裂家系2中检测到患者及其母亲的N4BP2基因第9外显子出现一个错义突变，即4染色体上4:40123905位点由T突变为G，引起编码的氨基酸由苯丙氨酸(Phe)变为缬氨酸(Val)(GRCh37.p13；NM_018177.6；NP_060647.2)。患者母亲为突变个体，患者父亲为正常人，不带有该突变位点。

本发明在两例非综合征型唇腭裂散发病例中检测到患者的N4BP2基因第13外显子出现一个错义突变，即4染色体上4:40122958位点由C突变为T，引起编码的氨基酸由苏氨酸(Thr)变为甲硫氨酸(Met)(GRCh37.p13；NM_018177.6；NP_060647.2)。

因此，本发明提出了三种与非综合征型唇腭裂相关的突变的N4BP2基因和三种与非综合征型唇腭裂相关的突变的N4BP2以及突变的N4BP2基因和突变的N4BP2在制备检测非综合征型唇腭裂疾病诊断试剂盒中的用途。与非综合征型唇腭裂相关的突变的N4BP2基因相较于Gene bank登录号为NM_018177.6的未突变的N4BP2基因，突变后的N4BP2基因的第13外显子含有一个非移码缺失突变位点4:40133481-40133489delAAGATATTT，第9外显子的两个错义突变位点4:40123905T>G和4:40122958C>T。与非综合征型唇腭裂相关的突变的N4BP2相较于Gene bank登录号为NP_060647.2的未突变的N4BP2，突变后的N4BP2含有p.Lys1531_Phe1533del、p.Thr1076Met和p.Phe1392Val氨基酸突变位点。

进一步的，本发明还提出了一种用于检测与非综合征型唇腭裂相关的突变的N4BP2基因的PCR引物组合物及其在制备检测非综合征型唇腭裂疾病诊断试剂盒中的用途。该PCR引物组合物由上游引物和下游引物组成，所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

实施例：

1、收集非综合征型唇腭裂患者家系及散发病例

按照知情同意的原则，收集一个北方地区4代非综合征型唇腭裂家系及33例散发患者，家系中先证者Ⅳ2，女性，主要表现为左侧唇裂。患者母亲也表现为左侧唇裂，父亲表型正常，非近亲结婚。绘制系谱(图1)。33例散发患者中17例为唇裂，16例为腭裂。收集样本包括家系中2名患者(Ⅳ2、Ⅲ17)和1名正常个体(Ⅲ16)及33例散发患者的外周血样本，以及相关基本信息及临床资料等，并予以编号。

2、基因诊断DNA分析非综合征型唇腭裂致病基因突变

将家系1中Ⅳ2患者外周血基因组DNA提取送北京诺禾致源科技股份有限公司进行全外显子测序，获得候选致病基因N4BP2第13外显子突变位点4:40133481-40133489(GRCh37.p7)，突变后的N4BP2第13外显子的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。对候选致病基因突变位点设计引物，引物为：5’-GTGCAAGAGTACTCGTATTAC-3’(SEQ ID NO.1)和5’-CTTGGAATAATACCCACAG-3’(SEQ ID NO.2)。对患者及家系其他个体进行PCR扩增，反应条件为95℃，3min；95℃，30s，60℃，30s，72℃，30s，30个循环；72℃，5min；产物大小416bp。之后PCR产物送北京擎科新业生物技术有限公司(Tsingke Biological Technology)进行Sanger测序，比对分析，发现在患者(Ⅳ2、Ⅲ17)中出现N4BP2基因突变位点，患者及其母亲为N4BP2第13外显子相应碱基位置缺失，其父亲Ⅲ16相应碱基位置AAGATATTT，未发生突变，如图3所示。从该结果可以看出受累个体Ⅳ3的N4BP2基因第13外显子4:40133481-40133489位点存在9个碱基AAGATATTT缺失；受累个体母亲III17的N4BP2基因第13外显子4:40133481-40133489位点也存在9个碱基AAGATATTT缺失；受累个体父亲III16的N4BP2基因第13外显子4:40133481-40133489位点为AAGATATTT，并无缺失(附：家系2受累个体及父母和散发患者均无设计引物进行PCR)。该突变位点导致N4BP2基因编码改变c.4591-4599del；p.Lys1531-Phe1533del，编码蛋白第1531位赖氨酸到1533位苯丙氨酸缺失(NM_018177.6；NP_060647.2)。

家系2，F701为左侧唇裂II°，F703为左侧隐性唇裂，F702表型正常，F701与F703均带有候选致病基因N4BP2第9外显子突变位点4:40123905T>G(GRCh37.p13)，突变后的N4BP2第9外显子的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。该突变位点导致N4BP2基因编码改变c.4174T>G；p.Phe1392Val，编码蛋白第1392位苯丙氨酸变为缬氨酸(NM_018177.6；NP_060647.2)。

两名散发患者CL656ZJJ和CP634LMT分别患有唇裂和软腭裂II°，全外显子测序，获得候选致病基因N4BP2第9外显子突变位点4:40122958C>T(GRCh37.p13)，突变后的N4BP2第9外显子的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。该突变位点导致N4BP2基因编码改变c.3227C>T；p.Thr1076Met，编码蛋白第1076位苏氨酸变为甲硫氨酸(NM_018177.6；NP_060647.2)。

4、遗传学再发风险分析

根据遗传学分析和基因检测结果，由此应该对家系1中育龄女性Ⅲ17再生育、及幼儿Ⅳ2女性患者婚育时、家系2中育龄女性703再生育、及幼儿701女性患者婚育时进行遗传咨询和产前基因检测，以防有患儿出生。即肯定携带者生育时选择正常基因位点胎儿，可以防止致病基因在家族中继续传递。

由此致病基因突变位点的发现，可以对其家系中后代个体进行基因检测，以判断是否为携带者，及再生育患儿发病风险，并可进行产前诊断，对其进行优生优育指导。对丰富非综合征型唇腭裂的致病基因突变谱，及建立基因诊断方法具有重要意义。

5、致病位点体外功能分析

本实施例构建了N4BP2的过表达质粒pCMV-N4BP2，并利用点突变试剂盒在过表达质粒的基础上构建三个位点的突变质粒。利用转染试剂lipo3000将上述质粒分别转染到HEK293T细胞，转染48h后，提取细胞总蛋白，通过Western blot检测N4BP2蛋白表达水平，结果显示，三个突变位点均降低了N4BP2蛋白的表达，如图4所示。其中，4:40122958C>T对蛋白表达的影响最为严重。

6、致病基因体内功能分析

首先，通过免疫组化的方式检测了野生型C57/B6小鼠胚胎E12.5和E13.5及小鼠唇腭部胚胎发育期的N4bp2蛋白的表达情况，结果显示N4bp2蛋白在小鼠E12.5和E13.5的腭间质部高表达，如图5所示。

之后，构建了N4bp2的敲除小鼠，发现N4bp2小鼠具有一定的胚胎致死率，如表1所示。观察小鼠出生后的表型差异，发现，纯和敲除小鼠的体型较小，发育迟缓，且X线结果显示其骨密度低，如图6所示。

表1

序列表

<110> 哈尔滨医科大学

<120> 与非综合征型唇腭裂相关的突变的N4BP2基因及其应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 4911

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 1

atntngtgca agagtactcg tattaccttg gaataatacc cacagaaaag ggagaccctt 60

atgtttgaaa aagattgtgc cactaaacta aaggagaagc agctctttcc agccattaac 120

caaaattttc tggtggacat tttcaaggac cacaacccaa gagacgatga agatattatc 180

tctgaaaaag aagaaaatat tttatcttta tctttgaagc atctagagtt cactgaagag 240

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gacaaaagtg aaaacgagca aatagaaatg gtggctgtaa aagggtatag taaaactgac 480

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actattggtc agaggacaaa aaggaacaga aaaactgaaa aaacttcatc cgtacaaagc 780

gacaaaaagt ataattaccc tcagtcacac aaattagtta acagtgtatc tgtgaataca 840

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tgtgatgatg cttcagagcc actcaatagc tataaatatg atgcttataa aaatattgac 960

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cacagatcaa gaatgccaaa gactggttta agtgagccca acctagaaat tggaacaaat 1080

gacaaaatga atgaaatatc cttatctaca gcacatgagg cctgttgggg cacaagctct 1140

caaaaactaa agacattggg tagctccaat ctaggaagtt ctgaaatgct gctcagtgaa 1200

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cctcttactt ttaccaatag tgcaccaact gtttctggag tagtagaacc acaaacgtta 1320

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attaacacaa aatcagacgt tcaagaagca attccatata gagtaatgta tgataaaagc 1560

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tgtaaactgt ttggatcctt ttcattagaa gccctgaaag acttatatga gaggtgcaat 1680

aaagatatta tttgggccac aagccttttg ttggattctg aaactaagtt atgtgaggat 1740

acagagtttg agaatttcca aaaatcgtgt gatggatcac aaattgggcc tttttctctg 1800

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gtgactggcc ttcatctgat tctttagctc agagggaaca cagatcaaga atgccaaaga 3420

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gctccaatct aggaagttct gaaatgctgc tcagtgaaat gacctgtgag agtcagactt 3600

gtctaagtaa aaagagtcat gggcaacaca catcgttgcc tcttactttt accaatagtg 3660

caccaactgt ttctggagta gtagaaccac aaacgttagc tgaatgtcaa gagcaaatgc 3720

ctaagagaga ccctggaaaa gaagtaggca tgtgcaccca gactgaacca caggattttg 3780

ctcttttatg gaaaatagaa aagaataaaa ttagcatttc agattctatc aaagtattaa 3840

caggaagatt agatggattt aagccgaaag ttttcaatat taacacaaaa tcagacgttc 3900

aagaagcaat tccatataga gtaatgtatg ataaaagcat gtttgttgaa gaaagtgagc 3960

ttaccagtgc agatgaatct gaaaatctta acattctttg taaactgttt ggatcctttt 4020

cattagaagc cctgaaagac ttatatgaga ggtgcaataa agatattatt tgggccacaa 4080

gccttttgtt ggattctgaa actaagttat gtgaggatac agagtttgag aatttccaaa 4140

aatcgtgtga tggatcacaa attgggcctt tttctctggg gttgaatttg aaagaaatta 4200

ttagccaaag aggaacttta gagaattcta attctcctgt gccagagttt agccatggga 4260

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aggcggaaat gagagctgtc actcctgaaa accatgaatc gatgacaagt atatttccca 4380

gtgctgctgt gggtctaaag aataataatg acatacttcc taacagccag gaagaacttt 4440

tatatagcag taagcagtcc tttccaggta ttctaaaagc tactactcct aaagatatga 4500

gtgaaacaga aaaaaaccta gtagtcacag agactggaga caacatacat tctccttcac 4560

atttctctga tatttttaac tttgtatcta gtacttcaaa tcttgaatta aatgaagaaa 4620

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aactggcttt tcaacttaat gaattatttg gtcctgttgg tattgattca g 4911