产气荚膜梭菌毒素抗原浓缩工艺

技术领域

本发明涉及疫苗生产技术领域，具体涉及一种产气荚膜梭菌毒素抗原浓缩工艺。

背景技术

为达到配苗要求，C型产气荚膜梭菌毒素抗原需达到3400MLD/ml，因此需进行浓缩处理。

发明内容

本发明的目的在于提供一种产气荚膜梭菌毒素抗原浓缩工艺。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：

产气荚膜梭菌毒素抗原浓缩工艺，包括如下步骤：

将产气荚膜梭菌培养获得的上清液使用超滤系统进行浓缩，浓缩时进口压力0.1～0.15MPa、回流压力0～0.05MPa，浓缩倍数分别为5～10倍。

值得注意的是，浓缩前，需先测定产气荚膜梭菌培养的毒素的含量，当毒素的含量≥400MLD/ml时，方可进行浓缩。

进一步地，在保证配苗要求的前提下，可适当降低毒素的浓缩倍数，提高浓缩回收率，浓缩倍数优选为5倍。

本发明具有以下有益效果：通过对产气荚膜梭菌毒素抗原的浓缩处理，使得所得的抗原可以达到疫苗生产的需要，同时可以降低疫苗的免疫剂量，便于临床应用，并减少注射母猪的应激反应。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。

试验例

1材料

1.1菌种C型产气荚膜梭菌C59-2 F10代基础种子，由湖北省农业科学院畜牧兽医研究所鉴定、保管和供应。

1.2主要培养基及原材料 大豆蛋白胨购自北京双旋微生物培养基制品厂，货号02-19；水解酪蛋白购自sigma，货号N4517-1KG；酵母浸膏购自北京双旋微生物培养基制品厂，货号02-22；葡萄糖购自国药集团化学试剂有限公司，货号10010518；氨水购自武汉市洪山中南化工试剂有限公司，货号2672。

梭菌液体培养基准确称取大豆蛋白胨15g、水解酪蛋白15g、酵母浸膏5g、葡萄糖5g，溶于950ml纯化水，用2mol/LNaOH调pH值至8.0～8.5，加纯化水定容至1000ml，116℃高压灭菌30分钟，冷却后备用。

1.3试验动物16～20g昆明小鼠，购自武汉生物制品研究所。

2方法

2.1菌液的培养

按“产气荚膜梭菌培养工艺的研究”最优生产工艺进行100L细菌发酵罐菌液的培养，共培养4次。具体的：

产气荚膜梭菌C59-2在35～37℃培养条件，1％～5％接种，培养过程中根据培养菌液pH值的变化，补加氨水，使培养液的pH值维持在7.0～7.4，培养6～10小时收获。

2.2毒素含量的测定菌液培养完成后，取样，离心取上清，测定毒素的含量(MLD/ml)。

2.3毒素浓缩试验当毒素的含量≥400MLD/ml时，方可进行浓缩。为了计算毒素浓缩的回收率，在浓缩前未进行灭活和脱毒处理。培养菌液经管式离心机离心，收集上清液，用于浓缩试验。

2.3.1 10L毒素液的浓缩试验将第1次培养获得的上清液分为4份，每份10L，使用超滤系统进行浓缩，浓缩时进口压力0.1～0.15MPa、回流压力0～0.05MPa，使4份毒素液的浓缩倍数分别为5倍、8倍、10倍、15倍。测定不同浓缩倍数的毒素液含量，并计算浓缩回收率。

2.3.2 10L毒素液浓缩重复性试验将第1次培养获得的上清液分为3份，每份10L，分别进行3次浓缩试验。浓缩倍数5～10倍，浓缩时进口压力0.1～0.15MPa、回流压力0～0.05MPa，根据浓缩前后体积、浓缩前后毒素含量，测定浓缩回收率。

2.3.3 70L毒素液浓缩重复性试验第2～4次培养获得的毒素上清，体积均约70L，进行浓缩试验，浓缩倍数5～10倍，浓缩时进口压力0.1～0.15MPa、回流压力0～0.05MPa，根据浓缩前后体积、浓缩前后毒素含量，测定浓缩回收率。

3结果

3.1毒素含量的测定结果用100L发酵罐培养产气荚膜梭菌C59-2，4次培养的毒素含量分别为800MLD/ml、1000MLD/ml、1250MLD/ml、800MLD/ml(表1)。

表1 C型产气荚膜梭菌毒素含量的测定结果

3.2 10L毒素液的浓缩试验结果浓缩前产气荚膜毒素含量为800MLD/ml，通过超滤浓缩5倍、8倍、10倍和15倍后，其毒素含量分别为3600MLD/ml、5600MLD/ml、6800MLD/ml、8400MLD/ml，均达到了配苗要求(毒素含量应≥3400MLD/ml)，回收率依次92％、87.5％、85％、70.5％，结果见表2。结果表明，随着浓缩倍数的增加，毒素回收率有所下降，因此，在保证配苗要求的前提下，可适当降低毒素的浓缩倍数，提高浓缩回收率。

表2 C型产气荚膜梭菌毒素浓缩效果

3.3 10L毒素液浓缩重复性试验结果浓缩前毒素含量为800MLD/ml，将该毒素进行了3次浓缩性试验，结果表明，浓缩后回收率均在85％以上(表3)。

表3 10L毒素液浓缩重复性试验结果

3.4 70L毒素液浓缩重复性试验结果3批70L毒素液经浓缩后，毒素含量分别为5400MLD/ml、5800MLD/ml、4600MLD/ml，回收率分别为89.2％、91.5％、87.1％，结果见表4。

表4 70L毒素液浓缩重复性试验结果

4结论本试验例用超滤浓缩对毒素进行了浓缩工艺的研究。结果表明，毒素浓缩5～10倍后，其回收率均不低于85％。随着浓缩倍数的增加，毒素回收率有所下降，因此，在保证配苗要求的前提下，可适当降低毒素的浓缩倍数，提高浓缩回收率。试验确定灭活毒素的浓缩倍数为5～10倍，毒素抗原的浓缩回收率按85％计算。

以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变化或修改，这并不影响本发明的实质内容。在不冲突的情况下，本申请的实施例和实施例中的特征可以任意相互组合。