产气荚膜梭菌毒素抗原浓缩工艺
文献发布时间:2023-06-19 10:13:22
技术领域
本发明涉及疫苗生产技术领域,具体涉及一种产气荚膜梭菌毒素抗原浓缩工艺。
背景技术
为达到配苗要求,C型产气荚膜梭菌毒素抗原需达到3400MLD/ml,因此需进行浓缩处理。
发明内容
本发明的目的在于提供一种产气荚膜梭菌毒素抗原浓缩工艺。
为实现上述目的,本发明采取的技术方案为:
产气荚膜梭菌毒素抗原浓缩工艺,包括如下步骤:
将产气荚膜梭菌培养获得的上清液使用超滤系统进行浓缩,浓缩时进口压力0.1~0.15MPa、回流压力0~0.05MPa,浓缩倍数分别为5~10倍。
值得注意的是,浓缩前,需先测定产气荚膜梭菌培养的毒素的含量,当毒素的含量≥400MLD/ml时,方可进行浓缩。
进一步地,在保证配苗要求的前提下,可适当降低毒素的浓缩倍数,提高浓缩回收率,浓缩倍数优选为5倍。
本发明具有以下有益效果:通过对产气荚膜梭菌毒素抗原的浓缩处理,使得所得的抗原可以达到疫苗生产的需要,同时可以降低疫苗的免疫剂量,便于临床应用,并减少注射母猪的应激反应。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明,但不以任何形式限制本发明。应当指出的是,对本领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明构思的前提下,还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。
试验例
1材料
1.1菌种C型产气荚膜梭菌C59-2 F10代基础种子,由湖北省农业科学院畜牧兽医研究所鉴定、保管和供应。
1.2主要培养基及原材料 大豆蛋白胨购自北京双旋微生物培养基制品厂,货号02-19;水解酪蛋白购自sigma,货号N4517-1KG;酵母浸膏购自北京双旋微生物培养基制品厂,货号02-22;葡萄糖购自国药集团化学试剂有限公司,货号10010518;氨水购自武汉市洪山中南化工试剂有限公司,货号2672。
梭菌液体培养基准确称取大豆蛋白胨15g、水解酪蛋白15g、酵母浸膏5g、葡萄糖5g,溶于950ml纯化水,用2mol/LNaOH调pH值至8.0~8.5,加纯化水定容至1000ml,116℃高压灭菌30分钟,冷却后备用。
1.3试验动物16~20g昆明小鼠,购自武汉生物制品研究所。
2方法
2.1菌液的培养
按“产气荚膜梭菌培养工艺的研究”最优生产工艺进行100L细菌发酵罐菌液的培养,共培养4次。具体的:
产气荚膜梭菌C59-2在35~37℃培养条件,1%~5%接种,培养过程中根据培养菌液pH值的变化,补加氨水,使培养液的pH值维持在7.0~7.4,培养6~10小时收获。
2.2毒素含量的测定菌液培养完成后,取样,离心取上清,测定毒素的含量(MLD/ml)。
2.3毒素浓缩试验当毒素的含量≥400MLD/ml时,方可进行浓缩。为了计算毒素浓缩的回收率,在浓缩前未进行灭活和脱毒处理。培养菌液经管式离心机离心,收集上清液,用于浓缩试验。
2.3.1 10L毒素液的浓缩试验将第1次培养获得的上清液分为4份,每份10L,使用超滤系统进行浓缩,浓缩时进口压力0.1~0.15MPa、回流压力0~0.05MPa,使4份毒素液的浓缩倍数分别为5倍、8倍、10倍、15倍。测定不同浓缩倍数的毒素液含量,并计算浓缩回收率。
2.3.2 10L毒素液浓缩重复性试验将第1次培养获得的上清液分为3份,每份10L,分别进行3次浓缩试验。浓缩倍数5~10倍,浓缩时进口压力0.1~0.15MPa、回流压力0~0.05MPa,根据浓缩前后体积、浓缩前后毒素含量,测定浓缩回收率。
2.3.3 70L毒素液浓缩重复性试验第2~4次培养获得的毒素上清,体积均约70L,进行浓缩试验,浓缩倍数5~10倍,浓缩时进口压力0.1~0.15MPa、回流压力0~0.05MPa,根据浓缩前后体积、浓缩前后毒素含量,测定浓缩回收率。
3结果
3.1毒素含量的测定结果用100L发酵罐培养产气荚膜梭菌C59-2,4次培养的毒素含量分别为800MLD/ml、1000MLD/ml、1250MLD/ml、800MLD/ml(表1)。
表1 C型产气荚膜梭菌毒素含量的测定结果
3.2 10L毒素液的浓缩试验结果浓缩前产气荚膜毒素含量为800MLD/ml,通过超滤浓缩5倍、8倍、10倍和15倍后,其毒素含量分别为3600MLD/ml、5600MLD/ml、6800MLD/ml、8400MLD/ml,均达到了配苗要求(毒素含量应≥3400MLD/ml),回收率依次92%、87.5%、85%、70.5%,结果见表2。结果表明,随着浓缩倍数的增加,毒素回收率有所下降,因此,在保证配苗要求的前提下,可适当降低毒素的浓缩倍数,提高浓缩回收率。
表2 C型产气荚膜梭菌毒素浓缩效果
3.3 10L毒素液浓缩重复性试验结果浓缩前毒素含量为800MLD/ml,将该毒素进行了3次浓缩性试验,结果表明,浓缩后回收率均在85%以上(表3)。
表3 10L毒素液浓缩重复性试验结果
3.4 70L毒素液浓缩重复性试验结果3批70L毒素液经浓缩后,毒素含量分别为5400MLD/ml、5800MLD/ml、4600MLD/ml,回收率分别为89.2%、91.5%、87.1%,结果见表4。
表4 70L毒素液浓缩重复性试验结果
4结论本试验例用超滤浓缩对毒素进行了浓缩工艺的研究。结果表明,毒素浓缩5~10倍后,其回收率均不低于85%。随着浓缩倍数的增加,毒素回收率有所下降,因此,在保证配苗要求的前提下,可适当降低毒素的浓缩倍数,提高浓缩回收率。试验确定灭活毒素的浓缩倍数为5~10倍,毒素抗原的浓缩回收率按85%计算。
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是,本发明并不局限于上述特定实施方式,本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变化或修改,这并不影响本发明的实质内容。在不冲突的情况下,本申请的实施例和实施例中的特征可以任意相互组合。
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