一种基于宏基因组测序的真菌定量检测方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种基于宏基因组测序的真菌定量检测方法。

背景技术

近年来，高通量测序技术(又称感染宏基因组测序，meta next generationsequencing，简称mNGS)越来越多地应用于病原菌检测，该方法不仅不依赖于传统培养，而且可以一次性检测样本环境中的所有微生物遗传信息，对于提供病原菌的分型信息和丰度信息，具有其他方法不可比拟的优势。

mNGS技术具有极高的临床应用前景，同时也面临着严峻的问题，主要表现在测序结果中人源reads比例高，基因背景干扰大，表现出GC偏好性，所谓GC偏好性即优先扩增基因组中GC含量较低的片段，使得不同片段的扩增效率不同，可能导致重要病原菌的漏测或者少测，影响结果的准确性。同时，测序读长中比例过高的人源reads，影响了测序效率，提高了测序成本。

因此，有必要构建一种准确、快速、成本低的病原菌检测方法，在病原微生物检测领域具有重要意义。

发明内容

针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供了一种基于宏基因组测序的真菌定量检测方法，通过富集样本中的病原微生物，降低宿主基因的比例，从而避免测序偏好性，提高测序准确性，并降低测序数据量和测序成本。

为达此目的，本发明采用以下技术方案：

本发明提供了一种基于宏基因组测序的真菌定量检测方法，所述方法包括以下步骤：

(1)向样本中依次加入皂苷和核酸内切酶，去除宿主基因组；

(2)将去除了宿主基因组的样本进行破壁处理，提取核酸，获得真菌基因组；

(3)将所述真菌基因组进行文库构建和高通量测序，获得原始测序数据；

(4)将原始测序数据与真菌数据库进行比对，进行真菌鉴定和丰度检测。

本发明中，在高通量测序前首先采用皂苷和核酸内切酶去除样本中的宿主DNA，其中，皂苷是苷元为三萜或螺旋甾烷类化合物的一类糖苷，可与胆甾醇结合生成不溶性分子，破坏血红细胞的渗透性，本发明采用皂苷处理样本，破坏宿主细胞结构，释放宿主基因组DNA，配合使用核酸内切酶消化释放的宿主DNA，显著降低了人源基因组的比例和对测序结果准确性的干扰，提高了微生物基因组的比例，有效测序数据量大幅提升，提高了测序效率，降低了测序成本。

本发明中，对去除了宿主基因组的样本进行破壁处理，破坏真菌细胞壁，并减少真菌细胞壁中多糖成分对核酸提取的影响，操作简便成本低廉，显著提高了真菌基因组的提取效率。

本发明中，去除宿主基因组步骤和降解真菌细胞壁步骤相互配合，显著提高了真菌基因组在样本中的比例，提高了测序准确性。

优选地，步骤(1)所述样本包括血液样本、唾液样本、粪便样本、尿液样本或土壤样本中的任意一种或至少两种的组合。

优选地，步骤(1)所述皂苷的终浓度为1％～3％，例如可以是1％、2％或3％。

本发明中，终浓度为1％～3％的皂苷对样本中的宿主细胞具有良好的破坏作用，浓度过低不能充分破坏宿主细胞，浓度过高对核酸提取具有一定的影响，也可能对微生物细胞造成破坏。

优选地，步骤(1)所述皂苷处理样本的温度为20～25℃，例如可以是20℃、21℃、22℃、23℃、24℃或25℃。

优选地，步骤(1)所述皂苷处理样本的时间为10～15min，例如可以是10min、11min、12min、13min、14min或15min。

本发明中，在20～25℃的温度下采用皂苷处理样本10～15min，可以充分裂解宿主细胞，使宿主细胞释放基因组DNA。

优选地，步骤(1)所述核酸内切酶包括DNaseI。

优选地，步骤(1)所述核酸内切酶的终浓度为1％～3％，例如可以是1％、2％或3％。

本发明中，终浓度为1％～3％的核酸内切酶对宿主基因组具有高效的降解作用，浓度过低不能充分降解宿主基因组，浓度过高对核酸提取具有一定的影响。

优选地，步骤(1)所述核酸内切酶处理样本的温度为35～40℃，例如可以是35℃、36℃、37℃、38℃、39℃或40℃。

优选地，步骤(1)所述核酸内切酶处理样本的时间为30～60min，例如可以是30min、35min、40min、45min、50min、55min或60min。

本发明中，在35～40℃的温度下采用核酸内切酶处理样本30～60min，核酸内切酶发挥高效的核酸降解作用，充分降解样本中的宿主基因组，最大程度降低样本中宿主基因组的比例。

优选地，步骤(2)所述破壁处理包括超声破壁处理和/或微波破壁处理。

优选地，所述超声破壁处理的功率为100～500W，例如可以是100W、200W、300W、400W或500W，优选为300W。

优选地，所述超声破壁处理的时间为20～40min，例如可以是20min、21min、22min、23min、24min、25min、26min、27min、28min、29min、30min、31min、32min、33min、34min、35min、36min、37min、38min、39min或40min，优选为30min。

优选地，所述微波破壁处理的功率为500～1000W，例如可以是500W、600W、700W、800W、900W或1000W，优选为600W。

优选地，所述微波破壁处理的时间为80～120s，例如可以是80s、85s、90s、95s、100s、105s、110s、115s或120s，优选为100s。

优选地，步骤(3)所述文库构建包括对微生物基因组进行片段化、末端补平和3’端加A尾、连接接头和PCR扩增。

优选地，所述片段化为对微生物基因组进行超声处理。

优选地，所述超声处理的功率为50～55W，例如可以是50W、51W、52W、53W、54W或55W。

优选地，所述超声处理的温度为15～25℃，例如可以是15℃、16℃、17℃、18℃、19℃、20℃、21℃、22℃、23℃、24℃或25℃。

优选地，所述超声处理的时间为6～12min，例如可以是6min、7min、8min、9min、10min、11min或12min。

优选地，所述末端补平和3’端加A尾为采用T4 DNA聚合酶和Klenow DNA聚合酶处理片段化核酸，其中，T4 DNA聚合酶特异性催化DNA的5’-3’聚合反应，完成对片段化核酸的末端补平，Klenow DNA聚合酶以dNTP为底物，向平末端双链DNA的3’端加A尾。

优选地，所述末端补平和3’端加A尾的条件为20～25℃保持5～15min，70～75℃保持5～15min。

优选地，所述接头包括P7接头和P5接头；

优选地，所述连接接头的条件为20～25℃保持10～20min。

优选地，所述PCR扩增的条件为92～96℃预变性1～5min；95～98℃变性5～20s，60～65℃退火20～40s，70～75℃延伸20～40s，共进行5～8个循环；70～75℃延伸1～3min；0～4℃终止反应。

本发明中，PCR扩增采用的引物为P7接头引物和P5接头引物，

优选地，步骤(4)所述真菌数据库来源于公共数据库。

作为优选技术方案，本发明提供了一种基于宏基因组测序的真菌定量检测方法，所述方法包括以下步骤：

(1)向样本中加入终浓度为1％～3％的皂苷，20～25℃下孵育10～15min，破坏宿主细胞，随后加入终浓度为1％～3％的DNaseI，35～40℃下孵育30～60min，去除宿主基因组；

(2)将去除了宿主基因组的样本进行超声破壁处理和/或微波破壁处理，所述超声破壁处理为将样本在100～500W功率下超声20～40min，所述微波破壁处理为将样本在500～1000W功率下微波80～120s，提取核酸，获得真菌基因组；

(3)将所述真菌基因组在15～25℃条件下进行50～55W超声片段化，并采用T4 DNA聚合酶和Klenow DNA聚合酶处理片段化核酸，随后加入P7接头和P5接头进行接头连接反应，对含有接头的模板进行PCR扩增，构建测序文库进行高通量测序，获得原始测序数据；

(4)将原始测序数据与NCBI真菌数据库进行比对，进行真菌鉴定和丰度检测。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

(1)本发明在高通量测序前首先采用皂苷和核酸内切酶去除样本中的宿主DNA，皂苷破坏宿主细胞，释放宿主基因组，核酸内切酶消化释放的宿主基因组，皂苷和核酸内切酶两者相互配合，显著降低了人源基因组的比例和对测序结果准确性的干扰，提高了微生物基因组的比例；

(2)本发明进一步对去除了宿主基因组的样本进行破壁处理，与去除宿主基因组步骤相配合，操作简便成本低廉，显著提高了真菌基因组在样本中的比例，提高了测序准确性；

(3)本发明的基于宏基因组测序的真菌定量检测方法，获得的原始测序数据中有效测序数据的比例大幅提升，提高了测序效率和准确性，降低了测序成本，简单易行，在真菌检测领域具有重要意义。

具体实施方式

为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。

实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。

实施例1样本预处理

(1)去除宿主基因组

吸取1mL血液样本，8000g离心3min，收集沉淀，弃上清，加入200μL PBS重悬沉淀，涡旋混匀；

加入200μL 5％皂苷，室温孵育10min；

加入350μL水孵育30s，6000g离心5min，弃上清；

加入100μL PBS重悬沉淀，加入100μL HL-SAN缓冲液(5.5M NaCl和100mM MgCl

加入5μL DNaseI，37℃1000rpm孵育40min；

6000g离心3min，弃上清，分别用500μL和1mL PBS清洗两次；

10000g离心1min，丢弃800μL上清，得到去除宿主基因组的样本；

(2)超声破壁处理

将去除了宿主基因组的样本在300W功率下超声破壁处理30min，随后进行核酸提取。

本实施例同时对相同的样本不采用皂苷和DNaseI去除宿主基因组，得到未去除宿主基因组的样本，采用相同的参数进行超声破壁处理。

实施例2样本预处理

(1)去除宿主基因组

吸取1mL粪便样本，8000g离心3min，收集沉淀，弃上清，加入200μL PBS重悬沉淀，涡旋混匀；

加入200μL 2％皂苷，室温孵育15min；

加入350μL水孵育30s，6000g离心5min，弃上清；

加入100μL PBS重悬沉淀，加入100μL HL-SAN缓冲液(5.5M NaCl和100mM MgCl

加入6μL DNaseI，40℃1000rpm孵育30min；

6000g离心3min，弃上清，分别用500μL和1mL PBS清洗两次；

10000g离心1min，丢弃800μL上清，得到去除宿主基因组的样本；

(2)微波破壁处理

将去除了宿主基因组的样本在600W功率下微波破壁处理100s，随后进行核酸提取。

本实施例同时对相同的样本不采用皂苷和DNaseI去除宿主基因组，得到未去除宿主基因组的样本，采用相同的参数进行微波破壁处理。

实施例3样本预处理

(1)去除宿主基因组

吸取1mL土壤样本，8000g离心3min，收集沉淀，弃上清，加入200μL PBS重悬沉淀，涡旋混匀；

加入200μL 6％皂苷，室温孵育10min；

加入350μL水孵育30s，6000g离心5min，弃上清；

加入100μL PBS重悬沉淀，加入100μL HL-SAN缓冲液(5.5M NaCl和100mM MgCl

加入2μL DNaseI，35℃1000rpm孵育60min；

6000g离心3min，弃上清，分别用500μL和1mL PBS清洗两次；

10000g离心1min，丢弃800μL上清，得到去除宿主基因组的样本；

(2)超声破壁处理

将去除了宿主基因组的样本在100W功率下微波破壁处理40min，随后进行核酸提取。

本实施例同时对相同的样本不采用皂苷和DNaseI去除宿主基因组，得到未去除宿主基因组的样本，采用相同的参数进行超声破壁处理。

对比例1

与实施例1相比，对比例1省略了超声破壁处理步骤，即对去除宿主基因组或未去除宿主基因组的样本直接提取真菌DNA。

实施例4真菌DNA的提取

(1)分别向实施例1、2、3、对比例1制备的样本中加入1mL裂解液(0.01M Tris，0.15M NaCl，HCl调至pH＝8.0)，混匀后置于细胞破碎仪中，以最大功率75Hz破碎5min；

(2)破碎结束后加入110μL 10％SDS，轻轻混匀，冰浴10min，1500g离心10min，收集上清液；

(3)向上清中加入1/10体积3M NaAc和等体积的氯仿异戊醇(24:1)，混匀后15000g离心10min，收集上清；

(4)向上清中加入1/2体积提取酚，1/2体积氯仿，轻轻混匀，15000g离心10min，收集上清；

(5)向上清中加入等体积氯仿异戊醇(24:1)，混匀后15000g离心5min，取上清，加入2倍体积无水乙醇，-20℃沉淀过夜，15000g离心15min，弃上清，沉淀经真空冷冻干燥后加入30μL ddH

使用NanoDrop 2000测定真菌基因组DNA的浓度，提取得到的DNA的OD260/OD280的比值在1.7～1.9之间，直接进行文库构建。

实施例5文库构建

(1)DNA片段化

将提取的真菌基因组DNA进行Qubit定量后，将200ng样本加入到0.2mL PCR管中，加入0.1×TE缓冲液补足至55μL，充分混匀并离心；

将装有样本的0.2mL PCR管置于超声波清洗仪中进行超声打断，设置超声功率为55W，超声时间为6min，得到的片段化DNA长度约350bp；

超声结束后，用AMpure XP磁珠对片段化DNA进行纯化，溶解于39.5μL ddH

(2)末端补平和3’端加A尾

配制表1所示的反应体系，充分混匀后置于PCR仪上25℃孵育10min，70℃孵育10min，4℃保持，热盖设为85℃，进行片段化DNA的末端补平和3’端加A尾。

表1末端补平和3’端加A尾反应体系

(3)连接接头和纯化

配制表2所示的反应体系，充分混匀后置于PCR仪上20℃孵育20min(不加热热盖)，进行接头连接反应；

室温平衡AMPure XP beads至少30min，涡旋混匀后吸取88μL(1×)至新的1.5mL离心管中，加入连接有接头的样品110μL，总体积约198μL；

涡旋混匀后室温静置5～15min，置于磁力架(MPC)上至液体澄清，弃上清；

加入200μL新鲜的80％乙醇，磁力架上孵育1min，弃上清，80％乙醇重复清洗一次；

37℃开盖孵育5min至beads变干；

加入25μL ddH

取上清至新离心管中，得到纯化的接头连接产物，Qubit测定浓度。

表2接头连接反应体系

(4)PCR扩增

配制表3所示的反应体系，轻轻充分混匀，短暂离心，按照表4的程序进行PCR扩增。

表3 PCR反应体系

表4 PCR反应程序

(5)PCR产物纯化

室温平衡AMPure XP beads至少30min，涡旋混匀后吸取50μL(1×)至新的1.5mL离心管中，加入50μL PCR扩增产物；

吹打混匀后室温静置5～15min，置于磁力架(MPC)上至液体澄清，弃上清；

加入200μL新鲜的80％乙醇，磁力架上孵育1min，弃上清，80％乙醇重复清洗一次；

37℃开盖孵育5min至beads变干；

加入25μL ddH

取上清至新离心管中，得到纯化的PCR扩增产物，Qubit测定浓度(文库≧1ng)，保存于-20℃。

实施例6高通量测序和结果分析

采用Illumina测序平台对文库进行测序，测序结果中有效reads数见表5，在测序数据总Reads数相同的情况下，去除宿主基因组的测序数据中，真菌的丰度明显增高，且破壁处理操作也有利于提高真菌的测序丰度，表明此方法在对临床样本进行真菌富集时取得了很好的效果，且不会造成漏检。

表5

综上所述，本发明在高通量测序前首先采用皂苷和核酸内切酶去除样本中的宿主DNA，皂苷和核酸内切酶两者相互配合，显著降低了人源基因组的比例和对测序结果准确性的干扰，提高了测序效率和准确性，降低了测序成本，方法简单易行，在病原微生物检测领域具有重要意义。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。