一种用于检测BRCA1基因长片段拷贝数变异的试剂盒

技术领域

本发明涉及一种用于检测BRCA1基因长片段拷贝数变异的试剂盒，特别涉及一种基于MassArray飞行时间质谱的多重反应，并对BRCA1基因所有外显子的拷贝数进行分析。

背景技术

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，其发病率逐年上升；其病因比较复杂，包括：遗传、激素、生殖、营养和环境等多方面。据报道，每年全世界约有140万人被诊断为乳腺癌，而大约有50万人死于该病。我国仅2015年新发乳腺癌病例就已高达27.2万，死亡病例数约7.1万。乳腺癌的早期筛查和发现及治疗是有效防治乳腺癌的关键。

乳腺癌易感基因1(BRCA1)和乳腺癌易感基因2(BRCA2)的胚系缺陷是导致乳腺癌遗传易感性的最常见因素。与散发性乳腺癌相比，遗传性乳腺癌的特点是诊断年龄小，双侧病变多，男性亲属发病率高。BRCA1和BRCA2基因突变约占遗传性乳腺癌的20％-25％，占所有乳腺癌的5％-10％。此外，BRCA1和BRCA2基因突变占卵巢癌的15％左右。

BRCA1基因定位于人类第17号染色体q21，长约81kb。常染色体显性遗传，有很高的外显率。在活细胞中，BRCA1具有多种功能，包括双链DNA断裂修复、参与基因组监视、转录偶联DNA修复、转录调控、染色质重塑以及泛素连接和细胞周期检查点阻滞等。BRCA1功能丧失可导致自发染色体断裂、对DNA损伤的敏感性、染色体不对称分离、非整倍体增加等，最终导致肿瘤形成。BRCA1基因突变人群患乳腺癌和卵巢癌的风险分别是50％-85％和15％-45％。因此BRCA1基因的突变检测对乳腺癌和卵巢癌的早期诊断和治疗具有重要意义。

BRCA1突变主要包括单个碱基变化或少量碱基的缺失/插入，导致蛋白截断、mRNA加工破坏或对蛋白功能有显著影响的氨基酸替换。这些突变很容易通过PCR和测序进行检测。还有少数的BRCA1基因突变是破坏基因功能的DNA长片段拷贝数变异(Copy numbervariation,CNV)，包括1个或多个外显子的缺失和重复，占总突变的10-15％。这种类型的突变难以通过测序检测。现有的BRCA1基因的突变检测技术的缺点是，大多只检测碱基的突变和少量碱基的缺失/插入，没有检测长片段拷贝数变异。本方法采用特异的PCR引物、人工内标(competitor)和延伸引物，基于MassArray飞行时间质谱的多重反应，可以高通量检测样本，降低成本。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于检测BRCA1基因长片段拷贝数变异的试剂盒，对BRCA1基因的23个外显子的拷贝数进行检测。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

一种用于检测BRCA1基因长片段拷贝数变异的试剂盒，包括样品检测孔W1和样品检测孔W2；样品检测孔W1包括W1多重PCR反应体系、虾碱性磷酸酶(SAP)反应体系以及W1延伸反应体系；样品检测孔W2包括W2多重PCR反应体系、虾碱性磷酸酶(SAP)反应体系以及W2延伸反应体系。

W1多重PCR反应体系包括PCR Buffer、MgCl

进一步的，W1多重PCR反应体系中PCR引物Pool的序列如下：

进一步的，W1多重PCR反应体系中人工内标的序列如下：

W2多重PCR反应体系包括PCR Buffer、MgCl

进一步的，W2多重PCR反应体系中PCR引物Pool的序列如下：

进一步的，W2多重PCR反应体系中人工内标的序列如下：

W1和W2的SAP反应体系均包括SAP酶以及SAP Buffer。

W1延伸反应体系包括Buffer Plus、Termination Mix、W1延伸引物混合物以及iPLEX Enzyme；W2延伸反应体系包括Buffer Plus、Termination Mix、W2延伸引物混合物以及iPLEX Enzyme。

进一步的，W1延伸引物混合物的序列如下：

W2延伸引物混合物的序列如下：

在本发明的一个优选实施例中，所述检测方法步骤如下：

1)采用商业化的DNA提取试剂盒提取人基因组DNA，稀释至10ng/μl；

2)通过PCR扩增反应，获得样品检测孔W1和W2的目的片段的扩增产物；

3)通过SAP反应，除去样品检测孔W1和W2的扩增产物中含有的dNTPs；

4)通过延伸反应，在延伸引物的3’端连接一个碱基，同时延伸出了人基因组DNA的产物和人工内标的产物；

5)采用树脂纯化延伸反应的产物；

6)将纯化后的产物点样在芯片基质上共结晶，转入质谱仪的真空管，然后用激光激发进行质谱检测；

7)根据质谱结果，进行数据分析，计算各个外显子的拷贝数。

本发明的目的之二在于一种利用所述检测试剂盒的应用，所述应用为后期开发用于乳腺癌和卵巢癌等BRCA1相关的癌症的辅助诊断和用药指导。

由于采用了以上技术，本发明较现有技术相比，具有的有益效果如下：

本发明开发了一种用于检测BRCA1基因长片段拷贝数变异的试剂盒，开发了一款快速、大通量、准确性高、成本低的乳腺癌和卵巢癌辅助诊断产品，弥补了现有技术的不足，可对乳腺癌和卵巢癌等BRCA1相关的癌症进行辅助诊断和用药指导。

附图说明

图1是BRCA1发生缺失的MassArray结果图；

图2是BRCA1发生重复的MassArray结果图；

图3是BRCA1发生缺失的结果计算柱状图；

图4是BRCA1发生重复的结果计算柱状图；

图5是人工内标与人基因组DNA的对比示意图，其中在延伸引物3’端的延伸位置有一个碱基的不同；

图6是人工内标的延伸产物峰(人工内标峰)与人基因组DNA的延伸产物峰(目标峰)的示意图。

具体实施方式

下面结合具体实施方式，进一步阐明本发明。

实施例1

1.BRCA1基因长片段拷贝数变异的检测：

1)DNA样本的准备

人基因组DNA的提取采用商业化的DNA提取试剂盒。得到的DNA质量，用Nano300检测须符合OD

2)PCR扩增反应

本申请当中优选的扩增引物组合序列见表1-表4，扩增引物为内参基因和BRCA1基因的23个外显子的特异性引物。内参基因扩增引物和延伸引物的目标片段为人源基因RNaseP、EIF2C1和ALB的一段。每个样本分2个孔检测，分别为W1和W2。W1中的16对引物分别按照终浓度0.5μM进行混合，配制成W1的PCR引物Pool；W2中的17对引物分别按照终浓度0.5μM进行混合，配制成W2的PCR引物Pool。

表1.W1的BRCA1基因扩增引物序列

表2.W1的内参基因扩增引物序列

表3.W2的BRCA1基因扩增引物序列

表4.W2的内参基因扩增引物序列

上述用于检测BRCA1基因长片段拷贝数变异的试剂盒设有人工内标，人工内标为与目标扩增片段仅有1碱基不同的双链DNA合成片段。不同的碱基为延伸引物在延伸反应时延伸的3’端碱基(如图5、图6所示)，作为内部对照。具体的人工内标序列见表5-表6。W1的15个人工内标按终浓度相当于3000拷贝/μl人基因组DNA的量混合；W2的15个人工内标也按终浓度相当于3000拷贝/μl人基因组DNA的量混合。分别得到W1人工内标混合物和W2人工内标混合物。

表5.W1的人工内标序列

表6.W2的人工内标序列

上述用于检测BRCA1基因长片段拷贝数变异的试剂盒所使用的多重PCR反应体系中含有PCR Buffer、MgCl

表7.PCR扩增反应体系

表8.PCR扩增反应程序

3)SAP反应

上述SAP反应体系含有SAP酶和SAP Buffer(购于Agena BioScience公司，货号10141)。PCR扩增后，取5ul产物进行SAP反应。SAP反应体系见表9，反应程序见表10。

表9.SAP反应体系

表10.SAP反应程序

4)延伸反应

上述延伸反应体系含有Buffer Plus、Termination Mix和iPLEX Enzyme(购于Agena BioScience公司，货号10141)，以及延伸引物混合物。本申请当中优选的延伸引物组合序列见表12-表15，延伸引物为BRCA1基因和内参基因的特异性引物。W1中的16条延伸引物(UEP)按照表11的规则进行混合，配制成W1的UEP混合物；W2中的17条延伸引物(UEP)按照表11的规则进行混合，配制成W2的UEP混合物。SAP反应结束后，进行延伸反应。延伸反应体系见表16，其中W1孔使用W1的UEP混合物，W2孔使用W2的UEP混合物。反应程序见表17。

表11.延伸引物(UEP)混合物配制表

表12.W1的BRCA1基因延伸引物序列

表13.W1的内参基因延伸引物序列

表14.W2的BRCA1基因延伸引物序列

表15.W2的内参基因延伸引物序列

表16.延伸反应体系

表17.延伸反应程序

5)脱盐

向延伸反应的产物中加入19ul超纯水，放入MassArray-CPM机器中，设置机器加入10ul的树脂，进行脱盐纯化，并静置沉降。

6)质谱检测

MassArray-CPM自动化地将产物点样在芯片上，并移入真空管中，然后用激光激发，进行飞行时间质谱。一张芯片最多可以同时检测192个样本，增加了通量，减少了成本。

2.数据分析

用Typer软件打开实验结果，可以对散点图进行分析。外显子缺失或者重复的样本，其结果会散落在正常样本的聚堆之外(如图1和图2圈出的部分)。我们需要对数据进行进一步的分析，在Typer软件中点击View--Plate Data Pane导出数据表。根据数据表中的每个目标片段的检测样本基因组DNA(gDNA)的FREQ参数和人工内标的FREQ参数，按照以下公式计算拷贝数。

然后用阴性对照样本和检测样本的拷贝数进行如下计算。

多个内参基因，则取其拷贝数比值的平均值。

根据3个阴性对照样本的拷贝数比值，计算得到3个TR，再取平均值。

根据TR值，判断如下：

根据上述算法，用RStudio编辑器编写代码后，可直接上传实验数据，得到最终的TR值。根据TR值做柱状图，TR≤0.65时，且该外显子的柱形图明显低于其他柱形图(如图3所示)，结果为外显子缺失；TR≥1.5时，且该外显子的柱形图明显高于其他柱形图(如图4所示)，结果为外显子重复。如果TR在0.65-0.8和1.2-1.5之间，则为灰区值，需要重新检测，或者通过其他方法进行验证。

3.质控标准

质量控制，每次试验需做2个阳性对照、3个阴性对照和3个空白对照。缺失阳性对照的TR≤0.65，重复阳性对照TR≥1.5，空白对照的TR＝0。

4.产品性能指标：

本方法能特异检测BRCA1的23个外显子的1个或多个缺失和重复。

检测2份阳性参考品、10份阴性参考品，符合率为100％；企业重复性参考品重复检测10次，10次结果相同。检测未知样本，其符合率为98.6％。

实施例2

1.根据实验结果的TR值，判断如下：

根据上述算法，用RStudio编辑器编写代码后，可直接上传实验数据，得到最终的TR值。根据TR值做柱状图，TR≤0.65时，且该外显子的柱形图明显低于其他柱形图(如图3所示)，结果为外显子缺失；TR≥1.5时，且该外显子的柱形图明显高于其他柱形图(如图4所示)，结果为外显子重复。如果TR在0.65-0.8和1.2-1.5之间，则为灰区值，需要重新检测，或者通过其他方法进行验证。

2.质控标准

质量控制，每次试验需做2个阳性对照、3个阴性对照和3个空白对照。缺失阳性对照的TR≤0.65，重复阳性对照TR≥1.5，空白对照的TR＝0。

3.辅助诊断和用药指导

当质控符合标准，即实验结果可靠时，TR≤0.65，说明该外显子缺失；TR≥1.5，说明该外显子重复。外显子缺失或者重复，导致BRCA1蛋白正常功能丧失，为致病突变，增加了肿瘤患病风险。受检者的一级亲属，包括父母、孩子、兄弟和姐妹，拥有和受检者最相近的遗传基因，有50％的可能携带有同样的突变。另外，一些远亲，比如叔、伯、姑、舅、姨、祖父母、外祖父母、表兄妹或堂兄妹等，也有可能携带同样的突变。本试剂盒的检测有助于了解突变基因携带情况，辅助医生评估患病风险，及时监控早期干预。

乳腺癌NCCN指南推荐(1)对所有复发或转移性乳腺癌患者进行胚系BRCA1/2突变评估，以确定适合接受PARP抑制剂治疗的患者。尽管FDA规定奥拉帕尼和他拉唑帕尼适用于HER2-阴性疾病，但专家组支持其用于胚系BRCA1或BRCA2突变相关的任何乳腺癌亚型。(2)对于携带胚系BRCA1/2突变的三阴性复发/IV期乳腺癌患者，NCCN专家组已将铂类药物(顺铂和卡铂)列为首选治疗方案。

卵巢癌NCCN指南推荐(1)在初始治疗中，未接受含贝伐单抗治疗且获得完全缓解/部分缓解(CR/PR)的携带BRCA1/2胚系或体细胞突变的II-IV期卵巢癌患者，可接受奥拉帕利(I类推荐)或尼拉帕利(I类推荐)单药维持治疗；BRCA1/2基因野生型，获得CR/PR的患者，可接受尼拉帕利单药维持治疗。(2)在初始治疗中，接受含贝伐单抗治疗且获得CR/PR的携带BRCA1/2胚系或体细胞突变的II-IV期卵巢癌患者，可接受贝伐单抗联合奥拉帕利(I类推荐)或奥拉帕利或尼拉帕利维持治疗；BRCA1/2基因野生型，获得CR/PR的患者，可接受贝伐单抗联合奥拉帕利维持治疗。(3)还推荐奥拉帕利、尼拉帕利或芦卡帕利用于既往接受以铂类为基础的化疗后有完全或部分缓解的复发性卵巢上皮癌、输卵管癌或原发性腹膜癌患者的维持治疗。

本发明开发了一种用于检测BRCA1基因长片段拷贝数变异的试剂盒，开发了一款快速、大通量、准确性高、成本低的乳腺癌和卵巢癌辅助诊断产品，弥补了现有技术的不足，只需采集血液、口拭子等无创筛查样本就可对乳腺癌和卵巢癌等BRCA1相关的癌症进行辅助诊断和用药指导。

本试剂盒的检测有助于辅助医生在治疗乳腺癌病患、卵巢癌病患的过程中选择更有效的药物，进行更有效的治疗。

上述实施例仅为本发明的优选技术方案，而不应视为对于本发明的限制，本发明的保护范围应以权利要求记载的技术方案，包括权利要求记载的技术方案中技术特征的等同替换方案为保护范围，即在此范围内的等同替换改进，也在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 申友基因组研究院（南京）有限公司

<120> 一种用于检测BRCA1基因长片段拷贝数变异的试剂盒

<160> 129

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gctgaaactt ctcaacc 17

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ctgggagctc ctctcactc 19

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gagttgatca aggaacctg 19

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cacagcagaa acctacaact c 21

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

aaaggcatct ggctgcacaa cc 22

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gggtgagagg atagccctga gc 22

<210> 7

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

acaagaaagt acgagattta gtc 23

<210> 8

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

attcagcatt tttctttctt taat 24

<210> 9

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

attagattag ttaaagtgat gtgg 24

<210> 10

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

tggagatcaa gaattgttac aaatc 25

<210> 11

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

ggatgttctc atttcccatt tctctt 26

<210> 12

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

ccctctgaag ataccgttaa taaggc 26

<210> 13

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

tgagatgggt agtttctatt ctgaag 26

<210> 14

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

cacccttcca tcataagtga c 21

<210> 15

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

tcaacattga tggtg 15

<210> 16

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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gggaaacaaa ggacaccgtt a 21

<210> 17

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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actgagaagc gtgcagc 17

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

cgaccttggt ggtttc 16

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

cctcaaactt gtcagcagaa 20

<210> 20

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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ctccggagtc ctagcccttt c 21

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<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

ggttcactct gtagaagtct tt 22

<210> 22

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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ccatgttcta acacagcttc tag 23

<210> 23

<211> 23

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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ggagtctgct ccgtttggtt agt 23

<210> 24

<211> 24

<212> DNA

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aacacttacc tggaatctgg aatc 24

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<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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ggatggtgaa tgatgaaagc tcct 24

<210> 26

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

ggggagatgc tgagtttgtg tgtg 24

<210> 27

<211> 18

<212> DNA

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<400> 27

taagaagtac aaaatgtc 18

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 28

cctgtccctt tcccggg 17

<210> 29

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 29

tgttggcatg ttggtgaagg gcccat 26

<210> 30

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 30

cgggtccaac tctctaacct tggaactg 28

<210> 31

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 31

tgataacaaa ggacaccgtt a 21

<210> 32

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 32

gggaggctca acattgatgg tg 22

<210> 33

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 33

ttactacatt tttctacatc ctttgttt 28

<210> 34

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 34

gatgtttgcc ttttgagtat tctttctaca 30

<210> 35

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 35

acgttggatg actctaccag tgccaggagc 30

<210> 36

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 36

acgttggatg ttctttttct ccccccctac 30

<210> 37

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 37

acgttggatg gttgttctag cagtgaagag 30

<210> 38

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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ggatggatga agtgacagtt ccagtagtcc 30

<210> 39

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 39

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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gttggatgca cttgctgagt gtgtttctca 30

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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cgttggatga aagagcacgt tcttctgctg 30

<210> 42

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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cgttggatgt tctgagctgt gtgctagagg 30

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<212> DNA

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gttggatgtg gtcagctttc tgtaatcgaa 30

<210> 44

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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gttggatgag gatctgattc ttctgaagat ac 32

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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acgttggatg atgagctcct cttgagatgg 30

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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acgttggatg cagagggata ccatgcaaca 30

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 49

acgttggatg ataattttgt gctcatggca ga 32

<210> 50

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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acgttggatg tggagccaca taacacattc 30

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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acgttggatg actcttcttg gctccagttg 30

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 52

acgttggatg tacatgcagg caccttacca 30

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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acgttggatg taaggtgaag cagcatctgg 30

<210> 54

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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acgttggatg tccaaacctg tgtcaagctg 30

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acgttggatg tttatgcagc agatgcaagg 30

<210> 57

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 57

cgttggatgt ttttgcagaa tccaaactga 30

<210> 58

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 58

acgttggatg gctagaggaa aactttgagg 30

<210> 59

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 59

acgttggatg gttctctttg actcacctgc aa 32

<210> 60

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 60

acgttggatg gtcatcccct tctaaatgcc 30

<210> 61

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 61

acgttggatg tttggccaac aatacacacc 30

<210> 62

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 62

acgttggatg gtggttcggc tttcaccagt ctg 33

<210> 63

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 63

acgttggatg ggtcagctct tcccttcatc 30

<210> 64

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 64

acgttggatg ggtgtggtca ctggacttgg g 31

<210> 65

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 65

acgttggatg cctcccacat gtaatgtgtt g 31

<210> 66

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 66

gttggatgtg tgaattttct gagacggatg 30

<210> 67

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 67

acgttggatg tgacgtgtct gctccacttc 30

<210> 68

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 68

ggatgtttgt tttctcattc catttaaagc 30

<210> 69

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 69

cgttggatgt ttttagcaaa agcgtccaga 30

<210> 70

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 70

tggatgtctc ctgaacatct aaaagatgaa 30

<210> 71

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 71

acgttggatg cagagggata ccatgcaaca 30

<210> 72

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 72

cgttggatga aagcagattt ggcagttcaa 30

<210> 73

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 73

gttggatgaa cttctcccat tcctttcaga 30

<210> 74

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 74

acgttggatg ggtagagggc ctgggttaag 30

<210> 75

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 75

acgttggatg gctctttagc ttcttaggac 30

<210> 76

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 76

tggtttttct aatgtgttaa agttcattgg 30

<210> 77

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 77

acgttggatg tttctcagat aactgggccc ctg 33

<210> 78

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 78

acgttggatg ttcccctgtc cctctctctt 30

<210> 79

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 79

cgttggatgt tcaggaggaa aagcacagaa 30

<210> 80

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 80

acgttggatg gctgtaatga gctggcatga 30

<210> 81

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 81

acgttggatg tgtcctggga ttctcttgct 30

<210> 82

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 82

cgttggatgc ctttccactc ctggttcttt 30

<210> 83

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 83

acgttggatg aagtgttgga agcagggaag 30

<210> 84

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 84

acgttggatg gccacagagc aagactccat 30

<210> 85

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 85

acgttggatg tttggccaac aatacacacc 30

<210> 86

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 86

gttggatggc tttcgttttg aaagcagatt 30

<210> 87

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 87

acgttggatg tgactctggg gctctgtctt 30

<210> 88

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 88

acgttggatg tgtgtcctcc ctctctgaca 30

<210> 89

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 89

acgttggatg cattttcctc ccgcaattcc 30

<210> 90

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 90

acgttggatg cagagtggat ggagaacaag g 31

<210> 91

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 91

acgttggatg cctctcaggt tccgcccc 28

<210> 92

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 92

acgttggatg ggttctccca ggctcttacc 30

<210> 93

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 93

cgttggatgc ctgagaccct tacccaattc 30

<210> 94

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 94

acgttggatg ggtcagctct tcccttcatc 30

<210> 95

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 95

acgttggatg gtggttcggc tttcaccagt ctg 33

<210> 96

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 96

acgttggatg agcaacctgt tacatattaa agtt 34

<210> 97

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 97

acgttggatg cctcccacat gtaatgtgtt g 31

<210> 98

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 98

acgttggatg ggtgtggtca ctggacttgg g 31

<210> 99

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 99

acgttggatg atactgagca aaggcaatca ac 32

<210> 100

<211> 287

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 100

ttctttttct ccccccctac cctgctagtc tggagttgat caaggaacct gactccacaa 60

agtgtgacca catattttgc aagtaagttt gaatgtgtta tgtggctcca ttttcaaaac 120

tgaaaaactc atatattcag tattttactc ccacagcacc tccccccaat ttgacccaca 180

gggaccccca tccaggtgca gggtcctcgc ctgtgtacag ggcacacctt tggtcactcc 240

aaattcccag agctcccagg gtccttctca gggtctccac ctggatg 287

<210> 101

<211> 372

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 101

tttgcctttt gagtattctt tctacaaaag gaagtaaatt aaattgttct ttctttcttt 60

ataatttata gattttgcat gctgaaactt ctcaacctga agaaagggcc ttcacagtgt 120

cctttatgta agaatgatat aaccaaaagg tatataattt ggtaatgatg ctaggttgga 180

agcaaccaca gtaggttttc aaaactgaaa aactcatata ttcagtattt tactcccaca 240

gcacctcccc ccaatttgac ccacagggac ccccatccag gtgcagggtc ctcgcctgtg 300

tacagggcac acctttggtc actccaaatt cccagagctc ccagggtcct tctcagggtc 360

tccacctgga tg 372

<210> 102

<211> 302

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 102

cacttgctga gtgtgtttct caaacaattt aatttcagga gcctacaaga aagtacgaga 60

tttagtctac ttgttgaaga gctattgaaa atcatttgtg cttttcagct tgacacaggt 120

ttggattttc aaaactgaaa aactcatata ttcagtattt tactcccaca gcacctcccc 180

ccaatttgac ccacagggac ccccatccag gtgcagggtc ctcgcctgtg tacagggcac 240

acctttggtc actccaaatt cccagagctc ccagggtcct tctcagggtc tccacctgga 300

tg 302

<210> 103

<211> 366

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 103

ctcagtaaat atttctagtt gaatatctgt ttttcaacaa gtacattttt ttaacccttt 60

taattaagaa aacttttatt gatttatttt ttggggggaa attttttagg atctgattct 120

tctgaagata ccgttaataa ggctacttat tgcaggtgag tcaaagagaa cctttgtcta 180

tgaagctggt tttcaaaact gaaaaactca tatattcagt attttactcc cacagcacct 240

ccccccaatt tgacccacag ggacccccat ccaggtgcag ggtcctcgcc tgtgtacagg 300

gcacaccttt ggtcactcca aattcccaga gctcccaggg tccttctcag ggtctccacc 360

tggatg 366

<210> 104

<211> 361

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 104

tggtcagctt tctgtaatcg aaagagctaa aatgtttgat cttggtcatt tgacagttct 60

gcatacatgt aactagtgtt tcttattagg actctgtctt ttccctatag tgtgggagat 120

caagaattgt tacaaatctc ccctcaagga accagggatg aaatcagttt ggattctgca 180

aaaattttca aaactgaaaa actcatatat tcagtatttt actcccacag cacctccccc 240

caatttgacc cacagggacc cccatccagg tgcagggtcc tcgcctgtgt acagggcaca 300

cctttggtca ctccaaattc ccagagctcc cagggtcctt ctcagggtct ccacctggat 360

g 361

<210> 105

<211> 293

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 105

gttgttctag cagtgaagag ataaagaaaa aaaagtacaa ccaaatgcca gtcaggcaca 60

gcagaaacct acaactcttg gaaggtaaag aacctgcaac tggagccaag aagagttttt 120

caaaactgaa aaactcatat attcagtatt ttactcccac agcacctccc cccaatttga 180

cccacaggga cccccatcca ggtgcagggt cctcgcctgt gtacagggca cacctttggt 240

cactccaaat tcccagagct cccagggtcc ttctcagggt ctccacctgg atg 293

<210> 106

<211> 268

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 106

gctagaggaa aactttgagg aacattcaat gtcacctgta agagaaatgg gaaatgagaa 60

cattccaagt acagtgagca caattagccg tttttcaaaa ctgaaaaact catatattca 120

gtattttact cccacagcac ctccccccaa tttgacccac agggaccccc atccaggtgc 180

agggtcctcg cctgtgtaca gggcacacct ttggtcactc caaattccca gagctcccag 240

ggtccttctc agggtctcca cctggatg 268

<210> 107

<211> 282

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 107

taaggtgaag cagcatctgg gtgtgagagt gaaacaagcg tctctgaaga cagctcaggg 60

ctatcctctc agagtgacat tttaaccact caggtaaaaa gcgtgttttc aaaactgaaa 120

aactcatata ttcagtattt tactcccaca gcacctcccc ccaatttgac ccacagggac 180

ccccatccag gtgcagggtc ctcgcctgtg tacagggcac acctttggtc actccaaatt 240

cccagagctc ccagggtcct tctcagggtc tccacctgga tg 282

<210> 108

<211> 279

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 108

gtcatcccct tctaaatgcc catcattaga tgataggtgg tacatgcaca gttgctctgg 60

gagacttcag aatagaaact acccatctca agaggagctc atttttcaaa actgaaaaac 120

tcatatattc agtattttac tcccacagca cctcccccca atttgaccca cagggacccc 180

catccaggtg cagggtcctc gcctgtgtac agggcacacc tttggtcact ccaaattccc 240

agagctccca gggtccttct cagggtctcc acctggatg 279

<210> 109

<211> 367

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 109

ttctgagctg tgtgctagag gtaactcatg ataatggaat atttgattta atttcagatg 60

ctcgtgtaca agtttgccag aaaactccac atcactttaa ctaatctaat tactgaagag 120

actactcatg ttgttatgaa aacaggtata ccaagaacct ttacagaata ccttgcatct 180

gctgcataaa ttttcaaaac tgaaaaactc atatattcag tattttactc ccacagcacc 240

tccccccaat ttgacccaca gggaccccca tccaggtgca gggtcctcgc ctgtgtacag 300

ggcacacctt tggtcactcc aaattcccag agctcccagg gtccttctca gggtctccac 360

ctggatg 367

<210> 110

<211> 357

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 110

aaagagcacg ttcttctgct gtatgtaacc tgtcttttct atgatctctt taggggtgac 60

ccagtcaatt aaagaaagaa aaatgctgaa tgaggtaagt acttgatgtt acaaactaac 120

cagagatatt cattcagtca tatagttaaa aatgtatttg cttccttcca tcaatgcacc 180

ttttcaaaac tgaaaaactc atatattcag tattttactc ccacagcacc tccccccaat 240

ttgacccaca gggaccccca tccaggtgca gggtcctcgc ctgtgtacag ggcacacctt 300

tggtcactcc aaattcccag agctcccagg gtccttctca gggtctccac ctggatg 357

<210> 111

<211> 319

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 111

aagtgacagt tccagtagtc ctactttgac actttgaatg ctctttcctt cctggggatc 60

cagggtgtcc acccaattga ggttgtgcag ccagatgcct ggacagagga caatggcttc 120

catggtaagg tgcctgcatg tattttcaaa actgaaaaac tcatatattc agtattttac 180

tcccacagca cctcccccca atttgaccca cagggacccc catccaggtg cagggtcctc 240

gcctgtgtac agggcacacc tttggtcact ccaaattccc agagctccca gggtccttct 300

cagggtctcc acctggatg 319

<210> 112

<211> 292

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 112

gtggttcggc tttcaccagt ctgtgcgccc tgccatgtgg aagatgatgc tcaacattga 60

tggtgtgtgg ggagagctat ggagccaggg gcaccccaag tccagtgacc acaccttttc 120

aaaactgaaa aactcatata ttcagtattt tactcccaca gcacctcccc ccaatttgac 180

ccacagggac ccccatccag gtgcagggtc ctcgcctgtg tacagggcac acctttggtc 240

actccaaatt cccagagctc ccagggtcct tctcagggtc tccacctgga tg 292

<210> 113

<211> 259

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 113

ggtcagctct tcccttcatc acatacttgg agaacaaagg acaccgttat ccatgctttt 60

tcaacacatt acatgtggga ggttttcaaa actgaaaaac tcatatattc agtattttac 120

tcccacagca cctcccccca atttgaccca cagggacccc catccaggtg cagggtcctc 180

gcctgtgtac agggcacacc tttggtcact ccaaattccc agagctccca gggtccttct 240

cagggtctcc acctggatg 259

<210> 114

<211> 368

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 114

cagagggata ccatgcaaca taacctgata aagctccagc aggaaatggc tgatctagaa 60

gctgtgttag aacagcatgg gagccagcct tctaacagct acccttccat cataagtgac 120

acttctgccc ttgaggacct gcgaaatcca gaacaaagca catcagaaaa aggtgtgtat 180

tgttggccaa attttcaaaa ctgaaaaact catatattca gtattttact cccacagcac 240

ctccccccaa tttgacccac agggaccccc atccaggtgc agggtcctcg cctgtgtaca 300

gggcacacct ttggtcactc caaattccca gagctcccag ggtccttctc agggtctcca 360

cctggatg 368

<210> 115

<211> 366

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 115

tctcctgaac atctaaaaga tgaagtttct atcatccaaa gtatgggcta cagaaaccgt 60

gcctaaagac ttctacagag tgaacccgaa aatccttcct tggtaaaacc atttgttttc 120

ttcttcttct tcttcttctt ttcttttttt tttctttttt ttttttgaga tggagtcttg 180

ctctgtggct tttcaaaact gaaaaactca tatattcagt attttactcc cacagcacct 240

ccccccaatt tgacccacag ggacccccat ccaggtgcag ggtcctcgcc tgtgtacagg 300

gcacaccttt ggtcactcca aattcccaga gctcccaggg tccttctcag ggtctccacc 360

tggatg 366

<210> 116

<211> 360

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 116

ttcaggagga aaagcacaga actggccaac aattgcttga ctgttcttta ccatactgtt 60

tagcaggaaa ccagtctcag tgtccaactc tctaaccttg gaactgagag aactctgagg 120

acaaagcagc ggatacaacc tcaaaagacg tctgtctaca ttgaattggg taagggtctc 180

aggttttcaa aactgaaaaa ctcatatatt cagtatttta ctcccacagc acctcccccc 240

aatttgaccc acagggaccc ccatccaggt gcagggtcct cgcctgtgta cagggcacac 300

ctttggtcac tccaaattcc cagagctccc agggtccttc tcagggtctc cacctggatg 360

<210> 117

<211> 355

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 117

tgtgaatttt ctgagacgga tgtaacaaat actgaacatc atcaacccag taataatgat 60

ttgaacacca ctgagaagcg tgcagcagag aggcatccag aaaagtatca gggtagttct 120

gtttcaaact tgcatgtgga gccatgtggc acaaatactc atgccagctc attacagctt 180

ttcaaaactg aaaaactcat atattcagta ttttactccc acagcacctc cccccaattt 240

gacccacagg gacccccatc caggtgcagg gtcctcgcct gtgtacaggg cacacctttg 300

gtcactccaa attcccagag ctcccagggt ccttctcagg gtctccacct ggatg 355

<210> 118

<211> 371

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 118

aaagcagatt tggcagttca aaagactcct gaaatgataa atcagggtac taaccaaacg 60

gagcagaatg gtcaagtgat gaatattact aatagtggtc atgagaataa aacaaaaggt 120

gattctattc agaatgagaa aaatcctaac ccaatagaat cactcgaaaa agaatctgct 180

ttcaaaacga aagcttttca aaactgaaaa actcatatat tcagtatttt actcccacag 240

cacctccccc caatttgacc cacagggacc cccatccagg tgcagggtcc tcgcctgtgt 300

acagggcaca cctttggtca ctccaaattc ccagagctcc cagggtcctt ctcagggtct 360

ccacctggat g 371

<210> 119

<211> 337

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 119

tttttagcaa aagcgtccag aaaggagagc ttagcaggag tcctagccct ttctcccata 60

cacatttggc tcagggttac cgaagagggg ccaagaaatt agagtcctca gaagagaact 120

tatctagtga ggatgaagag cttccctgct tccaacactt ttttcaaaac tgaaaaactc 180

atatattcag tattttactc ccacagcacc tccccccaat ttgacccaca gggaccccca 240

tccaggtgca gggtcctcgc ctgtgtacag ggcacacctt tggtcactcc aaattcccag 300

agctcccagg gtccttctca gggtctccac ctggatg 337

<210> 120

<211> 368

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 120

cagagggata ccatgcaaca taacctgata aagctccagc aggaaatggc tgatctagaa 60

gctgtgttag aacagcatgg gagccagcct tctaacagct acccttccat cataagtgac 120

acttctgccc ttgaggacct gcgaaatcca gaacaaagca catcagaaaa aggtgtgtat 180

tgttggccaa attttcaaaa ctgaaaaact catatattca gtattttact cccacagcac 240

ctccccccaa tttgacccac agggaccccc atccaggtgc agggtcctcg cctgtgtaca 300

gggcacacct ttggtcactc caaattccca gagctcccag ggtccttctc agggtctcca 360

cctggatg 368

<210> 121

<211> 329

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 121

tttgttttct cattccattt aaagcagtat taacttcaca gaaaagtagt gaatacccta 60

taagccagaa tccagaaggc cattctgctg acaagtttga ggtgtctgca gatagttcta 120

ccagtaaaaa taaagaacca ggagtggaaa ggttttcaaa actgaaaaac tcatatattc 180

agtattttac tcccacagca cctcccccca atttgaccca cagggacccc catccaggtg 240

cagggtcctc gcctgtgtac agggcacacc tttggtcact ccaaattccc agagctccca 300

gggtccttct cagggtctcc acctggatg 329

<210> 122

<211> 284

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 122

aacttctccc attcctttca gagggaaccc cttacctgga atctggaatc tgcctcttct 60

ctgatgaccc tgaatctgat ccttctgaag acagagcccc agagtcattt tcaaaactga 120

aaaactcata tattcagtat tttactccca cagcacctcc ccccaatttg acccacaggg 180

acccccatcc aggtgcaggg tcctcgcctg tgtacagggc acacctttgg tcactccaaa 240

ttcccagagc tcccagggtc cttctcaggg tctccacctg gatg 284

<210> 123

<211> 315

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 123

gctctttagc ttcttaggac agcacttcct gattttgttt tcaacttcta atcctttgag 60

tgtttttcat tctgcagatg ctgagtttgt gtgtgtacgg acactgaaat attttctagg 120

aattgcggga ggaaaatgtt ttcaaaactg aaaaactcat atattcagta ttttactccc 180

acagcacctc cccccaattt gacccacagg gacccccatc caggtgcagg gtcctcgcct 240

gtgtacaggg cacacctttg gtcactccaa attcccagag ctcccagggt ccttctcagg 300

gtctccacct ggatg 315

<210> 124

<211> 333

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 124

tgacgtgtct gctccacttc cattgaagga agcttctctt tctcttatcc tgatgggttg 60

tgtttggttt ctttcagcat gattttgaag tcagaggaga tgtggtcaat ggatgaaacc 120

accaaggtcc aaagcgagca agagaatccc aggacatttt caaaactgaa aaactcatat 180

attcagtatt ttactcccac agcacctccc cccaatttga cccacaggga cccccatcca 240

ggtgcagggt cctcgcctgt gtacagggca cacctttggt cactccaaat tcccagagct 300

cccagggtcc ttctcagggt ctccacctgg atg 333

<210> 125

<211> 286

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 125

ttcccctgtc cctctctctt cctctcttct tccagatctt cagggggcta gaaatctgtt 60

gcaatgggcc cttcaccaac atgcccacag gtaagagcct gggagaacct tttcaaaact 120

gaaaaactca tatattcagt attttactcc cacagcacct ccccccaatt tgacccacag 180

ggacccccat ccaggtgcag ggtcctcgcc tgtgtacagg gcacaccttt ggtcactcca 240

aattcccaga gctcccaggg tccttctcag ggtctccacc tggatg 286

<210> 126

<211> 353

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 126

ggtagagggc ctgggttaag tatgcagatt actgcagtga ttttacatct aaatgtccat 60

tttagatcaa ctggaatgga tggtacagct gtgtggtgct tctgtggtgt aggagctttc 120

atcattcacc cttggcacag taagtattgg gtgccctgtc agagagggag gacacatttt 180

caaaactgaa aaactcatat attcagtatt ttactcccac agcacctccc cccaatttga 240

cccacaggga cccccatcca ggtgcagggt cctcgcctgt gtacagggca cacctttggt 300

cactccaaat tcccagagct cccagggtcc ttctcagggt ctccacctgg atg 353

<210> 127

<211> 292

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 127

gtggttcggc tttcaccagt ctgtgcgccc tgccatgtgg aagatgatgc tcaacattga 60

tggtgtgtgg ggagagctat ggagccaggg gcaccccaag tccagtgacc acaccttttc 120

aaaactgaaa aactcatata ttcagtattt tactcccaca gcacctcccc ccaatttgac 180

ccacagggac ccccatccag gtgcagggtc ctcgcctgtg tacagggcac acctttggtc 240

actccaaatt cccagagctc ccagggtcct tctcagggtc tccacctgga tg 292

<210> 128

<211> 259

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 128

ggtcagctct tcccttcatc acatacttgg agaacaaagg acaccgttat ccatgctttt 60

tcaacacatt acatgtggga ggttttcaaa actgaaaaac tcatatattc agtattttac 120

tcccacagca cctcccccca atttgaccca cagggacccc catccaggtg cagggtcctc 180

gcctgtgtac agggcacacc tttggtcact ccaaattccc agagctccca gggtccttct 240

cagggtctcc acctggatg 259

<210> 129

<211> 262

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 129

agcaacctgt tacatattaa agttttatta tactacattt ttctacatcc tttgttttag 60

ggtgttgatt gcctttgctc agtatttttc aaaactgaaa aactcatata ttcagtattt 120

tactcccaca gcacctcccc ccaatttgac ccacagggac ccccatccag gtgcagggtc 180

ctcgcctgtg tacagggcac acctttggtc actccaaatt cccagagctc ccagggtcct 240

tctcagggtc tccacctgga tg 262