一种用于检测BRCA1基因长片段拷贝数变异的试剂盒
文献发布时间:2023-06-19 10:16:30
技术领域
本发明涉及一种用于检测BRCA1基因长片段拷贝数变异的试剂盒,特别涉及一种基于MassArray飞行时间质谱的多重反应,并对BRCA1基因所有外显子的拷贝数进行分析。
背景技术
乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一,其发病率逐年上升;其病因比较复杂,包括:遗传、激素、生殖、营养和环境等多方面。据报道,每年全世界约有140万人被诊断为乳腺癌,而大约有50万人死于该病。我国仅2015年新发乳腺癌病例就已高达27.2万,死亡病例数约7.1万。乳腺癌的早期筛查和发现及治疗是有效防治乳腺癌的关键。
乳腺癌易感基因1(BRCA1)和乳腺癌易感基因2(BRCA2)的胚系缺陷是导致乳腺癌遗传易感性的最常见因素。与散发性乳腺癌相比,遗传性乳腺癌的特点是诊断年龄小,双侧病变多,男性亲属发病率高。BRCA1和BRCA2基因突变约占遗传性乳腺癌的20%-25%,占所有乳腺癌的5%-10%。此外,BRCA1和BRCA2基因突变占卵巢癌的15%左右。
BRCA1基因定位于人类第17号染色体q21,长约81kb。常染色体显性遗传,有很高的外显率。在活细胞中,BRCA1具有多种功能,包括双链DNA断裂修复、参与基因组监视、转录偶联DNA修复、转录调控、染色质重塑以及泛素连接和细胞周期检查点阻滞等。BRCA1功能丧失可导致自发染色体断裂、对DNA损伤的敏感性、染色体不对称分离、非整倍体增加等,最终导致肿瘤形成。BRCA1基因突变人群患乳腺癌和卵巢癌的风险分别是50%-85%和15%-45%。因此BRCA1基因的突变检测对乳腺癌和卵巢癌的早期诊断和治疗具有重要意义。
BRCA1突变主要包括单个碱基变化或少量碱基的缺失/插入,导致蛋白截断、mRNA加工破坏或对蛋白功能有显著影响的氨基酸替换。这些突变很容易通过PCR和测序进行检测。还有少数的BRCA1基因突变是破坏基因功能的DNA长片段拷贝数变异(Copy numbervariation,CNV),包括1个或多个外显子的缺失和重复,占总突变的10-15%。这种类型的突变难以通过测序检测。现有的BRCA1基因的突变检测技术的缺点是,大多只检测碱基的突变和少量碱基的缺失/插入,没有检测长片段拷贝数变异。本方法采用特异的PCR引物、人工内标(competitor)和延伸引物,基于MassArray飞行时间质谱的多重反应,可以高通量检测样本,降低成本。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于检测BRCA1基因长片段拷贝数变异的试剂盒,对BRCA1基因的23个外显子的拷贝数进行检测。
为实现上述目的,本发明采用的技术方案如下:
一种用于检测BRCA1基因长片段拷贝数变异的试剂盒,包括样品检测孔W1和样品检测孔W2;样品检测孔W1包括W1多重PCR反应体系、虾碱性磷酸酶(SAP)反应体系以及W1延伸反应体系;样品检测孔W2包括W2多重PCR反应体系、虾碱性磷酸酶(SAP)反应体系以及W2延伸反应体系。
W1多重PCR反应体系包括PCR Buffer、MgCl
进一步的,W1多重PCR反应体系中PCR引物Pool的序列如下:
进一步的,W1多重PCR反应体系中人工内标的序列如下:
W2多重PCR反应体系包括PCR Buffer、MgCl
进一步的,W2多重PCR反应体系中PCR引物Pool的序列如下:
进一步的,W2多重PCR反应体系中人工内标的序列如下:
W1和W2的SAP反应体系均包括SAP酶以及SAP Buffer。
W1延伸反应体系包括Buffer Plus、Termination Mix、W1延伸引物混合物以及iPLEX Enzyme;W2延伸反应体系包括Buffer Plus、Termination Mix、W2延伸引物混合物以及iPLEX Enzyme。
进一步的,W1延伸引物混合物的序列如下:
W2延伸引物混合物的序列如下:
在本发明的一个优选实施例中,所述检测方法步骤如下:
1)采用商业化的DNA提取试剂盒提取人基因组DNA,稀释至10ng/μl;
2)通过PCR扩增反应,获得样品检测孔W1和W2的目的片段的扩增产物;
3)通过SAP反应,除去样品检测孔W1和W2的扩增产物中含有的dNTPs;
4)通过延伸反应,在延伸引物的3’端连接一个碱基,同时延伸出了人基因组DNA的产物和人工内标的产物;
5)采用树脂纯化延伸反应的产物;
6)将纯化后的产物点样在芯片基质上共结晶,转入质谱仪的真空管,然后用激光激发进行质谱检测;
7)根据质谱结果,进行数据分析,计算各个外显子的拷贝数。
本发明的目的之二在于一种利用所述检测试剂盒的应用,所述应用为后期开发用于乳腺癌和卵巢癌等BRCA1相关的癌症的辅助诊断和用药指导。
由于采用了以上技术,本发明较现有技术相比,具有的有益效果如下:
本发明开发了一种用于检测BRCA1基因长片段拷贝数变异的试剂盒,开发了一款快速、大通量、准确性高、成本低的乳腺癌和卵巢癌辅助诊断产品,弥补了现有技术的不足,可对乳腺癌和卵巢癌等BRCA1相关的癌症进行辅助诊断和用药指导。
附图说明
图1是BRCA1发生缺失的MassArray结果图;
图2是BRCA1发生重复的MassArray结果图;
图3是BRCA1发生缺失的结果计算柱状图;
图4是BRCA1发生重复的结果计算柱状图;
图5是人工内标与人基因组DNA的对比示意图,其中在延伸引物3’端的延伸位置有一个碱基的不同;
图6是人工内标的延伸产物峰(人工内标峰)与人基因组DNA的延伸产物峰(目标峰)的示意图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式,进一步阐明本发明。
实施例1
1.BRCA1基因长片段拷贝数变异的检测:
1)DNA样本的准备
人基因组DNA的提取采用商业化的DNA提取试剂盒。得到的DNA质量,用Nano300检测须符合OD
2)PCR扩增反应
本申请当中优选的扩增引物组合序列见表1-表4,扩增引物为内参基因和BRCA1基因的23个外显子的特异性引物。内参基因扩增引物和延伸引物的目标片段为人源基因RNaseP、EIF2C1和ALB的一段。每个样本分2个孔检测,分别为W1和W2。W1中的16对引物分别按照终浓度0.5μM进行混合,配制成W1的PCR引物Pool;W2中的17对引物分别按照终浓度0.5μM进行混合,配制成W2的PCR引物Pool。
表1.W1的BRCA1基因扩增引物序列
表2.W1的内参基因扩增引物序列
表3.W2的BRCA1基因扩增引物序列
表4.W2的内参基因扩增引物序列
上述用于检测BRCA1基因长片段拷贝数变异的试剂盒设有人工内标,人工内标为与目标扩增片段仅有1碱基不同的双链DNA合成片段。不同的碱基为延伸引物在延伸反应时延伸的3’端碱基(如图5、图6所示),作为内部对照。具体的人工内标序列见表5-表6。W1的15个人工内标按终浓度相当于3000拷贝/μl人基因组DNA的量混合;W2的15个人工内标也按终浓度相当于3000拷贝/μl人基因组DNA的量混合。分别得到W1人工内标混合物和W2人工内标混合物。
表5.W1的人工内标序列
表6.W2的人工内标序列
上述用于检测BRCA1基因长片段拷贝数变异的试剂盒所使用的多重PCR反应体系中含有PCR Buffer、MgCl
表7.PCR扩增反应体系
表8.PCR扩增反应程序
3)SAP反应
上述SAP反应体系含有SAP酶和SAP Buffer(购于Agena BioScience公司,货号10141)。PCR扩增后,取5ul产物进行SAP反应。SAP反应体系见表9,反应程序见表10。
表9.SAP反应体系
表10.SAP反应程序
4)延伸反应
上述延伸反应体系含有Buffer Plus、Termination Mix和iPLEX Enzyme(购于Agena BioScience公司,货号10141),以及延伸引物混合物。本申请当中优选的延伸引物组合序列见表12-表15,延伸引物为BRCA1基因和内参基因的特异性引物。W1中的16条延伸引物(UEP)按照表11的规则进行混合,配制成W1的UEP混合物;W2中的17条延伸引物(UEP)按照表11的规则进行混合,配制成W2的UEP混合物。SAP反应结束后,进行延伸反应。延伸反应体系见表16,其中W1孔使用W1的UEP混合物,W2孔使用W2的UEP混合物。反应程序见表17。
表11.延伸引物(UEP)混合物配制表
表12.W1的BRCA1基因延伸引物序列
表13.W1的内参基因延伸引物序列
表14.W2的BRCA1基因延伸引物序列
表15.W2的内参基因延伸引物序列
表16.延伸反应体系
表17.延伸反应程序
5)脱盐
向延伸反应的产物中加入19ul超纯水,放入MassArray-CPM机器中,设置机器加入10ul的树脂,进行脱盐纯化,并静置沉降。
6)质谱检测
MassArray-CPM自动化地将产物点样在芯片上,并移入真空管中,然后用激光激发,进行飞行时间质谱。一张芯片最多可以同时检测192个样本,增加了通量,减少了成本。
2.数据分析
用Typer软件打开实验结果,可以对散点图进行分析。外显子缺失或者重复的样本,其结果会散落在正常样本的聚堆之外(如图1和图2圈出的部分)。我们需要对数据进行进一步的分析,在Typer软件中点击View--Plate Data Pane导出数据表。根据数据表中的每个目标片段的检测样本基因组DNA(gDNA)的FREQ参数和人工内标的FREQ参数,按照以下公式计算拷贝数。
然后用阴性对照样本和检测样本的拷贝数进行如下计算。
多个内参基因,则取其拷贝数比值的平均值。
根据3个阴性对照样本的拷贝数比值,计算得到3个TR,再取平均值。
根据TR值,判断如下:
根据上述算法,用RStudio编辑器编写代码后,可直接上传实验数据,得到最终的TR值。根据TR值做柱状图,TR≤0.65时,且该外显子的柱形图明显低于其他柱形图(如图3所示),结果为外显子缺失;TR≥1.5时,且该外显子的柱形图明显高于其他柱形图(如图4所示),结果为外显子重复。如果TR在0.65-0.8和1.2-1.5之间,则为灰区值,需要重新检测,或者通过其他方法进行验证。
3.质控标准
质量控制,每次试验需做2个阳性对照、3个阴性对照和3个空白对照。缺失阳性对照的TR≤0.65,重复阳性对照TR≥1.5,空白对照的TR=0。
4.产品性能指标:
本方法能特异检测BRCA1的23个外显子的1个或多个缺失和重复。
检测2份阳性参考品、10份阴性参考品,符合率为100%;企业重复性参考品重复检测10次,10次结果相同。检测未知样本,其符合率为98.6%。
实施例2
1.根据实验结果的TR值,判断如下:
根据上述算法,用RStudio编辑器编写代码后,可直接上传实验数据,得到最终的TR值。根据TR值做柱状图,TR≤0.65时,且该外显子的柱形图明显低于其他柱形图(如图3所示),结果为外显子缺失;TR≥1.5时,且该外显子的柱形图明显高于其他柱形图(如图4所示),结果为外显子重复。如果TR在0.65-0.8和1.2-1.5之间,则为灰区值,需要重新检测,或者通过其他方法进行验证。
2.质控标准
质量控制,每次试验需做2个阳性对照、3个阴性对照和3个空白对照。缺失阳性对照的TR≤0.65,重复阳性对照TR≥1.5,空白对照的TR=0。
3.辅助诊断和用药指导
当质控符合标准,即实验结果可靠时,TR≤0.65,说明该外显子缺失;TR≥1.5,说明该外显子重复。外显子缺失或者重复,导致BRCA1蛋白正常功能丧失,为致病突变,增加了肿瘤患病风险。受检者的一级亲属,包括父母、孩子、兄弟和姐妹,拥有和受检者最相近的遗传基因,有50%的可能携带有同样的突变。另外,一些远亲,比如叔、伯、姑、舅、姨、祖父母、外祖父母、表兄妹或堂兄妹等,也有可能携带同样的突变。本试剂盒的检测有助于了解突变基因携带情况,辅助医生评估患病风险,及时监控早期干预。
乳腺癌NCCN指南推荐(1)对所有复发或转移性乳腺癌患者进行胚系BRCA1/2突变评估,以确定适合接受PARP抑制剂治疗的患者。尽管FDA规定奥拉帕尼和他拉唑帕尼适用于HER2-阴性疾病,但专家组支持其用于胚系BRCA1或BRCA2突变相关的任何乳腺癌亚型。(2)对于携带胚系BRCA1/2突变的三阴性复发/IV期乳腺癌患者,NCCN专家组已将铂类药物(顺铂和卡铂)列为首选治疗方案。
卵巢癌NCCN指南推荐(1)在初始治疗中,未接受含贝伐单抗治疗且获得完全缓解/部分缓解(CR/PR)的携带BRCA1/2胚系或体细胞突变的II-IV期卵巢癌患者,可接受奥拉帕利(I类推荐)或尼拉帕利(I类推荐)单药维持治疗;BRCA1/2基因野生型,获得CR/PR的患者,可接受尼拉帕利单药维持治疗。(2)在初始治疗中,接受含贝伐单抗治疗且获得CR/PR的携带BRCA1/2胚系或体细胞突变的II-IV期卵巢癌患者,可接受贝伐单抗联合奥拉帕利(I类推荐)或奥拉帕利或尼拉帕利维持治疗;BRCA1/2基因野生型,获得CR/PR的患者,可接受贝伐单抗联合奥拉帕利维持治疗。(3)还推荐奥拉帕利、尼拉帕利或芦卡帕利用于既往接受以铂类为基础的化疗后有完全或部分缓解的复发性卵巢上皮癌、输卵管癌或原发性腹膜癌患者的维持治疗。
本发明开发了一种用于检测BRCA1基因长片段拷贝数变异的试剂盒,开发了一款快速、大通量、准确性高、成本低的乳腺癌和卵巢癌辅助诊断产品,弥补了现有技术的不足,只需采集血液、口拭子等无创筛查样本就可对乳腺癌和卵巢癌等BRCA1相关的癌症进行辅助诊断和用药指导。
本试剂盒的检测有助于辅助医生在治疗乳腺癌病患、卵巢癌病患的过程中选择更有效的药物,进行更有效的治疗。
上述实施例仅为本发明的优选技术方案,而不应视为对于本发明的限制,本发明的保护范围应以权利要求记载的技术方案,包括权利要求记载的技术方案中技术特征的等同替换方案为保护范围,即在此范围内的等同替换改进,也在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 申友基因组研究院(南京)有限公司
<120> 一种用于检测BRCA1基因长片段拷贝数变异的试剂盒
<160> 129
<170> SIPOSequenceListing 1.0
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<210> 57
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 57
cgttggatgt ttttgcagaa tccaaactga 30
<210> 58
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 58
acgttggatg gctagaggaa aactttgagg 30
<210> 59
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 59
acgttggatg gttctctttg actcacctgc aa 32
<210> 60
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 60
acgttggatg gtcatcccct tctaaatgcc 30
<210> 61
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 61
acgttggatg tttggccaac aatacacacc 30
<210> 62
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 62
acgttggatg gtggttcggc tttcaccagt ctg 33
<210> 63
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 63
acgttggatg ggtcagctct tcccttcatc 30
<210> 64
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 64
acgttggatg ggtgtggtca ctggacttgg g 31
<210> 65
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 65
acgttggatg cctcccacat gtaatgtgtt g 31
<210> 66
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 66
gttggatgtg tgaattttct gagacggatg 30
<210> 67
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 67
acgttggatg tgacgtgtct gctccacttc 30
<210> 68
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 68
ggatgtttgt tttctcattc catttaaagc 30
<210> 69
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 69
cgttggatgt ttttagcaaa agcgtccaga 30
<210> 70
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 70
tggatgtctc ctgaacatct aaaagatgaa 30
<210> 71
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 71
acgttggatg cagagggata ccatgcaaca 30
<210> 72
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 72
cgttggatga aagcagattt ggcagttcaa 30
<210> 73
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 73
gttggatgaa cttctcccat tcctttcaga 30
<210> 74
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 74
acgttggatg ggtagagggc ctgggttaag 30
<210> 75
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 75
acgttggatg gctctttagc ttcttaggac 30
<210> 76
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 76
tggtttttct aatgtgttaa agttcattgg 30
<210> 77
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 77
acgttggatg tttctcagat aactgggccc ctg 33
<210> 78
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 78
acgttggatg ttcccctgtc cctctctctt 30
<210> 79
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 79
cgttggatgt tcaggaggaa aagcacagaa 30
<210> 80
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 80
acgttggatg gctgtaatga gctggcatga 30
<210> 81
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 81
acgttggatg tgtcctggga ttctcttgct 30
<210> 82
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 82
cgttggatgc ctttccactc ctggttcttt 30
<210> 83
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 83
acgttggatg aagtgttgga agcagggaag 30
<210> 84
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 84
acgttggatg gccacagagc aagactccat 30
<210> 85
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 85
acgttggatg tttggccaac aatacacacc 30
<210> 86
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 86
gttggatggc tttcgttttg aaagcagatt 30
<210> 87
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 87
acgttggatg tgactctggg gctctgtctt 30
<210> 88
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 88
acgttggatg tgtgtcctcc ctctctgaca 30
<210> 89
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 89
acgttggatg cattttcctc ccgcaattcc 30
<210> 90
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 90
acgttggatg cagagtggat ggagaacaag g 31
<210> 91
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 91
acgttggatg cctctcaggt tccgcccc 28
<210> 92
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 92
acgttggatg ggttctccca ggctcttacc 30
<210> 93
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 93
cgttggatgc ctgagaccct tacccaattc 30
<210> 94
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 94
acgttggatg ggtcagctct tcccttcatc 30
<210> 95
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 95
acgttggatg gtggttcggc tttcaccagt ctg 33
<210> 96
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 96
acgttggatg agcaacctgt tacatattaa agtt 34
<210> 97
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 97
acgttggatg cctcccacat gtaatgtgtt g 31
<210> 98
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 98
acgttggatg ggtgtggtca ctggacttgg g 31
<210> 99
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 99
acgttggatg atactgagca aaggcaatca ac 32
<210> 100
<211> 287
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 100
ttctttttct ccccccctac cctgctagtc tggagttgat caaggaacct gactccacaa 60
agtgtgacca catattttgc aagtaagttt gaatgtgtta tgtggctcca ttttcaaaac 120
tgaaaaactc atatattcag tattttactc ccacagcacc tccccccaat ttgacccaca 180
gggaccccca tccaggtgca gggtcctcgc ctgtgtacag ggcacacctt tggtcactcc 240
aaattcccag agctcccagg gtccttctca gggtctccac ctggatg 287
<210> 101
<211> 372
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 101
tttgcctttt gagtattctt tctacaaaag gaagtaaatt aaattgttct ttctttcttt 60
ataatttata gattttgcat gctgaaactt ctcaacctga agaaagggcc ttcacagtgt 120
cctttatgta agaatgatat aaccaaaagg tatataattt ggtaatgatg ctaggttgga 180
agcaaccaca gtaggttttc aaaactgaaa aactcatata ttcagtattt tactcccaca 240
gcacctcccc ccaatttgac ccacagggac ccccatccag gtgcagggtc ctcgcctgtg 300
tacagggcac acctttggtc actccaaatt cccagagctc ccagggtcct tctcagggtc 360
tccacctgga tg 372
<210> 102
<211> 302
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 102
cacttgctga gtgtgtttct caaacaattt aatttcagga gcctacaaga aagtacgaga 60
tttagtctac ttgttgaaga gctattgaaa atcatttgtg cttttcagct tgacacaggt 120
ttggattttc aaaactgaaa aactcatata ttcagtattt tactcccaca gcacctcccc 180
ccaatttgac ccacagggac ccccatccag gtgcagggtc ctcgcctgtg tacagggcac 240
acctttggtc actccaaatt cccagagctc ccagggtcct tctcagggtc tccacctgga 300
tg 302
<210> 103
<211> 366
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 103
ctcagtaaat atttctagtt gaatatctgt ttttcaacaa gtacattttt ttaacccttt 60
taattaagaa aacttttatt gatttatttt ttggggggaa attttttagg atctgattct 120
tctgaagata ccgttaataa ggctacttat tgcaggtgag tcaaagagaa cctttgtcta 180
tgaagctggt tttcaaaact gaaaaactca tatattcagt attttactcc cacagcacct 240
ccccccaatt tgacccacag ggacccccat ccaggtgcag ggtcctcgcc tgtgtacagg 300
gcacaccttt ggtcactcca aattcccaga gctcccaggg tccttctcag ggtctccacc 360
tggatg 366
<210> 104
<211> 361
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 104
tggtcagctt tctgtaatcg aaagagctaa aatgtttgat cttggtcatt tgacagttct 60
gcatacatgt aactagtgtt tcttattagg actctgtctt ttccctatag tgtgggagat 120
caagaattgt tacaaatctc ccctcaagga accagggatg aaatcagttt ggattctgca 180
aaaattttca aaactgaaaa actcatatat tcagtatttt actcccacag cacctccccc 240
caatttgacc cacagggacc cccatccagg tgcagggtcc tcgcctgtgt acagggcaca 300
cctttggtca ctccaaattc ccagagctcc cagggtcctt ctcagggtct ccacctggat 360
g 361
<210> 105
<211> 293
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 105
gttgttctag cagtgaagag ataaagaaaa aaaagtacaa ccaaatgcca gtcaggcaca 60
gcagaaacct acaactcttg gaaggtaaag aacctgcaac tggagccaag aagagttttt 120
caaaactgaa aaactcatat attcagtatt ttactcccac agcacctccc cccaatttga 180
cccacaggga cccccatcca ggtgcagggt cctcgcctgt gtacagggca cacctttggt 240
cactccaaat tcccagagct cccagggtcc ttctcagggt ctccacctgg atg 293
<210> 106
<211> 268
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 106
gctagaggaa aactttgagg aacattcaat gtcacctgta agagaaatgg gaaatgagaa 60
cattccaagt acagtgagca caattagccg tttttcaaaa ctgaaaaact catatattca 120
gtattttact cccacagcac ctccccccaa tttgacccac agggaccccc atccaggtgc 180
agggtcctcg cctgtgtaca gggcacacct ttggtcactc caaattccca gagctcccag 240
ggtccttctc agggtctcca cctggatg 268
<210> 107
<211> 282
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 107
taaggtgaag cagcatctgg gtgtgagagt gaaacaagcg tctctgaaga cagctcaggg 60
ctatcctctc agagtgacat tttaaccact caggtaaaaa gcgtgttttc aaaactgaaa 120
aactcatata ttcagtattt tactcccaca gcacctcccc ccaatttgac ccacagggac 180
ccccatccag gtgcagggtc ctcgcctgtg tacagggcac acctttggtc actccaaatt 240
cccagagctc ccagggtcct tctcagggtc tccacctgga tg 282
<210> 108
<211> 279
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 108
gtcatcccct tctaaatgcc catcattaga tgataggtgg tacatgcaca gttgctctgg 60
gagacttcag aatagaaact acccatctca agaggagctc atttttcaaa actgaaaaac 120
tcatatattc agtattttac tcccacagca cctcccccca atttgaccca cagggacccc 180
catccaggtg cagggtcctc gcctgtgtac agggcacacc tttggtcact ccaaattccc 240
agagctccca gggtccttct cagggtctcc acctggatg 279
<210> 109
<211> 367
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 109
ttctgagctg tgtgctagag gtaactcatg ataatggaat atttgattta atttcagatg 60
ctcgtgtaca agtttgccag aaaactccac atcactttaa ctaatctaat tactgaagag 120
actactcatg ttgttatgaa aacaggtata ccaagaacct ttacagaata ccttgcatct 180
gctgcataaa ttttcaaaac tgaaaaactc atatattcag tattttactc ccacagcacc 240
tccccccaat ttgacccaca gggaccccca tccaggtgca gggtcctcgc ctgtgtacag 300
ggcacacctt tggtcactcc aaattcccag agctcccagg gtccttctca gggtctccac 360
ctggatg 367
<210> 110
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 110
aaagagcacg ttcttctgct gtatgtaacc tgtcttttct atgatctctt taggggtgac 60
ccagtcaatt aaagaaagaa aaatgctgaa tgaggtaagt acttgatgtt acaaactaac 120
cagagatatt cattcagtca tatagttaaa aatgtatttg cttccttcca tcaatgcacc 180
ttttcaaaac tgaaaaactc atatattcag tattttactc ccacagcacc tccccccaat 240
ttgacccaca gggaccccca tccaggtgca gggtcctcgc ctgtgtacag ggcacacctt 300
tggtcactcc aaattcccag agctcccagg gtccttctca gggtctccac ctggatg 357
<210> 111
<211> 319
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 111
aagtgacagt tccagtagtc ctactttgac actttgaatg ctctttcctt cctggggatc 60
cagggtgtcc acccaattga ggttgtgcag ccagatgcct ggacagagga caatggcttc 120
catggtaagg tgcctgcatg tattttcaaa actgaaaaac tcatatattc agtattttac 180
tcccacagca cctcccccca atttgaccca cagggacccc catccaggtg cagggtcctc 240
gcctgtgtac agggcacacc tttggtcact ccaaattccc agagctccca gggtccttct 300
cagggtctcc acctggatg 319
<210> 112
<211> 292
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 112
gtggttcggc tttcaccagt ctgtgcgccc tgccatgtgg aagatgatgc tcaacattga 60
tggtgtgtgg ggagagctat ggagccaggg gcaccccaag tccagtgacc acaccttttc 120
aaaactgaaa aactcatata ttcagtattt tactcccaca gcacctcccc ccaatttgac 180
ccacagggac ccccatccag gtgcagggtc ctcgcctgtg tacagggcac acctttggtc 240
actccaaatt cccagagctc ccagggtcct tctcagggtc tccacctgga tg 292
<210> 113
<211> 259
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 113
ggtcagctct tcccttcatc acatacttgg agaacaaagg acaccgttat ccatgctttt 60
tcaacacatt acatgtggga ggttttcaaa actgaaaaac tcatatattc agtattttac 120
tcccacagca cctcccccca atttgaccca cagggacccc catccaggtg cagggtcctc 180
gcctgtgtac agggcacacc tttggtcact ccaaattccc agagctccca gggtccttct 240
cagggtctcc acctggatg 259
<210> 114
<211> 368
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 114
cagagggata ccatgcaaca taacctgata aagctccagc aggaaatggc tgatctagaa 60
gctgtgttag aacagcatgg gagccagcct tctaacagct acccttccat cataagtgac 120
acttctgccc ttgaggacct gcgaaatcca gaacaaagca catcagaaaa aggtgtgtat 180
tgttggccaa attttcaaaa ctgaaaaact catatattca gtattttact cccacagcac 240
ctccccccaa tttgacccac agggaccccc atccaggtgc agggtcctcg cctgtgtaca 300
gggcacacct ttggtcactc caaattccca gagctcccag ggtccttctc agggtctcca 360
cctggatg 368
<210> 115
<211> 366
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 115
tctcctgaac atctaaaaga tgaagtttct atcatccaaa gtatgggcta cagaaaccgt 60
gcctaaagac ttctacagag tgaacccgaa aatccttcct tggtaaaacc atttgttttc 120
ttcttcttct tcttcttctt ttcttttttt tttctttttt ttttttgaga tggagtcttg 180
ctctgtggct tttcaaaact gaaaaactca tatattcagt attttactcc cacagcacct 240
ccccccaatt tgacccacag ggacccccat ccaggtgcag ggtcctcgcc tgtgtacagg 300
gcacaccttt ggtcactcca aattcccaga gctcccaggg tccttctcag ggtctccacc 360
tggatg 366
<210> 116
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 116
ttcaggagga aaagcacaga actggccaac aattgcttga ctgttcttta ccatactgtt 60
tagcaggaaa ccagtctcag tgtccaactc tctaaccttg gaactgagag aactctgagg 120
acaaagcagc ggatacaacc tcaaaagacg tctgtctaca ttgaattggg taagggtctc 180
aggttttcaa aactgaaaaa ctcatatatt cagtatttta ctcccacagc acctcccccc 240
aatttgaccc acagggaccc ccatccaggt gcagggtcct cgcctgtgta cagggcacac 300
ctttggtcac tccaaattcc cagagctccc agggtccttc tcagggtctc cacctggatg 360
<210> 117
<211> 355
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 117
tgtgaatttt ctgagacgga tgtaacaaat actgaacatc atcaacccag taataatgat 60
ttgaacacca ctgagaagcg tgcagcagag aggcatccag aaaagtatca gggtagttct 120
gtttcaaact tgcatgtgga gccatgtggc acaaatactc atgccagctc attacagctt 180
ttcaaaactg aaaaactcat atattcagta ttttactccc acagcacctc cccccaattt 240
gacccacagg gacccccatc caggtgcagg gtcctcgcct gtgtacaggg cacacctttg 300
gtcactccaa attcccagag ctcccagggt ccttctcagg gtctccacct ggatg 355
<210> 118
<211> 371
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 118
aaagcagatt tggcagttca aaagactcct gaaatgataa atcagggtac taaccaaacg 60
gagcagaatg gtcaagtgat gaatattact aatagtggtc atgagaataa aacaaaaggt 120
gattctattc agaatgagaa aaatcctaac ccaatagaat cactcgaaaa agaatctgct 180
ttcaaaacga aagcttttca aaactgaaaa actcatatat tcagtatttt actcccacag 240
cacctccccc caatttgacc cacagggacc cccatccagg tgcagggtcc tcgcctgtgt 300
acagggcaca cctttggtca ctccaaattc ccagagctcc cagggtcctt ctcagggtct 360
ccacctggat g 371
<210> 119
<211> 337
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 119
tttttagcaa aagcgtccag aaaggagagc ttagcaggag tcctagccct ttctcccata 60
cacatttggc tcagggttac cgaagagggg ccaagaaatt agagtcctca gaagagaact 120
tatctagtga ggatgaagag cttccctgct tccaacactt ttttcaaaac tgaaaaactc 180
atatattcag tattttactc ccacagcacc tccccccaat ttgacccaca gggaccccca 240
tccaggtgca gggtcctcgc ctgtgtacag ggcacacctt tggtcactcc aaattcccag 300
agctcccagg gtccttctca gggtctccac ctggatg 337
<210> 120
<211> 368
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 120
cagagggata ccatgcaaca taacctgata aagctccagc aggaaatggc tgatctagaa 60
gctgtgttag aacagcatgg gagccagcct tctaacagct acccttccat cataagtgac 120
acttctgccc ttgaggacct gcgaaatcca gaacaaagca catcagaaaa aggtgtgtat 180
tgttggccaa attttcaaaa ctgaaaaact catatattca gtattttact cccacagcac 240
ctccccccaa tttgacccac agggaccccc atccaggtgc agggtcctcg cctgtgtaca 300
gggcacacct ttggtcactc caaattccca gagctcccag ggtccttctc agggtctcca 360
cctggatg 368
<210> 121
<211> 329
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 121
tttgttttct cattccattt aaagcagtat taacttcaca gaaaagtagt gaatacccta 60
taagccagaa tccagaaggc cattctgctg acaagtttga ggtgtctgca gatagttcta 120
ccagtaaaaa taaagaacca ggagtggaaa ggttttcaaa actgaaaaac tcatatattc 180
agtattttac tcccacagca cctcccccca atttgaccca cagggacccc catccaggtg 240
cagggtcctc gcctgtgtac agggcacacc tttggtcact ccaaattccc agagctccca 300
gggtccttct cagggtctcc acctggatg 329
<210> 122
<211> 284
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 122
aacttctccc attcctttca gagggaaccc cttacctgga atctggaatc tgcctcttct 60
ctgatgaccc tgaatctgat ccttctgaag acagagcccc agagtcattt tcaaaactga 120
aaaactcata tattcagtat tttactccca cagcacctcc ccccaatttg acccacaggg 180
acccccatcc aggtgcaggg tcctcgcctg tgtacagggc acacctttgg tcactccaaa 240
ttcccagagc tcccagggtc cttctcaggg tctccacctg gatg 284
<210> 123
<211> 315
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 123
gctctttagc ttcttaggac agcacttcct gattttgttt tcaacttcta atcctttgag 60
tgtttttcat tctgcagatg ctgagtttgt gtgtgtacgg acactgaaat attttctagg 120
aattgcggga ggaaaatgtt ttcaaaactg aaaaactcat atattcagta ttttactccc 180
acagcacctc cccccaattt gacccacagg gacccccatc caggtgcagg gtcctcgcct 240
gtgtacaggg cacacctttg gtcactccaa attcccagag ctcccagggt ccttctcagg 300
gtctccacct ggatg 315
<210> 124
<211> 333
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 124
tgacgtgtct gctccacttc cattgaagga agcttctctt tctcttatcc tgatgggttg 60
tgtttggttt ctttcagcat gattttgaag tcagaggaga tgtggtcaat ggatgaaacc 120
accaaggtcc aaagcgagca agagaatccc aggacatttt caaaactgaa aaactcatat 180
attcagtatt ttactcccac agcacctccc cccaatttga cccacaggga cccccatcca 240
ggtgcagggt cctcgcctgt gtacagggca cacctttggt cactccaaat tcccagagct 300
cccagggtcc ttctcagggt ctccacctgg atg 333
<210> 125
<211> 286
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 125
ttcccctgtc cctctctctt cctctcttct tccagatctt cagggggcta gaaatctgtt 60
gcaatgggcc cttcaccaac atgcccacag gtaagagcct gggagaacct tttcaaaact 120
gaaaaactca tatattcagt attttactcc cacagcacct ccccccaatt tgacccacag 180
ggacccccat ccaggtgcag ggtcctcgcc tgtgtacagg gcacaccttt ggtcactcca 240
aattcccaga gctcccaggg tccttctcag ggtctccacc tggatg 286
<210> 126
<211> 353
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 126
ggtagagggc ctgggttaag tatgcagatt actgcagtga ttttacatct aaatgtccat 60
tttagatcaa ctggaatgga tggtacagct gtgtggtgct tctgtggtgt aggagctttc 120
atcattcacc cttggcacag taagtattgg gtgccctgtc agagagggag gacacatttt 180
caaaactgaa aaactcatat attcagtatt ttactcccac agcacctccc cccaatttga 240
cccacaggga cccccatcca ggtgcagggt cctcgcctgt gtacagggca cacctttggt 300
cactccaaat tcccagagct cccagggtcc ttctcagggt ctccacctgg atg 353
<210> 127
<211> 292
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 127
gtggttcggc tttcaccagt ctgtgcgccc tgccatgtgg aagatgatgc tcaacattga 60
tggtgtgtgg ggagagctat ggagccaggg gcaccccaag tccagtgacc acaccttttc 120
aaaactgaaa aactcatata ttcagtattt tactcccaca gcacctcccc ccaatttgac 180
ccacagggac ccccatccag gtgcagggtc ctcgcctgtg tacagggcac acctttggtc 240
actccaaatt cccagagctc ccagggtcct tctcagggtc tccacctgga tg 292
<210> 128
<211> 259
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 128
ggtcagctct tcccttcatc acatacttgg agaacaaagg acaccgttat ccatgctttt 60
tcaacacatt acatgtggga ggttttcaaa actgaaaaac tcatatattc agtattttac 120
tcccacagca cctcccccca atttgaccca cagggacccc catccaggtg cagggtcctc 180
gcctgtgtac agggcacacc tttggtcact ccaaattccc agagctccca gggtccttct 240
cagggtctcc acctggatg 259
<210> 129
<211> 262
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 129
agcaacctgt tacatattaa agttttatta tactacattt ttctacatcc tttgttttag 60
ggtgttgatt gcctttgctc agtatttttc aaaactgaaa aactcatata ttcagtattt 120
tactcccaca gcacctcccc ccaatttgac ccacagggac ccccatccag gtgcagggtc 180
ctcgcctgtg tacagggcac acctttggtc actccaaatt cccagagctc ccagggtcct 240
tctcagggtc tccacctgga tg 262
- 一种用于检测BRCA1基因长片段拷贝数变异的试剂盒
- 一种用于检测BRCA1和BRCA2基因大片段重组的引物组合、方法及试剂盒