一种用纳米磁珠提取新冠病毒RNA的试剂盒及提取方法

技术领域

本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种用纳米磁珠提取新冠病毒RNA的试剂盒及提取方法，一种简易便捷的使用硅羟基生物纳米磁珠手动提取以新冠病毒 Sars-Cov-2为主要目标的RNA病毒的核酸提取方法。

背景技术

由新型冠状RNA病毒Sars-Cov-2 引起的新冠肺炎covid-19因其强烈的传染性，在短期内迅速传播，使突发疫情大流行于全球多达上百个国家及地区，并被WHO（世界卫生组织）列为国际关注的突发公共卫生事件。因此快速检测感染状况并对疫情中的人员做隔离管理成为最为有效的方法之一。

目前新冠病毒的检测方法主要集中于检测核酸和抗体两个方面。核酸检测可用于检测出处于感染早期窗口中的患者是否携带病毒的相应序列。其针对病毒的核糖核酸RNA检测，具有灵敏度和特异性高，较为便捷安全等优点，是首选的检测标准。而抗体检测因为抗体需要在感染患病之后几天到两周的时间内逐渐产生特异性抗体，因此更多作为后续的检测筛查标准。

核酸是酸性的大分子物质，参与了遗传信息表达，蛋白质反应合成等众多生物反应，是检测领域中不可或缺的一类基本物质。现有的核酸提纯分离主要是为了将核酸（DNA/RNA）与蛋白质，多糖，盐类等其他杂质经过试验步骤分离，得到纯化后的核酸分子。在尽量保证其内在结构的完整性不被损坏的前提下，尽可能排除其他污染，同时放大产出。常用方法包括氯仿抽提法，过离心柱法以及磁珠法等。大都需要经过裂解，分离及提纯洗涤等诸个步骤。

其中，磁珠法作为相对新发展起来的核酸提取方法，通过对纳米微珠颗粒的表面进行优化和修饰后，将其制成具备超顺磁性的硅羟基纳米磁珠。通过其表面化学官能基团的作用，可以与核酸分子在不同条件（溶液盐分及pH值的变化调控等）下形成具备特异性的吸附与结合，保留想要得出的纯净核酸成品并以解除吸附的方式再度分离出来。此方法可以避免使用氯仿等有毒的有机溶剂，同时也简化了部分手工操作，使得实施方法及试剂制备变得相对简化，同时为仪器高通量的全自动化流程提供了新的可能，在疫情紧要关头节省更多宝贵的提取检测时间以便于后续针对性药物疫苗研究的发展。

但是鉴于技术的限制，目前尚未有使用纳米磁珠提取新冠病毒RNA的试剂盒。

发明内容

本发明目的在于提供一种用纳米磁珠提取新冠病毒RNA的试剂盒。

本发明的再一目的在于提供一种利用上述试剂盒的提取方法。

一方面，本发明提供了一种用生物纳米磁珠法提取病毒RNA的试剂盒，包括溶液Ⅰ、溶液Ⅱ、溶液Ⅲ、羟基纳米磁珠悬浮液；其中：

所述的溶液Ⅰ含有50mmol/L～100mmol/L的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐Tris-Cl、5mmol/L～20mmol/L的乙二胺四乙酸EDTA、1%～3.5%的聚乙二醇辛基苯基醚Triton X-100、0.1%～1.5%的十二烷基硫酸钠SDS以及200mmol/L～300mmol/L的氯化钠；

较好的，所述的溶液Ⅱ含有10mmol/L～100mmol/L的Tris-Cl和5mmol/L～10mmol/L的EDTA；

较好的，所述的溶液Ⅲ含有75%乙醇或者无水乙醇。其中，所述溶液Ⅲ中的75%乙醇可在一些条件下用无水乙醇替代，在加入溶液Ⅲ洗涤的步骤中，乙醇与磁珠悬浮混合溶液的体积比应为2:1。

所述的羟基纳米磁珠悬浮液中采用生物纳米磁珠硅羟基超顺磁性纳米磁珠和四氧化三铁磁核，粒径范围为0.5-2.0 μm。较好的，粒径的范围为0.5-1.0 μm, 更好的，粒径的平均粒径为0.5，0.8，1.0，1.3，1.5，2.0 μm。

较好的，所述的生物纳米磁珠硅羟基超顺磁性纳米磁珠和四氧化三铁磁核储存于NaCl缓冲溶液中。

较好的，所述的试剂盒还含有和搭配磁珠使用的磁力装置。在上述方案基础上，所描述的磁力装置为简易磁力架，用来放置样本与磁珠结合的缓冲溶液，辅助吸附分离清洗等过程。

较好的，所述的Tris-Cl, EDTA溶剂pH值为7.2-7.5。例如，pH值为7.3或者7.4，均可。

较好的，所述的试剂盒还含有蛋白酶K或者carrier RNA。加入蛋白酶K或者carrier RNA能够提高核酸提取的效率，减少杂质。例如，可以使用上海翊圣公司的蛋白酶K或者carrier RNA。

较好的，所述的试剂盒还含有去离子水。去离子水可以用于调节试剂的浓度、清洗等。更好的，本发明的试剂盒中使用的去离子水经过灭菌并且封装，便于使用和体积的确定。

具体而言，本发明可以通过下述方案实现：一种用生物纳米磁珠法提取新冠病毒RNA的试剂盒，该试剂盒包括溶液Ⅰ、溶液Ⅱ、溶液Ⅲ、溶液Ⅳ和GUI羟基纳米磁珠悬浮液和搭配磁珠使用的磁力装置：

所述的溶液Ⅰ：由50mmol/L～100mmol/L的Tris-Cl（三羟甲基氨基甲烷盐酸盐）,5mmol/L～20mmol/L的EDTA（乙二胺四乙酸）,1%～3.5%的Triton X-100（聚乙二醇辛基苯基醚）,0.1%～1.5%的SDS（十二烷基硫酸钠），200mmol/L～300mmol/L的NaCl（氯化钠）组成；

所述的溶液Ⅱ：由10mmol/L～100mmol/L的Tris-Cl，5mmol/L～10mmol/L的EDTA组成；

所述的溶液Ⅲ：由75%乙醇组成；

所述的溶液Ⅳ：去离子水；

GUI羟基生物纳米磁珠为硅羟基超顺磁性纳米磁珠，四氧化三铁磁核，平均粒径1μm，储存于NaCl缓冲溶液中；

其中，所述的Tris-Cl, EDTA溶剂pH值为7.4。

另一方面，本发明还提供了所述的试剂盒的应用，使用该试剂盒提取新冠病毒RNA。

本发明提供一种用生物纳米磁珠法提取新冠病毒RNA的方法，包含以下步骤：

（1）将起裂解作用的溶液Ⅰ与蛋白酶K，carrier RNA和硅羟基纳米磁珠悬浮液混合病毒样品并反应，在加热并得到充分裂解之后使磁珠与核酸吸附结合；

（2）使用溶液Ⅱ、Ⅲ清洗混合吸附溶液，分离需要洗脱的蛋白，多糖杂质；

（3）使用溶液Ⅳ清洗并使核酸脱离吸附，得到纯化后的样品。

本发明提供一种用生物纳米磁珠法提取新冠病毒RNA的方法，包含以下步骤：

（1）在1.5ml离心管中加入20-200μL的含新冠病毒样本以及100-500μL的溶液Ⅰ，20-100μL蛋白酶K，1-5μ的Lcarrier RNA和10-30μL硅羟基纳米磁珠悬浮液，置于55-60℃温浴加热10分钟；

（2）将试管静置于磁力架上，放置2-3分钟，待磁珠与核酸吸附，加入250-500μL溶液Ⅱ，充分混匀，吸弃上清；

（3）加入250-500μL溶液Ⅲ，轻微震荡混匀，静置于磁力架上2-3分钟，吸弃上清；

（4）加入溶液Ⅲ，并重复上述步骤；

（5）加入溶液Ⅳ，混匀并简易离心一下，放于55-60℃温浴5-10分钟，再置于磁力架上，静置2-3分钟，吸取溶液，遗弃磁珠，将成品妥善储存并注意病毒实验收尾的灭菌等卫生安全防范。

在上述方案基础上，上述纳米磁珠悬浮液的浓度为25mg/ml。

搭配使用简易磁力设备包括小型磁力架，以促使磁珠与液体吸附悬浮。

本发明的裂解液含有：Tris-Cl的缓冲体系可以为破膜后较为脆弱的核酸基础结构提供一个稳定的溶液环境，以确保成品核酸的纯度及完整性；EDTA为二价离子螯合剂，螯合二价金属阳离子如Mg

本发明包含的试剂均为常规条件下可以购买、制备并储存的化学试剂，无剧烈毒性会对人体形成危害或含有潜在泄露风险，包含纳米磁珠在内均易于运输，并储存于2-8°C的环境中；通过简易步骤可以大量提取新冠病毒病原中的RNA，可直接应用于下游的多种后续实验，包括但不限于PCR/q-RTPCR/LAMP/测序/构建文库等等，为攻克新冠疫情，检测感染状况并防止病毒传播提供一种有效的可行应用。

本发明提供一种用纳米磁珠提取新冠病毒rna的试剂盒及提取方法，该试剂盒包括包括溶液Ⅰ、溶液Ⅱ、溶液Ⅲ、溶液Ⅳ和GUI羟基纳米磁珠悬浮液和搭配磁珠使用的磁力装置。利用磁珠法操作简便且适用范围广的优点，用处理过的生物纳米磁珠在特定溶液环境中对核酸进行高特异性的吸附与结合，以便于裂解和分离蛋白质、多糖等生物大分子结构的杂质，从而提升结果核酸产物的产出及纯度。

具体实施方式

为了便于更深一步阐述本发明并助于理解，下面将结合实施例对本发明的实施方案进行更详细的描述。下列实施例仅用于说明本发明，而发明所描述涉及的范围并不应局限于所述的实施例。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本发明的实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购买获得的常规产品。

因直接使用新冠病毒进行研究对实验室安全级别及防卫措施具有极高要求，为遵守实验室安全法则，同时避免直接接触并研究新冠病毒所可能带来的人身安全隐患及传播风险，所有实施例均为使用该发明描述的纳米磁珠核酸提取试剂盒提取新冠病毒假病毒的RNA。

该假病毒购买自复百澳（苏州）生物科技有限公司，产品通用名称为：FNV-2019-nCOV-abII-EMN 假病毒。

产品介绍：该产品通过化学合成的方法获取2019新型冠状病毒（2019-nCoV）两部分ORF1a/b基因序列（覆盖CDC和WHO的核酸检测引物)、E Gene和N Gene编码区序列，并克隆构建至逆转录病毒载体，在293T细胞内进行假病毒的制备，通过层析柱纯化和超速离心浓缩。所获得的假病毒为逆转录病毒外膜包裹部分ORF1a/b基因序列、E Gene和N Gene编码区序列。可以用于病毒RNA核酸提取实验和QPCR检测实验的阳性对照产品。

该产品冻存于-20℃以下，有效期6个月。

假病毒融化：将产品从-20°C冰箱取出，置于冰上融化或4℃条件下自然融化，待其完全融化后可进行相关实验操作。

假病毒灭活：在生物安全柜中所需假病毒于EP离心管中，置于56℃条件下灭活30分钟。

批号 Lot.NO.20200415；

评价标准：E Gene, N Gene≤25CT；

拷贝数≥1.0*10

将一份1ml的假病毒样品按照产品要求从冰箱取出并于冰上解冻，浓度为10

取一份体积的假病毒样品，加入9倍体积的去离子水混匀进行系列稀释，重复稀释4次，将病毒拷贝浓度降至1.0*10

取20μL的稀释后的10

往离心管中加入250μL溶液Ⅱ（含10mmol/L的Tris-Cl,5mmol/L的EDTA），轻微震荡混匀，然后将离心管置于磁力架上，等待2分钟，吸弃上清液；

往离心管中加入150μL溶液Ⅲ， 轻微震荡混匀，在无菌无酶的超净台环境中打开瓶盖静置于磁力架上，等待2分钟，吸弃上清液；

往离心管中加入150μL溶液Ⅳ，混匀并简易离心一下，放于58°C温浴加热10分钟，再置于磁力架上，静置2-3分钟，吸取溶液，遗弃磁珠，妥善保存成品核酸。

本实施例结果采用minidrop简易分光光度仪测量OD值，即A260/A280,用以衡量核酸纯度，和成品得率浓度。

本发明仅仅是为针对最新爆发的新冠病毒核酸提取提供一个可行且安全便捷的实践思路；应该了解到本发明并不仅限于内容所描述的特定方法、方案和材料，这些均可在合理范围内以同类替代品进行同等的技术替换，发明中描述的特定实施例仅仅是为了更准确描述实验方式，而不应限发明范围。

FNV-2019-nCOV-abII-EMN 假病毒序列如下所示：

1.0RF1 a/b I 序列（SEQ ID NO 1）

ATCGTGTTGTCTGTACTGCCGTTGCCACATAGATCATCCAAA TCCTAAAGGATTTTGTGACTTAAAAGGTAAGTATGTACAAAT ACCTACAACTTGTGCTAATGACCCTGTGGGTTTTACACTTAA AAACACAGTCTGTACCGTCTGCGGTATGTGGAAAGGTTATGG CTGTAGTTGTGATCAACTCCGCGAACCCATGCTTCAGTCAGC TGATGCACAATCGTTTTTAAACGGGTTTGCGGTGTAAGTGCA GCCCGTCTTACACCGTGCGGCACAGGCACTAGTACTGATGTC GTATACAGGGCTTTTGACATCTACAATGATAAAGTAGCTGGT TTTGCTAAATTCCTAAAAACTAATTGTTGTCGCTTCCAAGAA AAGGACGAAGATGACAATTTAATTGATTCTTACTTTGTAGTT AAGAGACACACTTTCTCTAACTACCAACATGAAGAAACAATT TATAATTTACTTAAGGATTGTCCAGCTGTTGCTAAACAT

2.0RF1 a/b II 序列（SEQ ID NO 2）

GCGGCCGCTTGGCACAACATGTTAAAAACTGTTTATAGTGAT GTAGAAAACCCTCACCTTATGGGTTGGGATTATCCTAAATGT GATAGAGCCATGCCTAACATGCTTAGAATTATGGCCTCACTT GTTCTTGCTCGCAAACATACAACGTGTTGTAGCTTGTCACAC CGTTTCTATAGATTAGCTAATGAGTGTGCTCAAGTATTGAGT GAAATGGTCATGTGTGGCGGTTCACTATATGTTAAACCAGGT GGAACCTCATCAGGAGATGCCACAACTGCTTATGCTAATAGT GTTTTTAACATTTGTCAAGCTGTCACGGCCAATGTTAATGCA CTTTTATCTACTGATGGTAACAAAATTGCCGATAAGTATGTC CGCAATTTACAACACAGACTTTATGAGTGTCTCTATAGAAAT AGAGATGTTGACACAGACTTTGTGAATGAGTTTTACGCATAT TTGCGTAAACATTTCTCAATGATGATACTCTCTGACGATGCTGTTGGGATCC

3.M Gene（SEQ ID NO 3）

ATGGCAGATTCCAACGGTACTATTACCGTTGAAGAGCTTAAA

AAGCTCCTTGAACAATGGAACCTAGTAATAGGTTTCCTATTC

CTTACATGGATTTGTCTTCTACAATTTGCCTATGCCAACAGG

AATAGCTTTTTGTATATAATTAAGTTAATTTTCCTCTGGCTG

TTATGCCCAGTAACTTTAGCTTGTTTTGTGCTTGCTGCTGTT

TACAGAATAAATTGGATCACCGGTGGAATTGCTATCGCAATG

GCTTGTCTTGTAGGCTTGATGTGGCTCAGCTACTTCATTGCT

TCTTTCAGACTGTTTGCGCGTACGCGTTCCATGTGGTCATTC

AATCCAGAAACTAACATTCTTCTCAACGTGCCACTCCATGGC

ACTATTCTGACCAGACCGCTTCTAGAAAGTGAACTCGTAATC

GGAGCTGTGATCCTTCGTGGACATCTTCGTATTGCTGGACAC

CATCTAGGACGCTGTGACATCAAGGACCTGCCTAAAGAAATC

ACTGTTGCTACATCACGAACGCTTTCTTATTACAAATTGGGA

GCTTCGCAGCGTGTAGCAGGTGACTCAGGTTTTGCTGCATAC

AGTCGCTACAGGATTGGCAACTATAAATTAAACACAGACCAT

TCCAGTAGCAGTGACAATATTGCTTTGCTTGTACAGTAA

4.E Gene（SEQ ID NO 4）

ATGTACTCATTCGTTTCGGAAGAGACAGGTACGTTAATAGTT AATAGCGTACTTCTTTTTCTTGCTTTCGTGGTATTCTTGCTA GTTACACTAGCCATCCTTACTGCGCTTCGATTGTGTGCGTAC TGCTGCAATATTGTTAACGTGAGTCTTGTAAAACCTTCTTTT TACGTTTACTCTCGTGTTAAAAATCTGAATTCTTCTAGAGTT

CCTGATCTTCTGGTCTAA

5.N Gene（SEQ ID NO 5）

ATGTCTGATAATGGACCCCAAAATCAGCGAAATGCACCCCGC

ATTACGTTTGGTGGACCCTCAGATTCAACTGGCAGTAACCAG AATGGAGAACGCAGTGGGGCGCGATCAAAACAACGTCGGCCC CAAGGTTTACCCAATAATACTGCGTCTTGGTTCACCGCTCTC ACTCAACATGGCAAGGAAGACCTTAAATTCCCTCGAGGACAA GGCGTTCCAATTAACACCAATAGCAGTCCAGATGACCAAATT GGCTACTACCGAAGAGCTACCAGACGAATTCGTGGTGGTGAC GGTAAAATGAAAGATCTCAGTCCAAGATGGTATTTCTACTAC CTAGGAACTGGGCCAGAAGCTGGACTTCCCTATGGTGCTAAC AAAGACGGCATCATATGGGTTGCAACTGAGGGAGCCTTGAAT ACACCAAAAGATCACATTGGCACCCGCAATCCTGCTAACAAT

GCTGCAATCGTGCTACAACTTCCTCAAGGAACAACATTGCCA AAAGGCTTCTACGCAGAAGGGAGCAGAGGCGGCAGTCAAGCC TCTTCTCGTTCCTCATCACGTAGTCGCAACAGTTCAAGAAATTCAAC

TCCAGGCAGCAGTAGGGGAACTTCTCCTGCTAGAATG GCTGGCAATGGCGGTGATGCTGCTCTTGCTTTGCTGCTGCTT GACAGATTGAACCAGCTTGAGAGCAAAATGTCTGGTAAAGGC CAACAACAACAAGGCCAAACTGTCACTAAGAAATCTGCTGCT GAGGCTTCTAAGAAGCCTCGGCAAAAACGTACTGCCACTAAA GCATACAATGTAACACAAGCTTTCGGCAGACGTGGTCCAGAA CAAACCCAAGGAAATTTTGGGGACCAGGAACTAATCAGACAAGGAACTGATTACAAACATTGGCCGCAAATTGCACAATTTGCC CCCAGCGCTTCAGCGTTCTTCGGAATGTCGCGCATTGGCATG GAAGTCACACCTTCGGGAACGTGGTTGACCTACACAGGTGCC ATCAAATTGGATGACAAAGATCCAAATTTCAAAGATCAAGTC ATTTTGCTGAATAAGCATATTGACGCATACAAAACATTCCCA CCAACAGAGCCTAAAAAGGACAAAAAGAAGAAGGCTGATGAA ACTCAAGCCTTACCGCAGAGACAGAAGAAACAGCAAACTGTG ACTCTTCTTCCTGCTGCAGATTTGGATGATTTCTCCAAACAA TTGCAACAATCCATGAGCAGTGCTGACTCAACTCAGGCCTAA

以上所述，仅为本申请的具体实施方式，但本申请的保护范围并不局限于此，任何熟悉本领域技术的技术人员在本申请公开的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本申请的保护范围之内。因此，本申请的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 上海纳米技术及应用国家工程研究中心有限公司

<120> 一种用纳米磁珠提取新冠病毒RNA的试剂盒及提取方法

<130> 2020227

<160> 5

<170> PatentIn version 3.5

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<211> 501

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 人工序列

<400> 1

atcgtgttgt ctgtactgcc gttgccacat agatcatcca aatcctaaag gattttgtga 60

cttaaaaggt aagtatgtac aaatacctac aacttgtgct aatgaccctg tgggttttac 120

acttaaaaac acagtctgta ccgtctgcgg tatgtggaaa ggttatggct gtagttgtga 180

tcaactccgc gaacccatgc ttcagtcagc tgatgcacaa tcgtttttaa acgggtttgc 240

ggtgtaagtg cagcccgtct tacaccgtgc ggcacaggca ctagtactga tgtcgtatac 300

agggcttttg acatctacaa tgataaagta gctggttttg ctaaattcct aaaaactaat 360

tgttgtcgct tccaagaaaa ggacgaagat gacaatttaa ttgattctta ctttgtagtt 420

aagagacaca ctttctctaa ctaccaacat gaagaaacaa tttataattt acttaaggat 480

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<212> DNA

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<223> 人工序列

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gcggccgctt ggcacaacat gttaaaaact gtttatagtg atgtagaaaa ccctcacctt 60

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tcacttgttc ttgctcgcaa acatacaacg tgttgtagct tgtcacaccg tttctataga 180

ttagctaatg agtgtgctca agtattgagt gaaatggtca tgtgtggcgg ttcactatat 240

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atgatgatac tctctgacga tgctgttggg atcc 514

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<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 人工序列

<400> 3

atggcagatt ccaacggtac tattaccgtt gaagagctta aaaagctcct tgaacaatgg 60

aacctagtaa taggtttcct attccttaca tggatttgtc ttctacaatt tgcctatgcc 120

aacaggaata gctttttgta tataattaag ttaattttcc tctggctgtt atgcccagta 180

actttagctt gttttgtgct tgctgctgtt tacagaataa attggatcac cggtggaatt 240

gctatcgcaa tggcttgtct tgtaggcttg atgtggctca gctacttcat tgcttctttc 300

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aacgtgccac tccatggcac tattctgacc agaccgcttc tagaaagtga actcgtaatc 420

ggagctgtga tccttcgtgg acatcttcgt attgctggac accatctagg acgctgtgac 480

atcaaggacc tgcctaaaga aatcactgtt gctacatcac gaacgctttc ttattacaaa 540

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